Gli autori non hanno riconoscimenti.

Le procedure sperimentali e trattamento etico degli animali è stato approvato dal l&#39;Università di Pittsburgh IACUC (protocollo # 1.104.674). 1. Preparazione di G6PD colorazione Miscela NOTA: Assicurarsi che la concentrazione finale di ogni reagenti è il seguente; 5 mM di glucosio-6-fosfato (G6P); 2 NADP mM, 5 mM MgCl 2, NBT mM 0,35 mm 1-metossi-5-metil methylphenazinium solfato (MMPMS) e 0,8. 1,8,9 Per ogni reagente la concentrazione iniziale è stata derivata per 40 ml di volume finale. Soluzioni sono state preparate al momento e utilizzati ogni giorno. <ol><li> Aggiungere 2 ml di 200 mM pH 7,4 tampone fosfato (PB) a 35 ml di ottobre medio in un tubo da 50 ml e agitare vigorosamente. Conferma con carta pH che la soluzione è ~ pH 7.4. Se non scartare la soluzione. </li><li> Aggiungere 61 mg G6P disciolto in 0,94 ml di PB 200 mM, 61 mg NADP disciolto in 0,94 ml di PB 200 mM, e 41 mg di MgCl 2 disciolto in 0,96 ml di 100 mM PB. Riconfermare che il pH è ~ 7,4 ingegnoh carta pH. In caso contrario ~ 7.4, scartare la soluzione. </li><li> Aggiungere 5 mg di MMPMS disciolti in 0,25 ml di PB 200 mM (pH 7,4). Agitare la miscela di reazione risultante per generare una chiara omogenato rosso scuro. Se la soluzione è torbida, la miscela deve essere scartato. La provetta contenente la miscela di reazione è avvolto in un foglio per minimizzare l&#39;esposizione alla luce. Conservare la miscela di reazione a temperatura ambiente, mentre il componente finale, NBT, viene preparato. </li><li> Preparare a parte una soluzione 5 mM NBT aggiungendo 0,4 ml anidra formammide dimetil (DMF) e 0,4 ml di etanolo anidro a 164 mg di NBT in una provetta 2 ml di un coperchio O-ring. Chiudere il coperchio liberamente (non ermeticamente chiusi) e portare la soluzione ad ebollizione vigorosa in un bagno ad olio fino a quando il NBT è in soluzione. 8 </li><li> Lasciare solubilizzato NBT raffreddare a RT e quindi aggiungere tutta la soluzione alla miscela di reazione Office e agitare energicamente per ottenere una soluzione limpida. Osservare il cambiamento di colore della soluzione da rosso-arancio iniziale a un rosso scuro o purpcolore le nel tempo. E &#39;normale. </li><li> Posizionare la miscela finale G6PD colorazione a 37 ° C camera calda per 1 ora prima dell&#39;uso. </li></ol> 2. Trattamento degli animali e del tessuto Collection <ol><li> Trattare 6 settimane di età C57BL / 6 topi maschi con DNA agente dannoso, ad esempio, 10 mg / kg azoxymethane (AOM) in un volume di 200 microlitri di PBS mediante iniezione ip. Trattare topi di controllo con 200 ml di PBS mediante iniezione ip. </li><li> A 90 giorni, eutanasia topi da CO 2 asfissia seguita da dislocazione cervicale come approvato dal protocollo IACUC. </li><li> Aprire chirurgicamente la cavità addominale da appena sopra l&#39;ano alla base dello sterno. Spostare il piccolo intestino fuori della cavità del corpo, ma non asportare esso. Accise basso intestino appena sotto il cieco al retto. 10 </li><li> Tagliare attentamente lungo un lato del colon mediante una forbice micro-dissezione e rimuovere le feci dal colon aperto mediante lavaggio con PBS sterile pulito. Swiss roll accised colon con lato luminale rivolto verso l&#39;esterno, e posto in uno stampo di tessuto. 10 </li><li> Immergere completamente i due punti in ottobre medio e luogo stampo in una Dewar contenente liquido N 2. Tenere lo stampo in modo che la base in plastica è solo a contatto con il liquido N 2 fino a quando il mezzo PTOM solidifica. </li><li> Conservare il blocco tessuti congelati a -80 fino a tagliare sezioni congelate. Non utilizzare fissatore, che si tradurrebbe in l&#39;inattivazione dell&#39;enzima G6PD. </li></ol> 3. Preparazione di sezioni congelate <ol><li> Tagliare sezioni di tessuto congelato ad uno spessore di 7 micron utilizzando un criostato a -25 ° C. Tagliare 4 consecutivi 7 sezioni micron e posizionare due di essi sulla stessa slitta (figura 1). Preparare 2 diapositive o quattro consecutive 7 sezioni micron per rappresentare un livello del colon (Figura 1). </li><li> Ripetere per il livello successivo con una distanza minima di&gt; 50 micron dall&#39;ultima sezione del prlivello evious. Questa distanza garantito che le cripte valutati per ogni livello non riproducano l&#39;un l&#39;altro. </li><li> Pulire frequentemente la lama criostato con 100% di etanolo per rimuovere i residui ottobre che si accumula durante il taglio. Prima di sezionamento