Questo metodo si basa su protocolli di raggiungimento consolidati e qualificati per i ratti per automatizzare l'allenamento e i test fornendo un mezzo efficiente per acquisire set di dati di grandi dimensioni relativamente rapidamente. Riduce al minimo lo sforzo dello sperimentatore consentendo al contempo la ricostruzione tridimensionale della cinematica dell'ammalo. La cinematica può essere utilizzata per valutare gli effetti di interventi a tempo preciso o correlati con registrazioni fisiologiche.
Con alcune regolazioni, questa tecnica può essere applicata anche nei topi. Inizia accendendo le luci e posiziona il topo in un'abile camera di raggiungimento. Utilizzare le forcep per tenere un pellet attraverso lo slot di raggiungimento nella parte anteriore della scatola.
Lasciare che il topo mangi tre pellet dalle forcep. Tirare indietro il pellet la prossima volta che il topo cerca di mangiare il pellet dalle forcep e ripetere fino a quando il topo raggiunge il pellet con una zampa il massimo su 11 raggiunge indicando la preferenza della zampa. Quindi, allineare l'asta di consegna del pellet con il lato della fessura di raggiungimento contralaterale alla zampa preferita del topo.
Posizionare un pellet sull'asta di consegna. Quindi utilizzare le forcep per escare il topo con il pellet ma dirigere il topo verso l'asta di consegna in modo che la sua zampa colpisca il pellet sull'asta. Dopo che il topo ha tentato 10 raggiunge l'asta di consegna senza essere esca, avanzare il topo alla fase successiva.
Quindi, posizionare l'asta di consegna del pellet in base alla preferenza della zampa del topo e impostarla per posizionarla in due. Impostare la posizione di altezza dell'asta di consegna del pellet utilizzando il telecomando dell'attuatore. Una volta che l'asta di consegna è all'altezza corretta, tenere premuto il numero desiderato fino a quando la luce lampeggia in rosso per impostare.
Quindi posizionare il topo nella camera e adescare il topo sul retro con un pellet. Quando il ratto si muove abbastanza lontano sul retro della camera da rompere il fascio infrarosso se la versione automatizzata fosse in funzione, spostare l'asta di consegna del pellet in posizione tre. Infine, attendere che il topo raggiunga il pellet e quindi spostare l'asta di consegna del pellet di nuovo in posizione due.
Posizionare un nuovo pellet sull'asta di consegna se eliminato. Ripetere questi passaggi adescando gradualmente il topo sempre meno fino a quando il topo inizia a uno, spostarsi sul retro per richiedere un pellet senza essere esca e due, spostarsi immediatamente nella parte anteriore dopo aver richiesto un pellet nella parte posteriore. Dopo che il topo lo ha fatto 10 volte, inizia ad allenarsi sul compito automatizzato.
Per impostare il sistema automatizzato, accendere le luci nella camera e riempire il serbatoio del pellet. Posizionare l'asta di consegna del pellet in base alle preferenze della zampa del topo. Verificare che le posizioni dell'attuatore siano impostate correttamente.
Quindi, accendi il computer e apri il programma di raggiungimento qualificato. Immettere il numero ID ratto sotto il soggetto e selezionare la preferenza della zampa dal menu a discesa della mano. Specificare il percorso di salvataggio per i video.
Quindi imposta il tempo di sessione e il numero di video max. Impostare anche la durata del sollevamento del pellet e abilitare la penalità di copertura anticipata. Quindi, per scattare immagini di calibrazione, posizionare la mano all'interno della camera di raggiungimento e colpire la clip di alligatore attraverso lo slot di raggiungimento.
Tenere il cubo davanti allo slot di raggiungimento con la clip di alligatore. Quindi posizionare il cubo in modo che il lato rosso appaia nello specchio superiore, il lato verde nello specchio sinistro e il lato blu nello specchio destro. Nel programma comportamentale, assicurarsi che la soglia del ROI sia impostata su un valore molto grande.
Fare clic sul pulsante esegui e, una volta che il pulsante inizializzato della fotocamera diventa verde, premere start per iniziare l'acquisizione video. Fare clic su Modalità Cal e quindi su Scatta immagine cal. Spostare leggermente il cubo e scattare un'altra immagine.
Ripetere di nuovo per un totale di tre immagini. Infine, interrompere il programma facendo clic su Interrompi e quindi sul pulsante interrompi segno. Rimuovere la mano e il cubo dalla scatola.
Fare attenzione a non urtare nulla nella camera comportamentale dopo che le immagini di calibrazione sono state scattate quel giorno. In primo luogo, posizionare il topo nella camera di raggiungimento competente. Fare clic sulla freccia bianca per eseguire il programma.
Quindi imposta la posizione del ROI per il rilevamento dei pedoni regolando l'offset x, l'offset y, la larghezza del ROI e l'altezza del ROI. Posizionare il ROI nello specchio laterale che mostra il dorsum della zampa direttamente davanti allo slot di raggiungimento e fare clic sull'inizio per iniziare il programma. Anche se il ratto non raggiunge, regolare il valore di soglia del ROI basso fino a quando il valore del trigger del ROI vivo oscilla tra zero e uno.
Quindi imposta la soglia del ROI in modo che sia significativamente maggiore del valore del trigger del ROI vivo durante i pokes del naso e inferiore al valore del trigger del ROI vivo quando il topo raggiunge. Regola fino a quando i video non vengono attivati costantemente quando il topo raggiunge ma non quando spunta il naso attraverso lo slot. Monitora le prime prove per assicurarti che tutto funzioni correttamente.
Quando un topo raggiunge prima di richiedere un pellet, osservare che i primi raggiunge l'aumento del numero. Quando un topo raggiunge dopo aver richiesto un pellet, osserva aumentare il numero di video mentre una copia del video viene salvata come file bin. Infine, dopo aver raggiunto il tempo di sessione o il numero massimo di video, premere il pulsante del segnale di arresto.
I risultati indicano che dopo 20 giorni, i ratti acquisiscono il compito di raggiungere l'abile. Qui vengono visualizzate le traiettorie di copertura di una singola sessione. Questo rappresenta solo l'avanzamento iniziale della zampa per facilitare la presentazione.
Inoltre, se il trigger di rilevamento delle zampe non è impostato con precisione, c'è una significativa variabilità nel telaio in cui la zampa viola la fessura di raggiungimento che può portare alla variabilità quando gli interventi vengono attivati durante i movimenti di raggiungimento. Oltre a un'attenta manipolazione degli animali, non saranno prese precauzioni in questo protocollo. È molto importante impostare correttamente la soglia del ROI in modo che i video o altri interventi siano attivati nei momenti appropriati.
Questo metodo può essere abbinato a diverse altre tecniche come l'optogenetica, l'imaging del calcio e i modelli genetici che possono affrontare questioni che vanno dal controllo motorio di base alla fisiopatologia del disturbo del movimento. Questa tecnica consente la correlazione della cinematica dettagliata di portata e comprensione con registrazioni o interventi fisiologici che consentono ai ricercatori di rispondere non solo se ma a come cambiano i movimenti con i cambiamenti dei circuiti neurali.
