Come già sappiamo, il microambiente tumorale è una parte essenziale della crescita e dell'invasione del cancro. Per imitare la progressione del carcinoma, abbiamo bisogno di una matrice tumorale umana biologicamente rilevante. Questa è l'unica matrice tumorale umana basata sul test di invasione in vitro.
Rispetto al classico saggio sferoide, questo metodo non è così sensibile alla temperatura e non richiede il trasferimento dello sferoide. Questa tecnica è adatta per campioni di cancro solido derivati dal paziente come il carcinoma della testa e del collo e può estendersi verso la medicina personalizzata, comprese le terapie di chemoradiazione. Questa matrice a base di tumore umano è già stata utilizzata per diverse applicazioni tra cui test farmacologici ad alta produttività, analisi delle cellule vive, guarigione delle ferite e test di trasferimento.
Il passaggio tecnicamente più sensibile è la gestione del fibrinogeno da parte del metodo, quindi potresti voler prima praticare questo passaggio con pozzi vuoti. È importante mostrare la corretta gestione della matrice ed è facile da analizzare mostrando visivamente il metodo. Per la generazione di sferoidi tumorali multicellulari, erogare una volta 10 alle terze cellule dalla linea cellulare di interesse in 50 microlitri di mezzo completo in ogni pozzo di una piastra rotonda-inferiore ad attacco ultra-bassa da 96 po '.
Quindi posizionare la piastra in un incubatore di coltura cellulare di 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per quattro giorni prima di confermare visivamente la formazione di sferoidi tumorali con un microscopio invertito. Per impostare un saggio di invasione sferoide tridimensionale, scongelare la matrice derivata dal mioma umano sul ghiaccio e scongelare la soluzione di stock di fibrinogeno in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius. Quando i reagenti si sono riscaldati, mescolare i volumi appropriati di matrice completa derivata dal mioma, trombina, aprotinina e fibrinogeno, aggiungendo il fibrinogeno poco prima di erogare la miscela matriciale nelle cellule.
Aggiungere immediatamente 50 microlitri del gel risultante in ogni pozzo della piastra di coltura dello sferoide, dirigendo la punta verso la parete interna di ogni pozzo e rallentando senza spostare lo sferoide dal centro del pozzo. Poiché il fibrinogeno inizia a gelare dopo pochi minuti, richiede una pipettazione inversa robusta ma precisa e il trattamento di pochi pozzi alla volta. Riportare la piastra all'incubatore di coltura cellulare per 30 minuti per consentire al gel di fibrina a matrice derivata dal mioma umano di solidificarsi prima di aggiungere delicatamente 100 microlitri di mezzo completo alla parte superiore di ogni gel.
Quindi immagini l'invasione degli sferoi ogni giorno. Per la segmentazione delle immagini con ilastik, aprire il software open source per la classificazione e la segmentazione delle immagini e selezionare Flusso di lavoro Classificazione pixel. Salvare il progetto ilastik nel computer.
I pixel verranno classificati in base alle annotazioni effettuate dall'utente. Fate clic su Dati di input (Input Data) e Aggiungi nuovo (Add New) per selezionare le immagini per l'analisi. Per la selezione delle feature, fate clic su Selezione feature (Feature Selection) e Selezionate feature (Select Features).
Fare clic sulle caselle appropriate per selezionare le feature di interesse. Le caselle selezionate diverranno verdi. Per un training, fare clic su Allenamento.
Nella sezione Formazione dovrebbero essere presente due etichette, Etichetta 1 ed Etichetta 2. Contrassegnare lo sfondo con una delle etichette e contrassegnare le celle con l'altra etichetta. Dopo aver etichettato tutte le celle e lo sfondo all'interno della prima immagine, selezionare l'immagine successiva dalla visualizzazione corrente per continuare a contrassegnare le celle e lo sfondo fino a quando il 10% delle immagini non è stato contrassegnato.
Quindi seleziona Live Update per analizzare tutte le immagini. Una volta completato il training e ilastik ha analizzato tutte le immagini, fare clic su Esportazione previsione e selezionare Segmentazione semplice dall'origine. Selezionare quindi il formato di file di output desiderato da Scegliere Esporta impostazioni immagine e fare clic su Esporta tutto per esportare i risultati dell'etichettatura.
I file verranno esportati nella stessa cartella con le immagini originali. Per l'analisi dell'area, apri prima l'immagine originale con una barra di scala in Fiji ImageJ, facendo attenzione che l'immagine abbia le stesse dimensioni e dimensioni delle immagini analizzate. Utilizzate lo strumento di selezione delle linee per disegnare una linea di lunghezza nota e fate clic su Analizza (Analyze) e imposta scala (Set Scale).
Quindi impostare la distanza nota nel campo Distanza nota. Impostare l'unità corretta e fare clic su Globale. Per installare il plug-in ilastik, fare clic su Guida e aggiornamento e quindi su Gestisci siti di aggiornamento nella finestra Updater ImageJ.
Fare clic accanto a ilastik, Chiudi e Applica modifiche. Dopo alcuni minuti, apparirà una finestra di informazioni che dice aggiornato correttamente. Fare clic su OK e riavviare ImageJ.
Fare quindi clic su Plug-in, macro e installare e selezionare il contatore. file ijm. Quindi fare clic su Apri.
Per completare l'analisi dell'area, fate clic su Plugin e scorrete per selezionare ilastik. Selezionare Importa HDF5 e selezionare il file con il formato h5. Fare clic su Apri e carica e applicare la tabella di ricerca.
Quindi fare clic sul pulsante A sulla tastiera e l'area verrà visualizzata nella finestra di riepilogo come area totale. In questo esperimento rappresentativo, quattro giorni dopo la semina della linea cellulare del carcinoma a cellule squamose laringali metastatiche, la matrice è stata aggiunta agli sferoidi formati come dimostrato e l'invasione è stata monitorata quotidianamente su un microscopio invertito. Una volta incorporate, le cellule nella matrice fibrina derivata dal mioma umano iniziarono ad invadere rapidamente dopo un giorno e si estesero nella matrice nei due giorni successivi.
Le cellule nella matrice derivata dal sarcoma del topo non hanno invaso la matrice circostante, formando invece una struttura asimmetrica. Le cellule del collagene hanno invaso leggermente ma a causa del restringimento della matrice l'analisi è diventata difficile. In alcuni pozzi, gli sferoidi scomparvero anche dopo tre giorni.
Qui, viene mostrata la quantificazione dell'invasione di una cellula squamosa laringale primaria e metastatica nella matrice di fibrina derivata dal mioma umano. L'analisi delle cellule vive dell'invasione sferoide della matrice di fibrina derivata dal mioma umano rivela il movimento cellulare nei filamenti in tutta la matrice che è seguito da altre cellule nel tempo. Ricordarsi di fare attenzione a non spostare lo sferoide dalla posizione centrale quando si aggiunge la matrice ai pozzi.
Questa procedura può essere utilizzata per studiare come l'irradiazione e molecole specifiche come i farmaci antitumorali influenzano l'invasione. Le celle possono essere fissate e macchiate per studi successivi. Nel classico modello sarcoma del topo, le cellule proliferano principalmente e l'aspetto dell'invasione è minimo.
Questa matrice umana basata sul tumore induce l'invasione, rendendo gli studi di inibizione più efficienti.