riprende, la lama secco è pulito con un foglio di essiccatore antistatica per dissipare carica statica accumulata. Conservare i vetrini con sezioni congelate a -80 ° C. </li></ol> 4. La colorazione di sezioni congelate Tissue <ol><li> Eseguire la reazione enzimatica istochimica a 37 ° C ambiente caldo con umidità elevata. NOTA: tentativo la reazione enzimatica in un forno incubazione o su un vetrino più caldo ha portato povero e incoerente G6PD colorazione. </li><li> La costruzione di pozzi per la colorazione dei tessuti utilizzando due rondelle di acciaio da 1,5 a 0,15 cm (interno diametro x altezza) cm x che sono legati tra loro con grasso al silicone (figura 1). Tagliare il parafilm per adattarsi alla base del pozzo con il centro tagliare e il luogo bend sulla sezione di tessuto sul vetrino. NOTA: Il parafilm sul fondo della rondella crea una tenuta tra la slitta e la rondella che mantiene la miscela viscosa G6PD colorazione sulla sezione di tessuto. Questo costrutto dà un pozzo con 0,4 - 0,5 ml di volume in modo che ciascuna sezione di tessuto nello studio riceve lo stesso volume della miscela di reazione di colorazione G6PD. </li><li> Incubare i vetrini di tessuto congelato a 37 ° C in un ambiente caldo per 10 minuti. A 37 ° C, aggiungere la miscela di reazione G6PD colorazione ad ogni pozzetto sezione di tessuto (2 sezioni per vetrino) per 45-50 min. Togliere i vetrini dalla camera calda, e sollevare con cautela i pozzetti in acciaio inox al largo delle diapositive. </li><li> Set diapositive sul loro lato lungo per permettere al mezzo di reazione di scarico. Collocare i vetrini in PB 100 mM (pH 7,4) per 30-60 minuti per rimuovere la miscela di reazione G6PD colorazione dal tessuto senza disturbare la colorazione dei tessuti. Immergere i vetrini in acqua distillata per 5-10 minuti per eliminare i sali PB </li><li> Sigillare il tessuto da aggiungereing fluoro-gel da un contagocce sul tessuto e in attesa ~ 30 minuti che si asciughi. Evitare bolle che possono confondere l&#39;identificazione delle cripte mutati. NOTA: Se si formano bolle, la procedura può essere ripetuta dopo la rimozione del fluoro-gel per immersione in acqua distillata. Non utilizzare coprioggetto in quanto tendono a intrappolare bolle d&#39;aria. </li></ol> 5. Determinazione di G6PD Mutant Cripte e Mutazione frequenza <ol><li> Analizzare scivoli per G6PD cripte mutanti al microscopio ottico. NOTA: I criteri utilizzati per individuare una cripta completamente mutante sono stati: (i) l&#39;intera cripta era privo di colore blu; (ii) la struttura esterna della cripta era intatto, (iii) la cripta mutante è stato osservato su sezioni adiacenti 7 micron e, (iv) due osservatori dovevano identificare la stessa cripta come un mutante. Mutanti osservati su adiacenti 7 sezioni micron vengono conteggiati come un mutante. </li><li> Immagine ogni G6PD cripta mutante a 40x e catalogare le immagini con una fotocamera da 5.0 megapixel consoftware di imaging. </li><li> Quantificare il numero totale di cripte esaminati in un mouse selezionando una sezione rappresentativa per ogni mouse dal livello con la superficie più piccola e l&#39;immagine che a ingrandimento 10x (Figura 1C). NOTA: Un livello rappresenta quattro consecutivi 7 sezioni micron (Figura 1D), che per la loro vicinanza spesso mostrano cripte mutati in più di una sezione. I livelli sono separati da&gt; 50 micron per visualizzare cripte diverse aree del colon. </li><li> Aprire ogni file di immagine e contare visivamente il numero di cripte a livello analizzando i file (mostrate come caselle nella Figura 1C). File di immagini variano nel numero di cripte osservati da un minimo di 20 a&gt; 300 cripte in un unico file. </li><li> Moltiplicare il numero totale delle cripte dal livello selezionato (Figura 1C) per ogni mouse per il numero di livelli di screening per cripte G6PD mutanti per ciascuna colon. Per esempio, un conteggio totale di1.250 cripte per livello selezionato moltiplicato per 8 livelli a screening per cripte mutanti equivale a un conteggio totale di 10.000 cripte. Valutare un minimo di 10.000 cripte per ciascun colon per l&#39;analisi statistica. </li><li> Combinare il numero di mutanti osservate in tutti gli animali per il numero totale di cripte schermati per calcolare il MF per ogni trattamento. Il livello MF cellule staminali sfondo in topi non trattati è &lt;0.1x10 -4 (Tabella 1), che è vicino a quello riportato in precedenza in topi C57BL / 6. 11 </li></ol>

