La coltura di fibroblasti nel tessuto tumorale dello sferoide ricapitola molto meglio del sistema 2D comunemente usato sulla plastica rigida. Permette di studiare la differenziazione dei fibroblasti in un ambiente simile a un tumore. In questo metodo, la rigidità del lavoro plastico di coltura cellulare non influenza artefatticamente la differenziazione dei fibroblasti.
Invece, l'influenza dell'interazione della matrice cellulare sulla differenziazione dei fibroblasti indotta dal tumore può essere analizzata in vitro. Per iniziare questa procedura, ottenere il supporto di coltura cellulare, che è MEM integrato con FBS inattivato al calore dell'1% e streptomicina penicillina all'1%.. Inoltre, ottenere una soluzione di metilcellulosa di sei milligrammi per millilitro.
Mescolare una parte della metilcellulosa con tre parti del terreno di coltura cellulare per preparare la soluzione di formazione dello sferoide. Resuspend i fibroblasti normali immortalati appena scongelati o altri tipi di cellule elencati nel protocollo di testo nella soluzione di formazione degli sferoidi. Se nello studio sono incluse citochine o inibitori dell'integrina, aggiungere questi composti alla sospensione cellulare per inimbarli negli sferoidi durante la loro formazione.
Se del caso, aggiungere composti inibitori insieme a 10 nanogrammi per millilitro di TGF beta uno per innescare la differenziazione nei fibroblasti normali immortalati. Distribuire 100 microlitri della soluzione di formazione dello sferoide in ogni pozza di una piastra multi-pozzo bottom 96 rotonda. Pipettare la soluzione in ogni pozzo su e giù più volte per mescolare.
Quindi, incubare la piastra nell'incubatore di coltura cellulare a 37 gradi celsius con anidride carbonica del 5% per 24 ore per consentire la formazione di uno sferoide in ogni pozzo. In primo luogo, tagliare l'estremità di una punta della pipetta per ingrandire l'orifizio. Al termine dell'incubazione, utilizzare questa pipetta tagliata per raccogliere gli sferoidi in un tubo di reazione da 1,5 millilitri per condizione sperimentale o per proteina da analizzare.
Centrifugare gli sferoidi a 1000 volte G per circa 30-60 secondi. Rimuovere con cura la metilcellulosa contenente supernatante pipettando assicurandosi di non disturbare gli sferoidi pellettati. Particolare attenzione deve essere presa quando si trasferiscono gli sferoidi ai tubi di reazione.
Assicurati di non avere forze di deriva delle cesoie tagliando la punta. È anche importante raccogliere tutti gli sferoidi. Durante la fase di lavaggio, assicurarsi di non perdere gli sferoidi per aspirazione.
Per lavare gli sferoidi aggiungere 50 microlitri di un X PBS. Centrifuga a 1000 volte G per 30-60 secondi. Quindi rimuovere con cura il PBS pipettando.
A seconda della proteina da macchiare, fissare gli sferoidi con 50 microlitri di paraformaldeide e PBS per 20 minuti a temperatura ambiente. Lavare gli sferoidi con PBS come descritto in precedenza. Permeabilizzare le cellule con 0,1%tritone X e PBS per quattro minuti a temperatura ambiente.
Quindi, lavare gli sferoidi in PBS tre volte come descritto in precedenza. Aggiungere PBS contenente 5%FBS e 2%BSA agli sferoidi e incubare a temperatura ambiente per un'ora per bloccare siti di interazione proteica non specifici. Ora, incubare gli sferoidi con 30 microlitri di anticorpi primari e PBS con 2,5% FBS e 1%BSA a quattro gradi celsius durante la notte.
Il giorno dopo, lavare gli sferoidi in PBS tre volte come descritto in precedenza. Successivamente, incubare gli sferoidi con 30 microlitri di anticorpi secondari e PBS con 2,5%FBS e 1%BSA a temperatura ambiente per 90 minuti. Lavare gli sferoidi in PBS tre volte come descritto in precedenza.
Successivamente, incubare le cellule con 30 microlitri di soluzione di colorazione Dappy per quattro minuti a temperatura ambiente. Lavare gli sferoidi in PBS una volta come descritto in precedenza. Utilizzando una pipetta Pasteur in vetro, posizionare gli sferoidi su uno scivolo di vetro e una goccia di PBS.
Utilizzare un microscopio a scansione laser per immagini gli sferoidi mediante microscopia a fluorescenza con un ingrandimento di 10 volte. Prendi diverse sezioni trasversali ottiche dello sferoide in diverse pianure ottiche della pila Z. Un'immagine rappresentativa della colorazione immunofluorescente degli omo sferoidi dei normali fibroblasti pancreatici rispetto agli omo sferoidi dei fibroblasti associati al cancro immortalato mostra un segnale maggiore per la subunità alfa tre nelle cellule differenziate.
Il segnale di fluorescenza delle cellule nello sferoide viene quindi quantificato con le immagini della pila Z dello sferoide 3D e i livelli trascrizionale del gene della subunità alfa tre integrina sono determinati da qPCR. Tutti questi risultati dimostrano che l'integrina alfa tre è upregolata nei fibroblasti associati al cancro immortalato rispetto alla controparte normale. Ciò dimostra che l'integrina alfa tre beta uno può essere considerato un marcatore per la differenziazione dei fibroblasti pancreatici.
Questo metodo è ideale per capitolare l'auto tissue generalmente presente negli organi e nelle masse tumorali in cui la rigidità extra della matrice cellulare determina il destino cellulare. La coltura degli sferoidi è un modello versatile che può essere combinato con altri saggi analitici dopo la dissociazione sferoide come la quantità di PCR in tempo reale e la citometria completa. La paraformaldeide utilizzata per la fissazione degli sferoidi è un agente chimico pericoloso.
Guanti e usura degli occhi devono essere indossati per la protezione.
