Work in S.M.'s laboratory is funded by recruitment grants from CPRIT (R1220) and NIH (1R01GM113023-01).

1. Isolamento di neurosfere dal cervello di topo per adulti <ol><li> Euthanize un topo adulto (circa 2 mesi) per una dose eccessiva di isoflurano. Fare doppio verificare che il mouse ha smesso di respirare e sezionare immediatamente dopo la morte. </li><li> Utilizzando le forbici, fare un&#39;incisione mediana per aprire il cranio. Rimuovere il cervello. </li><li> Mettere il cervello in PBS freddo in un piatto di 10 centimetri sul ghiaccio. Seguire tutta montaggio metodo dissezione avere la SVZ dal ventricolo laterale 48. </li><li> Posizionare il ventricolo laterale in una provetta da 1,5 ml, aggiungere 500 ml di 0,05% tripsina-EDTA in PBS, e incubare la provetta per 15 minuti a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua. </li><li> Dopo 15 minuti, aggiungere 500 ml di media arresto e pipettare delicatamente 20 - 30 volte con una punta ml 1. Evitare la formazione di bolle d&#39;aria durante il pipettamento. NOTA: Questo passaggio è fondamentale per la sopravvivenza delle cellule. </li><li> Spin giù le cellule a 500 xg per 8 minuti. Eliminare il surnatante, aggiungere 1 ml di PBS e risospendere tegli cellule pipettando gentilmente 5x con una punta mL 1. </li><li> Spin down a 500 xg per 8 minuti. Eliminare il surnatante utilizzando un mL punta 1 e aggiungere 1 ml di terreno di base. </li><li> (Facoltativo) Se si osservano detriti cellulari, passare le cellule attraverso una cella di 70 micron-filtro. </li><li> Contare il numero di cellule con un emocitometro; in generale, circa 30.000 - 60.000 cellule / SVZ si ottengono. </li><li> Piastra le cellule da una SVZ in 10 cm piatto con 10 ml di terreno di coltura e NSC a 37 ° C con 5% di CO 2. </li><li> (Opzionale) Per evitare la fusione tra le sfere 49, mettere a 1000 cellule in un singolo pozzetto di una piastra da 6 pozzetti bassissimo legame che è preriempita con 1,5 ml di terreno di coltura e NSC a 37 ° C con 5% di CO 2. NOTA: Dopo 5-7 giorni, neurosfere possono essere osservati (Figura 2A). Il periodo di coltura può essere diverso con l&#39;età del mouse o il background genetico. </li><li> Aggiungere 2 ml di terreno NSC ogni 3-4 giorni per mantenere la cultura(Non rimuovere il supporto esistente). </li></ol> 2. Analisi della Capacità Differenziazione di neurosfere e Ciliogenesis Test <ol><li> Per analizzare la capacità di differenziazione, analizzare le neurosfere in condizioni aderenti in terreno di differenziazione. </li><li> Sterilizzare 12 mm coprioggetto tondo in autoclave o con l&#39;esposizione ai raggi UV prima dell&#39;uso. Per una cultura di cellule aderenti, mettere un bicchiere coperchio tondo 12 millimetri sterilizzati in un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti in condizioni asettiche. </li><li> Rivestire il vetro di copertura per 10 s con 500 microlitri di 0,002% di poli-L-lisina (PLL). Aspirare la soluzione e asciugare per 10-15 min. </li><li> Aggiungere 500 ml di soluzione di laminina (5 mg / mL). Incubare il vetro di copertura per 1 ora a 37 ° C. </li><li> Aspirare il laminina e aggiungere 500 ml di mezzo di differenziazione o medio NSC (controllo indifferenziata). </li><li> Per il saggio di differenziazione, prendere un 100-200 micron sfera con una punta di 200 microlitri sotto il microscopio. Inserisci5-10 neurospheres a ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti e coltura per 7-10 giorni in terreno di differenziamento. </li><li> Per analizzare neurosfere indifferenziate, aggiungere 5-10 neurosfere a ciascun pozzetto di una piastra e coltura a 24 pozzetti per 1-2 giorni in media NSC. Neurosfere allegate diffondere e crescere come monostrato (Figura 2B). </li><li> Dopo aver rimosso attentamente il mezzo, fissare le cellule con 4% paraformaldeide (PFA) in PBS per 15 minuti a RT, e poi lavare con PBS due volte per 5 minuti a temperatura ambiente. La piastra può essere conservato a 4 ° C per 1-2 mesi. NOTA: per visualizzare le cellule staminali / progenitrici neurali in media NSC e cellule differenziate in terreno di differenziamento, eseguire immunostaining contro Nestin (staminali neurali / marcatore di cellule progenitrici), β-tubulina III (TUJ1 monoclonale, marcatore neuronale), GFAP (fibrillare gliale Acidic Protein , marcatore astrociti), e O4 (marcatore oligodendrociti) (Figura 2B-e). Per analizzare le ciglia, eseguire immunostaining contro Arl13b (CI primariolia marker) e Gpr161 (GPCR ciliare) (Figura 3). </li><li> Montare il vetro di copertura con soluzione di montaggio su un vetrino. Inclinare il vetrino per rimuovere la soluzione in eccesso. </li></ol> 3. Analisi di Ciliogenesis in Neurosfere <ol><li> Per analizzare cellule in neurosfere intatte mediante immunocolorazione, trasferimento 1 ml di terreno di coltura contenente più neurospheres ad una provetta da 1,5 ml e centrifugare a 500 xg per 8 min. Fissare le sfere con 