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	<li>Griffiths, D. F., Davies, S. J., Williams, S., Williams, G. T., Williams, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+somatic+mutation+and+colonic+crypt+clonality+by+X-linked+enzyme+histochemistry.">Demonstration of somatic mutation and colonic crypt clonality by X-linked enzyme histochemistry.</a> Nature. 333 (6172), 461-463 (1988).</li><li>Griffiths, D. F., Sacco, P., Williams, G. T., Williams, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clonal+origin+of+experimental+large+bowel+tumours.">The clonal origin of experimental large bowel tumours.</a> Br. J. Cancer. 59 (3), 385-387 (1989).</li><li>Kuraguchi, M., Thomas, G. A., Williams, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutation+of+the+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+(g6pd)+gene+in+colonic+stem+cells+and+crypt+restricted+loss+of+G6PD+activity.">Somatic mutation of the glucose-6-phosphate dehydrogenase (g6pd) gene in colonic stem cells and crypt restricted loss of G6PD activity.</a> Mutat. Res. 379 (1), (1997).</li><li>Van Noorden, C. J., Vogels, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyvinyl+alcohol+and+other+tissue+protectants+in+enzyme+histochemistry:+a+consumer&#8217;s+guide.">Polyvinyl alcohol and other tissue protectants in enzyme histochemistry: a consumer&#8217;s guide.</a> Histochem. J. 21 (7), 373-379 (1989).</li><li>Giardina Rosenberg, D. W., C, T., Tanaka, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+the+study+of+colon+carcinogenesis.">Mouse models for the study of colon carcinogenesis.</a> Carcinogenesis. 30 (2), 183-196 (2009).</li><li>Tanaka, T., Kohno, H., Suzuki, R., Yamada, Y., Sugie, S., Mori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+inflammation-related+mouse+colon+carcinogenesis+model+induced+by+azoxymethane+and+dextran+sodium+sulfate.">A novel inflammation-related mouse colon carcinogenesis model induced by azoxymethane and dextran sodium sulfate.</a> Cancer Sci. 94 (11), 965-973 (2003).</li><li>Suzuki, R., Kohno, H., Sugie, S., Tanaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-dependent+promoting+effect+of+dextran+sodium+sulfate+on+mouse+colon+carcinogenesis+initiated+with+azoxymethane.">Dose-dependent promoting effect of dextran sodium sulfate on mouse colon carcinogenesis initiated with azoxymethane.</a> Histol. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+Colitis+modeling+using+Dextran+Sulfate+Sodium+(DSS).">Murine Colitis modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS).</a> J Vis Exp. (35), (2010).</li><li>Kuraguchi, M., Cook, H., Williams, E. D., Thomas GA, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+susceptibility+to+colonic+stem+cell+somatic+mutation+in+three+strains+of+mice.">Differences in susceptibility to colonic stem cell somatic mutation in three strains of mice.</a> J. Pathol. 193 (4), 517-521 (2001).</li><li>Whetstone, R. D., Gold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-Cells+Enhance+Stem+Cell+Mutagenesis+in+the+Mouse+Colon.">T-Cells Enhance Stem Cell Mutagenesis in the Mouse Colon.</a> Mutat. Res. 744, 1-5 (2015).</li><li>Van Noorden, C. J., Vogel, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histochemistry+and+cytochemistry+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase.">Histochemistry and cytochemistry of glucose-6-phosphate dehydrogenase.</a> Prog. Histochem. Cytochem. 15 (4), 1-85 (1985).</li><li>Van Noorden, C. J., Vogels, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+cytochemical+staining+method+for+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+activity+in+individual+erythrocytes.+II.+Further+improvements+of+the+staining+procedure+and+some+observations+with+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+deficiency.">A sensitive cytochemical staining method for glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in individual erythrocytes. II. Further improvements of the staining procedure and some observations with glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency.</a> Br. J. Haematol. 60 (1), 57-63 (1985).</li><li>Cook, H. A., Williams, D., Thomas, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crypt-restricted+metallothionein+immunopositivity+in+murine+colon:+validation+of+a+model+for+studies+of+somatic+stem+cell+mutation.">Crypt-restricted metallothionein immunopositivity in murine colon: validation of a model for studies of somatic stem cell mutation.</a> J. Pathol. 191 (3), 306-312 (2000).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Spesso l&#39;effetto genotossico di un composto è determinata dalla sua capacità di modificare il DNA. Questo avviene normalmente isolando il tessuto e misurando il livello globale di addotti di DNA. Per AOM, ciò comporterebbe la quantificazione O 6 -methylguanine addotti nel colon. Utilizzando queste informazioni approccio sui danni entro specifici tipi cellulari, come ad esempio nella nicchia delle cellule staminali, è perduto. Inoltre, un addotto DNA non è la stessa come una mutazione in quanto solo u...

