Quindi le culture della mammut forniscono un sistema motorio facilmente accessibile per studiare e sezionare aspetti importanti del normale nei comportamenti delle cellule staminali mammari del cancro, inclusa la loro capacità di rinnovarsi e differenziarsi. Il nostro approccio quantitativo mira alla valutazione del tasso di crescita delle colture mammosfera in modo oggettivo, consentendo un confronto diretto dei diversi tipi e condizioni cellulari. Per il primo studio, consiglierei di mantenere uno stretto controllo sui tempi di incubazione per evitare la digestione e garantire un conteggio accurato delle cellule prima di ogni placcatura.
A dimostrare la procedura con Charolaise Bull sarà Errico D'Elia, tecnico del mio laboratorio. Dopo aver raccolto le quattro ghiandole mammose toraciche addominali e inferiori da 5 a 30, topi femmine di 8-10 settimane, posizionare fino a 20 ghiandole per piastra di Petri da 100 millimetri in un volume minimo di DPBS. Tritare i tessuti in pezzi più piccoli e aggiungere 10 millilitri di mezzo digestivo ai frammenti.
Utilizzare una pipetta sierologica da 25 millilitri per trasferire i pezzi di tessuto in un tubo conico da 50 millilitri e sigillare il tubo con pellicola di paraffina. Quindi incubare i frammenti su un rotatore a 0,03 X G per 2 ore e mezza a 37 gradi e 5% di anidride carbonica con umidità. Alla fine dell'incubazione, se tutti i frammenti possono essere passati attraverso la punta della pipetta P1000, sedimentare il liquame tissutale mediante centrifugazione e decantare attentamente il supernatante.
Sospendere il pellet in 3 millilitri di PBS e filtrare il contenuto del tubo in sequenza attraverso un filtro cellulare da 100, 170, 140 micrometri in un nuovo tubo conico, lavando ogni colino con 2 millilitri di DPBS fresco dopo ogni filtro. Pellettare le cellule mediante centrifugazione e decantare il supernatante sospendendo le cellule nel DPBS rimanente. Mescolare le cellule con un volume uguale di tampone di lysis di cloruro di ammonio di potassio e llyse i globuli rossi sul ghiaccio per un massimo di 5 minuti.
Al termine dell'incubazione, arrestare la lisi con 10 millilitri di DPBS e raccogliere le cellule per centrifugazione. Confermare la presenza di un pellet bianco e sospendere il pellet in 1-5 millilitri di mezzo mammosfera per il conteggio. Quindi placcare le cellule su un'adesione ultra bassa trattata con coltura non tissutale sei piastre di pozzo a 2 x 10 alla quinta cellule vitali per millilitro di concentrazione media di mammosfera per un'incubazione da 7 a 10 giorni a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.
Alla fine della coltura di 7-10 giorni, raccogliere le mammosfere primarie da ogni pozzo della piastra di coltura cellulare e sedimentare le mammosfere mediante cetrifugazione. Dopo aver decantato il supernatante, utilizzare una pipetta P200 con una punta filtrata per pipettare le mammosfere circa 100 volte. La generazione di pazienti a cellule singole è fondamentale per l'accurata quantificazione della cellula mammosfera per una nuova labilità.
Ispezionare visivamente l'estensione della segregazione e, se necessario, utilizzare il filtro cellulare. Sospendere le mammosfere dissociate con da 1 a 5 millilitri di mezzo mammosfera fresco per il conteggio e placcare da 2 X 10 alle quattro cellule vitali per millilitro su adesione ultra bassa rivestita di poliema sei piastre di pozzo per una coltura da 5 a 7 giorni. Quindi, dopo 5-7 giorni, conta il numero di sfere per pozzo.
Alla fine di ogni passaggio, utilizzare una fotocamera digitale montata su uno stereoscopio per scansionare l'intera superficie di tutti i pozzi per immagini le sfere. Dopo aver salvato le immagini, come file tif, importate le immagini stereoscopiche come sequenza di immagini in ImageJ e impostate la scala e il tipo di immagine su 8 bit. Duplicare la pila di immagini e selezionare Sottrai sfondo dalla scheda Processo.
Controllare le opzioni Sfondo chiaro e Paraboloide scorrevole e fare clic su OK per elaborare tutte le immagini della pila. Selezionare Regola e soglia dalla scheda Immagine e fare clic su Applica. Apparirà una finestra pop-up.
Selezionate Predefinito (Default) come metodo e Luce (Light) come sfondo. Selezionare la casella Calcola soglia per ogni immagine e fare clic su OK. Per elaborare tutte le immagini nello stack, selezionare Spartiacque e fare clic su Sì. Selezionare Apri e fare clic su Sì e selezionare Erode e fare clic su Sì.
Quindi, selezionate Analizza particelle (Analyze Particles) dal menu Analizza (Analyze) e impostate la soglia di dimensione minima a 10.000 micrometri al quadrato e la circolarità compresa tra 0,50 e 1,00. Selezionate l'opzione Ellissi (Ellipses) dal menu a discesa Mostra (Show) e selezionate Riepiloga (Summarize), Escludi sui bordi (Exclude on edges) e Mostra in situ (In situ Show). Quindi fare clic su OK per elaborare tutte le immagini dello stack.
Per calcolare la curva di crescita cumulativa per ogni passaggio registrare il numero di cellule placcate e il numero di cellule in sfere conteggiate per pozzo e calcolare la dimensione della sfera alla fine di ogni passaggio. Dedurre il numero di sfere placcate, dividendo il numero di celle placcate per ogni passaggio per la dimensione della sfera calcolata alla fine del passaggio precedente. Calcolare il numero di cella cumulativo per ogni pozzo per passaggio e il numero di sfera cumulativa per ogni pozzo per passaggio e tracciare i punti dati su una scala semi-logaritmica.
Quindi una linea di tendenza esponenziale ai punti dati e calcolare il coefficiente di determinazione per misurare la bontà dell'adattamento. Quindi raffigura l'equazione della linea di tendenza come una funzione esponenziale naturale per dedurre il tasso di crescita della cultura. In questo esperimento, sono stati determinati il numero di sfere e cellule di cinque passaggi consecutivi, per tre esperimenti indipendenti.
Qui alla cella cumulativa e vengono mostrati i numeri di sfera per passaggio. Come osservato attivazione myc, porta ad un aumento dei tassi di crescita della sfera e delle cellule. I punti di tempo biologici e rilevanti possono essere selezionati per la raccolta cellulare o per eseguire analisi dell'espressione genica o altre risorse funzionali per valutare la differenziazione cellulare, la migrazione e l'invasione.
Questo è un approccio semplice ed economico con più applicazioni. Ad esempio, può essere utilizzato nella scoperta diretta per misurare gli effetti sulla proliferazione delle cellule staminali tumorali e sull'autori rinnovamento.
