Sarebbe abbastanza utile per l'allevamento di tratti tecnicamente difficili o costosi da determinare, come la resistenza alle malattie, il contenuto minerale. È una tecnica abbastanza semplice, economica e ad alta produttività. Per iniziare, posizionare quattro dischi foglia in ogni pozzo di una piastra PCR da 96 po '.
Aggiungere 50 millilitri di tampone A soluzione in ogni pozzo. Congelare la piastra in un congelatore Celsius meno 80 gradi per 10 minuti. Quindi, degelare il piatto a temperatura ambiente.
Incubare a 95 gradi Celsius per 10 minuti. Aggiungere 50 microlitri di tampone B ad ogni pozzo e mescolare bene con il vortice. Centrifugare la piastra per un minuto a 1.500 volte g.
Raccogli il supernatante come DNA per PCR. In primo luogo, utilizzare il supernatante DNA di un modello PCR per ottimizzare la temperatura di ricottura. Aggiungere reagenti e un microlitro di supernatante di DNA in ogni pozzo PCR.
Posizionare i tubi PCR in un blocco termico compatibile con gradiente e regolare il programma di riscaldamento in base al manoscritto per determinare la temperatura di ricottura ottimale per ogni frammento bersaglio. Eseguire l'elettroforesi per il prodotto PCR su gel di agarosio all'1% per esaminare gli ampliconi. Determinare la temperatura di ricottura ottimale che consente un'amplificazione specifica del frammento bersaglio.
Per eseguire l'analisi HRM, combinare reagenti, tra cui un microliter di colorante a fluorescenza 10 volte e un microliter del supernatante del DNA in ogni pozzo di piastre compatibili con HRM. In ogni piastra, includere un campione genitore di tipo selvatico e un controllo negativo senza DNA. Aggiungere una goccia di olio minerale ad ogni pozzo per evitare l'evaporazione.
Quindi, sigillare la piastra con pellicola adesiva e centrifugare a 1.000 volte g per un minuto. Eseguire la PCR utilizzando la temperatura di ricottura ottimizzata. Ora, rimuovere la pellicola adesiva dalla piastra e inserire la piastra in una macchina HRM.
Nel software selezionare Nuova esecuzione dal menu file oppure premere il pulsante Esegui nella parte superiore dello schermo. Specificare le temperature di inizio e di fine per la fusione da 55 a 95 gradi Celsius. Selezionare campioni per l'analisi di fusione ad alta risoluzione ed escludere campioni simili al controllo negativo.
Normalizzare le curve di fusione per avere la stessa fluorescenza iniziale e finale. Verificare visivamente che i cursori di temperatura minima e massima inferiore si trovano in una regione delle curve. Mantenere il delta F, differenza di fluorescenza, livello all'impostazione predefinita di 05.
Nell'elenco di selezione Standard selezionare la variante comune rispetto alla variante e scegliere la sensibilità normale. Selezionare H12 per utilizzare il tipo jolly come controllo. Si ritiene che i campioni con un valore delta F maggiore di 05 contengano piante mutanti.
Quindi, usando un metodo CTAB, estrarre il DNA da ciascuna delle quattro piante dalla piscina mutante con la curva di fusione significativamente diversa dal tipo selvaggio. Dopo la quantificazione utilizzando uno spettrofotometro, regolare il DNA con il NanoDrop 2000 ad una concentrazione finale di circa 25 nanogrammi per microlitro. Aggiungere 0,4 microlitri di primer PCR nel campione di DNA nei tubi PCR, posizionarli in un ciclore termico e regolare il programma per amplificare il frammento bersaglio.
Quindi, invia i prodotti PCR a un'azienda per il sequenziamento. Dopo il sequenziamento di Sanger, confrontare la lesione molecolare confrontando le sequenze tra la pianta M2 e il tipo selvaggio. In questo studio, la scansione hrm e l'analisi delle piantine M2 per mutazioni nei geni OsLCT1 o SPDT hanno mostrato che la maggior parte dei campioni aveva curve di fusione non significativamente diverse dal tipo selvaggio con delta F inferiore a 05.
I mutanti hanno mostrato curve HRM significativamente diverse con delta Fs superiori a 05 a temperature da 90 a 92 gradi Celsius e da 81,5 a 83,5 gradi Celsius, rispettivamente. Il tipo di mutazione e la posizione sui geni di 4.560 piantine M2 sono stati confermati dai cromatogrammi di sequenziamento. È stato identificato un sito eterozigote con una mutazione da G ad A a 4.304 coppie di basi di OsLCT1.
Un singolo inserimento nucleotidico A apparve alle 4.240 coppie di basi di OsLCT1, e fu osservata una cancellazione ttc trinucleotide nella posizione da 5.948 a 5.950 coppie di basi di SPDT. Ottimizzere il PCR prima dell'analisi HRM. Il colorante nel gel è un po 'dannoso.
Ricorda di indossare i guanti quando corri il gel.