Il cancro del colon è pensato di coinvolgere l&#39;esposizione ad agenti ambientali e componenti della dieta che possono danneggiare il DNA e produrre l&#39;attivazione di mutazioni somatiche in oncogeni (per esempio, ß-catenina) o mutazioni inattivanti in geni oncosoppressori (ad esempio, APC). Si presume che queste mutazioni critiche si verificano in cellule staminali del colon. A causa dell&#39;architettura cripta unica dell&#39;epitelio del colon, è possibile misurare mutazioni di cellule staminali nel colon dopo l&#39;esposizione a sostanze chimiche animali associati carcinogenesi del colon. Diversi enzimi X-linked possono servire come indicatori per le mutazioni che avvengono nelle cellule staminali, come le mutazioni saranno presenti in tutte le cellule all&#39;interno di una cripta. In precedenza, un procedimento è stata pubblicata a dimostrazione che le sostanze chimiche che inducono tumori del colon nei topi anche generato mutazioni su cellule staminali somatiche nel colon tramite analisi delle mutazioni del glucosio-6-fosfato deidrogenasi X-linked (G6PD) gene. 1-3Il metodo quantifica l&#39;incidenza di mutazioni somatiche casuali nelle cellule staminali del colon senza alcuna pressione di selezione. La procedura prevede la produzione di non fissati sezioni congelate colon da topi trattati e di controllo e l&#39;individuazione delle cripte privi di cellule che producono l&#39;attività G6PD funzionale. Queste cripte mutati, che appaiono bianchi, indicano che la mutazione si è verificato in una cellula staminale che ha dato origine a progenie anche ospitare un gene G6PD mutato. Nel saggio enzimatico, G6PD cripte mutante carente non possono ossidare il glucosio-6-fosfato, che è richiesto per la riduzione del nitro blu tetrazolio (NBT). Quando l&#39;enzima G6PD è funzionale, il NBT nella miscela colorazione è ridotto a formazano insolubile e precipitati, accumulando nella posizione dell&#39;enzima e &quot;colorazione&quot; cellule blu. Cellule che sono mutanti G6PD rimangono biancastro in contrasto con blu macchiati di tipo cripte selvatici. Questo metodo misura le mutazioni che hanno un fenotipo &quot;null&quot;. Perché itZymes, quali G6PD, può diffondere fuori delle cellule su una sezione di tessuto non fissata se le sezioni sono poste in una soluzione acquosa, è necessario stabilizzare l&#39;enzima in sezioni di tessuto da analizzare. 4 La stabilizzazione dell&#39;enzima nel tessuto non deve interferire con la diffusione di piccole molecole reagenti necessari per la reazione enzimatica G6PD. Abbiamo fatto una serie di cambiamenti significativi alla procedura originale. Il mezzo per la colorazione enzimatica critica è stata cambiata da polivinilalcool a taglio ottimale Temperatura Compound (OCT), che facilita il controllo del pH e la solubilizzazione dei componenti utilizzati nel saggio. La colorazione viene effettuata con 0,4 - 0,5 ml pozzi realizzati rondelle in acciaio in modo che ciascuna sezione di tessuto ricevuto lo stesso volume della miscela di reazione G6PD. Una procedura è stata sviluppata per stimare il numero di cripte in una sezione immaginata che fornisce una grande campionamento del tessuto del colon senza doverdi contare manualmente&gt; 10 5 cripte per ciascun colon. L&#39;analisi di 7 micron adiacenti sezioni di tessuto permette la visualizzazione di una cripta mutante più diapositive, che riduce potenziali artefatti di colorazione. Questi cambiamenti rendono la procedura più efficiente e riproducibile. Usando questo protocollo rivisto, abbiamo quantificato la frequenza di mutazione in cellule staminali del colon dopo l&#39;esposizione di topi C57BL / 6 a azoxymethane, un agente cancerogeno colon noto nei roditori. 5-7

<table><tbody><tr><td>reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>nitroblue tetrazolium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NADP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>glucose-6-phosphate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dimethyl formamide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>phosphate buffer (pH 7.4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>light microscope equipped with 5 megapixel camera</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cryostat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>warm room&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantification of  colonic stem cell mutations

La capacità di misurare mutazioni di cellule staminali è un potente strumento per quantificare in una popolazione di cellule critico se, e in quale misura, una sostanza chimica può indurre mutazioni che potenzialmente portano al cancro. L&#39;uso di un saggio enzimatico per quantificare mutazioni di cellule staminali nel gene di glucosio-6-fosfato deidrogenasi X-linked è stata riportata in precedenza. 1 Questo metodo richiede la preparazione di sezioni congelate e incubazione del tessuto sezionato con una miscela di reazione che produce un colore blu se le cellule producono funzionale glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) enzima. In caso contrario, le cellule appaiono biancastro. Abbiamo modificato la miscela di reazione utilizzando ottimali di taglio Temperatura composto (OCT) media al posto di alcool polivinilico. Ciò facilita la misura di pH, aumenta solubilizzazione dei componenti colorazione G6PD e limita la diffusione dell&#39;enzima G6PD. Per dimostrare che una mutazione si è verificata in una cellula staminale, l&#39;intera cripta deve mancare G6PD enzimaticaattività. Solo se una cellula staminale ospita una mutazione G6PD fenotipica saranno tutti della progenie nella cripta mancano attività enzimatica G6PD. Per identificare cripte con una mutazione di cellule staminali, quattro sezioni congelate adiacenti consecutivi (un livello) sono stati tagliati a 7 micron di spessore. Questo approccio di effettuare tagli adiacenti fornisce conformazione che una cripta era completamente mutato in quanto la stessa cripta mutato sarà osservato in sezioni adiacenti. Vetrini con campioni di tessuto che sono stati più di 50 micron a parte erano pronti a valutare un totale di&gt; 10 4 cripte per mouse. La frequenza di mutazione è il numero di mutanti (bianco) cripte osservati ÷ per il numero di tipo selvatico (blu) cripte in un gruppo di trattamento.

