Le colture cellulari bidimensionali non imitano adeguatamente la crescita tumorale in vivo. Per migliorare, le procedure 3D sono state sviluppate utilizzando sferoidi. Il nostro test 3D a base di glioblastoma sferoide è particolarmente adatto per indagare l'invasione del tumore al cervello nell'ambiente tumorale cerebrale sano.
I modelli di coltura tridimensionale possono essere utilizzati per ricapitolare un'architettura multicellulare, l'eterogeneità e lo stato metabolico dei tumori consentendo una valutazione più rigorosa degli effetti farmacologici. Assicurati di non toccare il fondo del pozzo o di rimuovere completamente il supernatante, di mantenere il gel sul ghiaccio e di aggiungere rapidamente le cellule al gel. Per generare sferoidi tumorali di dimensioni uniformi, lavare prima la coltura cellulare tumorale di interesse con cinque millilitri di PBS e trattare le cellule con 0,5 a un millilitro di enzima dissociazione.
Dopo cinque minuti a 37 gradi Celsius, interrompere la reazione con quattro-4,5 millilitri di PBS e trasferire le cellule staccate in un tubo conico da 15 millilitri contenente 10 millilitri di mezzo di crescita completo. Dopo il conteggio, rimorsi le cellule a una volta 10 alla sesta cella per otto millilitri di mezzo di crescita completo integrato con due millilitri di concentrazione di metilcellulosa al 2% e trasferire la sospensione in un contenitore di sistema sterile. Quindi aggiungere 100 microlitri di cellule a ciascun pozzo di una piastra inferiore rotonda da 96 po 'e posizionare la piastra in un incubatore di anidride carbonica del 5% di 37 gradi Celsius per tre o quattro giorni.
Per eseguire un saggio di invasione, quando le cellule tumorali hanno formato sferoidi di dimensioni uniformi, trasferire ogni struttura cellulare in un tubo di 500 microlitri e lavare gli sferoidi una volta con 200 microlitri di PBS. Dopo il secondo lavaggio, trasferire accuratamente gli sferoidi in 100 microlitri di matrice di collagene preparata al momento e aggiungere ogni sospensione sferoide al centro di ogni pozzo di una piastra piatta a 96 poggiasaggio. Dopo un'incubazione di 30 minuti a 37 gradi Celsius, aggiungere 100 microlitri di mezzo di crescita completo sopra il gel in ogni pozzo.
Assicurati di posizionare tutti gli sferoidi al centro di ogni pozzo per la migliore imaging dell'invasione delle cellule tumorali. Per eseguire un saggio di migrazione, quando le cellule tumorali si sono formate sferoidi di dimensioni uniformi, rivestire una piastra a sei pozzetti con 0,2 milligrammi per millilitro di Matrigel nel mezzo di crescita per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Alla fine dell'incubazione, rimuovere il Matrigel e aggiungere due millilitri di mezzo di crescita completo ad ogni pozzo.
Trasferire gli sferoidi dalla piastra inferiore rotonda in 50 volumi di microliter in singoli pozzi della piastra a sei pozzetti e posizionare la piastra nell'incubatore di coltura cellulare per 24 ore. Il giorno dopo, macchiare gli sferoidi con 10 nanogrammi per millilitro di Hoechst per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Per l'acquisizione di immagini dopo un test di invasione o migrazione, posizionare la lastra sul palco di un microscopio confocale Brightfield dotato di una videocamera e ottenere immagini durante l'appropriato periodo sperimentale.
Per analizzare le immagini in modo semi-automatizzato, importare le immagini nelle Fiji e fare clic su Plugin, Macro, Interprete interattivo. Copiare e incollare il ciclo viola adattato. Mantieni le frasi viola e aggiungi le frasi verdi di interesse se necessario.
Quindi, per misurare l'area di ogni sferoide, fare clic su Analizza e misura. Per misurare l'ipossia in aree distinte della struttura sferica, la colorazione carbonica anidrasi IX può essere usata per determinare l'attività ipossica. In questa analisi rappresentativa, nel centro dello sferoide sono state osservate cellule positive più carboniche dell'anidrasi IX.
Le cellule ipossiche situate nel nucleo dello sferoide tendono ad essere più glicolitiche delle cellule che circondano il nucleo. I mitocondri possono essere immagini mediante microscopia elettronica per ulteriori analisi. Il diametro dello sferoide è direttamente correlato alla densità delle cellule che compongono la struttura cellulare 3D e le macro delle Fiji possono essere utilizzate per quantificare la proliferazione, l'invasione o la migrazione delle cellule all'interno di ogni sferoide o migrazione delle cellule all'interno di ogni sferoide.
Gli aumenti del nucleo dello sferoide riflettono la stimolazione della proliferazione cellulare. Dopo l'inibizione del complesso I della catena respiratoria mitocondriale, la stragrande maggioranza della produzione di ATP nei mitocondri è compromessa riducendo la proliferazione del 20% dopo 72 ore. Il trattamento con cloruro di idrogeno migliora l'invasione del collagene di tipo I per un periodo di 24 ore, ma riduce l'area migratoria degli sferoidi di 1,5 volte rispetto agli sferoidi non trattati.
Come valutato dall'imaging dal vivo, gli sferoidi dimostrano un'alta dinamica interna e si muovono rapidamente. La dimensione degli sferoidi dovrebbe essere relativamente uniforme e si dovrebbe fare attenzione a manipolare gli sferoidi al centro dei pozzi per ottenere i migliori risultati di imaging. Questo metodo può anche essere utilizzato per indagare la proliferazione, la migrazione e la morte delle cellule tumorali, nonché l'espressione di matrice extracellulare, recettori cellulari o proteine intracellulari di interesse.
Anche gli sferoidi possono essere incapsulati e l'effetto dell'aumento della tensione superficiale cellulare può essere studiato al momento della rimozione delle capsule.