La capacità di misurare mutazioni di cellule staminali del colon negli animali fornisce un modo unico per correlare le mutazioni a induzione di cancro. Normalmente, si presume che il passaggio critico nella carcinogenesi comporta mutazioni attivanti in oncogeni e / o inattivazione mutazioni in geni oncosoppressori. Abbiamo iniettato Topi C57BL / 6 con 200 microlitri di PBS o 10 mg / kg AOM in 200 ml di PBS. AOM è un agente cancerogeno del colon conosciuto. 5-7 A 90 giorni i due punti sono stati analizzati p...

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Quantification of  Colonic Stem Cell Mutations

We report significant improvements for the reproducible measurement of somatic colonic stem cell mutations after exposure of mice to potential DNA damaging agents.

Quantificazione del colon le mutazioni delle cellule staminali

The ability to measure stem cell mutations is a powerful tool to quantify in a critical cell population if, and to what extent, a chemical can induce ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.6K Views.  University of Pittsburgh. We report significant improvements for the reproducible measurement of somatic colonic stem cell mutations after exposure of mice to potential DNA damaging agents.

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Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. In the clinical setting, formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues are widely used for genetic testing. However, FFPE DNA is generally damaged and fragmented during the fixation process with formalin. Therefore, FFPE DNA is sometimes not adequate for genetic testing because of low quality and quantity of DNA. Here we present a method of touch imprint cytology (TIC) to obtain genomic DNA from cancer cells, which can be observed under a microscope. Cell morphology and cancer cell numbers can be evaluated using TIC specimens. Furthermore, the extraction of genomic DNA from TIC samples can be completed within two days. The total amount and quality of TIC DNA obtained using this method was higher than that of FFPE DNA. This rapid and simple method allows researchers to obtain high-quality DNA for genetic testing (e.g., next generation sequencing analysis, digital PCR, and quantitative real time PCR) and to shorten the turnaround time for reporting results.

Obtaining high-quality genomic DNA from tumor tissues is an essential first step for analyzing genetic alterations using next generation sequencing. In this article, we present a simple and rapid method to enrich tumor cells and obtain intact DNA from touch imprint cytology specimens.

Metodo semplice e veloce per ottenere alta qualità tumore del DNA da campioni clinico-patologiche utilizzando Touch Imprint citologia

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing

The current prognosis and classification of CRC relies on staging systems that integrate histopathologic and clinical findings. However, in the majority of CRC cases, cell dysfunction is the result of numerous mutations that modify protein expression and post-translational modification1.
A number of cell surface antigens, including cluster of differentiation (CD) antigens, have been identified as potential prognostic or metastatic biomarkers in CRC. These antigens make ideal biomarkers as their expression often changes with tumour progression or interactions with other cell types, such as tumour-infiltrating lymphocytes (TILs) and tumour-associated macrophages (TAMs).
The use of immunohistochemistry (IHC) for cancer sub-classification and prognostication is well established for some tumour types2,3. However, no single &#x2018;marker&#x2019; has shown prognostic significance greater than clinico-pathological staging or gained wide acceptance for use in routine pathology reporting of all CRC cases. 
A more recent approach to prognostic stratification of disease phenotypes relies on surface protein profiles using multiple 'markers'. While expression profiling of tumours using proteomic techniques such as iTRAQ is a powerful tool for the discovery of biomarkers4, it is not optimal for routine use in diagnostic laboratories and cannot distinguish different cell types in a mixed population. In addition, large amounts of tumour tissue are required for the profiling of purified plasma membrane glycoproteins by these methods. 
In this video we described a simple method for surface proteome profiling of viable cells from disaggregated CRC samples using a DotScan CRC antibody microarray. The 122-antibody microarray consists of a standard 82-antibody region recognizing a range of lineage-specific leukocyte markers, adhesion molecules, receptors and markers of inflammation and immune response5, together with a satellite region for detection of 40 potentially prognostic markers for CRC. Cells are captured only on antibodies for which they express the corresponding antigen. The cell density per dot, determined by optical scanning, reflects the proportion of cells expressing that antigen, the level of expression of the antigen and affinity of the antibody6. 
For CRC tissue or normal intestinal mucosa, optical scans reflect the immunophenotype of mixed populations of cells. Fluorescence multiplexing can then be used to profile selected sub-populations of cells of interest captured on the array. For example, Alexa 647-anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM; CD326), is a pan-epithelial differentiation antigen that was used to detect CRC cells and also epithelial cells of normal intestinal mucosa, while Phycoerythrin-anti-CD3, was used to detect infiltrating T-cells7. The DotScan CRC microarray should be the prototype for a diagnostic alternative to the anatomically-based CRC staging system.

We described a procedure for the disaggregation of colorectal cancer (CRC) to produce viable single cells, which are then captured on customized antibody microarrays recognizing surface antigens (DotScan CRC microarray). Sub-populations of cells bound to the microarray can be profiled by fluorescence multiplexing using monoclonal antibodies tagged with fluorescent dyes.

Carcinoma del colon-retto Profilo delle proteine ​​di superficie L&#39;utilizzo di un anticorpo Microarray e Multiplexing fluorescenza

The current prognosis and classification of CRC relies on staging systems that integrate histopathologic and clinical findings. However, in the majority ...

Immunologia e infezioni

Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a reliable probability of the presence of pre-neoplastic or neoplastic colorectal lesions. This method, called fluorescence long DNA (FL-DNA), is a fast, non-invasive procedure that is an improvement upon the primary prevention system. This method is based on evaluation of fecal DNA integrity by quantitative amplification of specific targets of genomic DNA. In particular, the evaluation of DNA fragments longer than 200 bp allows for detection of patients with colorectal lesions with very high specificity. However, this system and all currently available stool DNA tests present some general issues that need to be addressed (e.g., the frequency at which tests should be carried out and optimal number of stool samples collected at each timepoint for each individual). However, the main advantage of FL-DNA is the possibility to use it in association with a test currently used in the CRC screening program, known as the immunochemical-based fecal occult blood test (iFOBT). Indeed, both tests can be performed on the same sample, reducing costs and achieving a better prediction of the eventual presence of colorectal lesions.

The presented diagnostic FL-DNA kit is a time-saving and user-friendly method to determine the reliable probability of the presence of colorectal cancer lesions.

Valutazione del rischio di cancro colorettale e della prevalenza da parte del rilevamento dell'integrità del DNA delle feci

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a ...

Discovery of Driver Genes in Colorectal HT29-derived Cancer Stem-Like Tumorspheres

Cancer stem cells play a vital role against clinical therapies, contributing to tumor relapse. There are many oncogenes involved in tumorigenesis and the initiation of cancer stemness properties. Since gene expression in the formation of colorectal cancer-derived tumorspheres is unclear, it takes time to discover the mechanisms working on one gene at a time. This study demonstrates a method to quickly discover the driver genes involved in the survival of the colorectal cancer stem-like cells in vitro. Colorectal HT29 cancer cells that express the LGR5 when cultured as spheroids and accompany an increase CD133 stemness markers were selected and used in this study. The protocol presented is used to perform RNAseq with available bioinformatics to quickly uncover the overexpressed driver genes in the formation of colorectal HT29-derived stem-like tumorspheres. The methodology can quickly screen and discover potential driver genes in other disease models.

Presented here is a protocol to discover the overexpressed driver genes maintaining the established cancer stem-like cells derived from colorectal HT29 cells. RNAseq with available bioinformatics was performed to investigate and screen gene expression networks for elucidating a potential mechanism involved in the survival of targeted tumor cells.

Scoperta dei geni del conducente nelle scansioni tumorali del cancro derivato dal cancro colorettale

Cancer stem cells play a vital role against clinical therapies, contributing to tumor relapse. There are many oncogenes involved in tumorigenesis and the ...

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem cells are responsible for ensuring tissue homeostasis and repair throughout life, it is reasonable to hypothesize that the stem cell population is critical for preserving genomic integrity of tissues. Therefore, significant interest has arisen in assessing the impact of endogenous and environmental factors on genomic integrity in stem cells and their progeny, aiming to understand the etiology of stem-cell based diseases.
LacI transgenic mice carry a recoverable &#955;&#160;phage vector encoding the LacI reporter system, in which the LacI gene serves as the mutation reporter. The result of a mutated LacI gene is the production of &#946;-galactosidase that cleaves a chromogenic substrate, turning it blue. The LacI reporter system is carried in all cells, including stem/progenitor cells and can easily be recovered and used to subsequently infect E. coli. After incubating infected E. coli on agarose that contains the correct substrate, plaques can be scored; blue plaques indicate a mutant LacI gene, while clear plaques harbor wild-type. The frequency of blue (among clear) plaques indicates the mutant frequency in the original cell population the DNA was extracted from. Sequencing the mutant LacI gene will show the location of the mutations in the gene and the type of mutation.
The LacI transgenic mouse model is well-established as an in vivo mutagenesis assay. Moreover, the mice and the reagents for the assay are commercially available. Here we describe in detail how this model can be adapted to measure the frequency of spontaneously occurring DNA mutants in stem cell-enriched Lin-IL7R-Sca-1+cKit++(LSK) cells and other subpopulations of the hematopoietic system.

Here we describe an in vivo mutagenesis assay for small numbers of purified hematopoietic cells using the LacI transgenic mouse model.&#160;The LacI gene can be isolated to determine the frequency, location, and type of DNA mutants&#160;spontaneously arisen or after exposure to genotoxins.

L&#39;identificazione del DNA Mutazioni in depurata ematopoietiche cellule staminali / progenitrici

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for tumor development, maintenance, and resistance to drugs. A better understanding of CSC properties for their specific targeting is, therefore, a pre-requisite for effective therapy. However, there is a paucity of suitable preclinical models for in-depth investigations. Although in vitro two-dimensional (2D) cancer cell lines provide valuable insights into tumor biology, they do not replicate the phenotypic and genetic tumor heterogeneity. In contrast, three-dimensional (3D) models address and reproduce near-physiological cancer complexity and cell heterogeneity. The aim of this work was to design a robust and reproducible 3D culture system to study CSC biology. The present methodology describes the development and optimization of conditions to generate 3D spheroids, which are homogenous in size, from Caco2 colon adenocarcinoma cells, a model that can be used for long-term culture. Importantly, within the spheroids, the cells which were organized around lumen-like structures, were characterized by differential cell proliferation patterns and by the presence of CSCs expressing a panel of markers. These results provide the first proof-of-concept for the appropriateness of this 3D approach to study cell heterogeneity and CSC biology, including the response to chemotherapy.

This protocol presents a novel, robust, and reproducible culture system to generate and grow three-dimensional spheroids from Caco2 colon adenocarcinoma cells. The results provide the first proof-of-concept for the appropriateness of this approach to study cancer stem cell biology, including the response to chemotherapy.

Un modello tridimensionale di sferoidi per studiare le cellule staminali del cancro del colon

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...

Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach

Assessing intra-tumoral heterogeneity (ITH) is of paramount importance to anticipate failure of targeted therapies and design accordingly effective anti-tumor strategies. Although concerns are frequently raised due to differences in sample processing and depth of coverage, next-generation sequencing of solid tumors have unraveled a highly variable degree of ITH across tumor types. Capturing the genetic relatedness between primary and metastatic lesions through the identification of clonal and subclonal populations is critical to the design of therapies for advance-stage diseases. Here, we report a method for comparative lesions analysis that allows for the identification of clonal and subclonal populations among different specimens from the same patient. The experimental approach described here integrates three well-established approaches: histological analysis, high-coverage multi-lesion sequencing, and immunophenotypic analyses. In order to minimize the effects on the detection of subclonal events by inappropriate sample processing, we subjected tissues to careful pathological examination and neoplastic cell enrichment. Quality controlled DNA from neoplastic lesions and normal tissues was then subjected to high coverage sequencing, targeting the coding regions of 409 relevant cancer genes. While only looking at a limited genomic space, our approach enables evaluating the extent of heterogeneity among somatic alterations (single-nucleotide mutations and copy-number variations) in distinct lesions from a given patient. Through comparative analysis of sequencing data, we were able to distinguish clonal vs. subclonal alterations. The majority of ITH is often ascribed to passenger mutations; therefore, we also used immunohistochemistry to predict functional consequences of mutations. While this protocol has been applied to a specific tumor type, we anticipate that the methodology described here is broadly applicable to other solid tumor types.

This article describes a method to identify clonal and subclonal alterations among different specimens from a given patient. Although the experiments described here focus on a specific tumor type, the approach is broadly applicable to other solid tumors.

Analisi comparativa delle lesioni attraverso un approccio di sequenziamento mirato

Assessing intra-tumoral heterogeneity (ITH) is of paramount importance to anticipate failure of targeted therapies and design accordingly effective ...

Comportamento

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the extracellular matrix (ECM). Characterizing the biology of this phenotypically distinct group of cells could substantially improve our understanding of early events during the metastatic cascade.

Tumor invasion is a dynamic process facilitated by bidirectional interactions between malignant epithelium and the cancer associated stroma. In order to examine cell-specific responses at the tumor stroma-interface we have combined organotypic co-culture and laser micro-dissection techniques.
Organotypic models, in which key stromal constituents such as fibroblasts are 3-dimentioanally co-cultured with cancer epithelial cells, are highly manipulatable experimental tools which enable invasion and cancer-stroma interactions to be studied in near-physiological conditions.

Laser microdissection (LMD) is a technique which entails the surgical dissection and extraction of the various strata within tumor tissue, with micron level precision.
By combining these techniques with genomic, transcriptomic and epigenetic profiling we aim to develop a deeper understanding of the molecular characteristics of invading tumor cells and surrounding stromal tissue, and in doing so potentially reveal novel biomarkers and opportunities for drug development in CRC.&#160;&#160;&#160;

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular profiling of laser microdissected cells and stroma from synthetic, tissue-engineered colorectal cancer models represents a novel and manipulatable approach to characterize and dissect the distinctive biology at the interface between tumor cells at the invasive front and cancer associated stromal cells. &#160;

Molecular Profiling del microambiente tumorale invasiva in un modello 3-Dimensional delle cellule del cancro colorettale e<em&gt; Ex vivo</em&gt; fibroblasti

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

Medicina

Deficient Pms2, ERCC1, Ku86, CcOI in Field Defects During Progression to Colon Cancer

In carcinogenesis, the "field defect" is recognized clinically because of the high propensity of survivors of certain cancers to develop other malignancies of the same tissue type, often in a nearby location. Such field defects have been indicated in colon cancer. The molecular abnormalities that are responsible for a field defect in the colon should be detectable at high frequency in the histologically normal tissue surrounding a colonic adenocarcinoma or surrounding an adenoma with advanced neoplasia (well on the way to a colon cancer), but at low frequency in the colonic mucosa from patients without colonic neoplasia.
Using immunohistochemistry, entire crypts within 10 cm on each side of colonic adenocarcinomas or advanced colonic neoplasias were found to be frequently reduced or absent in expression for two DNA repair proteins, Pms2 and/or ERCC1. Pms2 is a dual role protein, active in DNA mismatch repair as well as needed in apoptosis of cells with excess DNA damage. ERCC1 is active in DNA nucleotide excision repair. The reduced or absent expression of both ERCC1 and Pms2 would create cells with both increased ability to survive (apoptosis resistance) and increased level of mutability. The reduced or absent expression of both ERCC1 and Pms2 is likely an early step in progression to colon cancer.
DNA repair gene Ku86 (active in DNA non-homologous end joining) and Cytochrome c Oxidase Subunit I (involved in apoptosis) had each been reported to be decreased in expression in mucosal areas close to colon cancers. However, immunohistochemical evaluation of their levels of expression showed only low to modest frequencies of crypts to be deficient in their expression in a field defect surrounding colon cancer or surrounding advanced colonic neoplasia.
We show, here, our method of evaluation of crypts for expression of ERCC1, Pms2, Ku86 and CcOI. We show that frequency of entire crypts deficient for Pms2 and ERCC1 is often as great as 70% to 95% in 20 cm long areas surrounding a colonic neoplasia, while frequency of crypts deficient in Ku86 has a median value of 2% and frequency of crypts deficient in CcOI has a median value of 16% in these areas. The entire colon is 150 cm long (about 5 feet) and has about 10 million crypts in its mucosal layer. The defect in Pms2 and ERCC1 surrounding a colon cancer thus may include 1 million crypts. It is from a defective crypt that colon cancer arises.

Reduced/absent expression of Pms2 and/or ERCC1 in entire crypts is a frequent event within 10 cm on each side of colonic adenocarcinomas, likely the basis of a field defect with high mutability and progression to cancer. Deficiency in Ku86 or CcOI is much less frequent in these field defects.

PMS2 carente, ERCC1, Ku86, CcOI in Difetti del campo durante la progressione a tumore del colon

In carcinogenesis, the "field defect" is recognized clinically because of the high propensity of survivors of certain cancers to develop other ...

Biologia

MLH1 Gene Expression in Peripheral Blood in Colon Cancer Patients and Their Association with Colon Cancer

MutL homolog 1 (MLH1) is a component of the heterodimeric complex MutL&#945; that detects and fixes base-base mismatches and insertion/deletion loops caused by nucleotide misincorporation. In the absence of MLH1 protein, the frequency of non-repaired mismatches increases, resulting in organ cancer. The current study sought to quantify MLH1 gene expression and its relationship with tumor invasion (T) and lymph node invasion (N) in blood samples from patients with colorectal cancer (CRC). Blood samples were obtained from 36 CRC patients. RNA was extracted, and cDNA was synthesized using a kit. The primers were built using the exon-exon junction approach, and MLH1 and &#946;-actin genes were tested 3x using real-time polymerase chain reaction (Real-Time PCR). Gene expression analysis software was used to analyze the data, and a t-test was used to examine the expression of MLH1 and its connection with T and N variables. In this study, 36 patients with colorectal cancer, including 15 (41.6%) women and 21 (58.4%) men, with a mean age of 57.35 &plusmn; 4.22 years and in the age range of 26-87 years, were included. The results showed that the ratio of MLH1 gene expression in patients decreased compared to that in healthy individuals, and the decrease in gene expression at different stages of the disease was significant. The results of this study showed that the reduction of MLH1 gene expression has an effective role in the development of CRC.

This study examines the association between MLH1 gene expression in peripheral blood and colon cancer, utilizing a case-control approach to compare expression levels in patients and matched healthy controls.

MLH1 Espressione genica nel sangue periferico nei pazienti con cancro del colon e loro associazione con il cancro del colon

MutL homolog 1 (MLH1) is a component of the heterodimeric complex MutL&#945; that detects and fixes base-base mismatches and insertion/deletion loops ...

Quantificazione del colon le mutazioni delle cellule staminali

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