4% (PFA) dopo aver rimosso il mezzo per 15 minuti e lavare con PBS. Spin down sfere a 500 xg per 8 minuti, rimuovere il surnatante e incubare le sfere O / N con 30% saccarosio a 4 ° C. </li><li> Eliminare il surnatante utilizzando un mL punta 1 e aggiungere 500 ml di soluzione di ottobre con un taglio di 1 punta mL. Tagliare il bordo della punta di allargare l&#39;apertura, come PTOM viscoso. </li><li> Trasferire la soluzione contenente i Ottobre neurosfere in uno stampo di plastica monouso di congelamento (10 mm x 10 mm x 5 mm). </li><li> Congelare il mvecchio in ghiaccio secco per almeno 15 min. </li><li> (Opzionale) interrompere l&#39;esperimento e memorizzare lo stampo in un congelatore C -80 ° fino a 1 anno. </li><li> Tagliare le sezioni con un criostato; lo spessore delle sezioni deve essere di 15-30 um. </li><li> Per visualizzare le ciglia primario in un neurosfere, eseguire immunostaining contro Arl13b (Figura 4). </li></ol> 4. Cultura e Passaggio di neurosfere e NSC aderenti <ol><li> Passage le neurosfere mentre la dimensione della sfera è tra 100-200 micron; quando le neurosfere sono troppo grandi (300 micron o superiore), non sono l&#39;ideale per gli esperimenti. </li><li> Trasferire le neurosfere in un tubo da 50 ml usando una punta mL 1 e centrifugare a 500 xg per 8 min. </li><li> Scartare il surnatante mediante un aspiratore, aggiungere 500 ml di 0,05% tripsina-EDTA in PBS, e incubare per 5 min a 37 ° C. La quantità di tripsina varia a seconda del numero di sfere. </li><li> Aggiungere 500 microlitri di media siero e delicatamente il tubot 20 volte con una punta mL 1. </li><li> Spin down a 500 xg per 8 minuti. Eliminare il surnatante utilizzando un mL punta 1 e aggiungere 1 ml di terreno di base. </li><li> (Opzionale) Se detriti cellulari o indissociate neurosfere si vedono passare le cellule attraverso una cella di 70 micron-filtro. </li><li> Passaggio le cellule in 10 cm piatto ad una densità di 10.000 cellule / cm 2 in media NSC; le cellule saranno pronti per il prossimo passo, dopo una settimana. </li><li> (Facoltativo) Per congelare le cellule, aggiungere il congelamento medio di generare 500.000 a 1.000.000 cellule / ml sospensione. Congelare le cellule utilizzando contenitori crio-congelamento; neurosfere indissociate possono anche essere congelati. </li><li> Per la coltura aderente, dillute le cellule a 50.000 cellule / cm 2 sul PLL- e coprioggetto con media NSC e cultura laminina rivestite per 1-2 giorni. </li></ol> 5. La fame e analisi di Cilia <ol><li> Preparare mezzo inedia (Tabella 1). </li><li> 1-2 giorni dopo l&#39;iniziale plCORTEGGIAMENTO di cellule aderenti dopo la dissociazione, il cambiamento medio NSC in un pozzetto (controllo) e media fame in un altro pozzo (esperimento). </li><li> Coltura le cellule aderenti per 24 h. </li><li> Fissare le cellule con 4% PFA in PBS per 15 minuti a RT e lavare due volte con PBS per 5 minuti ciascuno a RT. </li><li> (Opzionale) interrompere l&#39;esperimento e memorizzare le piastre a 24 pozzetti con coprioggetto in PBS a 4 ° C per 1-2 mesi. </li><li> Eseguire un protocollo di immunofluorescenza per la colorazione 7, 50. </li><li> Montare i coprioggetti con soluzione di montaggio. Asciugare il vetrino O / N a temperatura ambiente al buio. </li><li> Acquisire immagini su un microscopio composto all&#39;ingrandimento necessario. Utilizzare un microscopio, una macchina fotografica, e gli obiettivi (40X / 1.3 olio e 63X / 1.4 olio), controllata utilizzando il software accompagnato. Prendere sufficienti z sezioni a 0,5-0,8 micron intervalli (Figura 5). </li><li> Per l&#39;analisi quantitativa della localizzazione in ciliarecellule aderenti, acquisiscono pile di immagini dal 3-8 campi consecutivi con cellule confluenti, cercando nel canale DAPI. Quantificare il numero di ciglia primarie utilizzando ImageJ / Figi. In genere, utilizzare la funzione &quot;contatore cella&quot; nel ImageJ Plugin&gt; Analizzare finestra di dialogo per contare le cellule con cilia GPCR-positivi; proiezioni massime da pile di immagini possono essere esportati da ImageJ / Fiji.Use simile intensità dell&#39;immagine ei parametri di contrasto per tutte le immagini dello stesso esperimento per il conteggio e scopi esportazione. </li></ol> 6. La trasfezione di neurosfere <ol><li> Aderire dissociato cellule di vetrini per 24 h. Utilizzare una densità cellulare tipicamente tra 75.000 e 150.000 cellule in 500 microlitri di NSC media in un singolo pozzetto di una piastra da 24 pozzetti. </li><li> Mescolare 25 ml di mezzo di siero ridotto e 1,5 ml di reagente di trasfezione in un mL microtubo 0,5 vortex per 5 s. </li><li> Aggiungere 2,5 mg di DNA plasmidico privo di endotossine ad un separato 0,5 ml microtube contenente 25 ml di mezzi di siero ridotto e mescolare nel vortex per 5 s. </li><li> Aggiungere 1 ml di reagente di trasfezione al secondo DNA provetta contenente e mescolare nel vortex per 5 s. </li><li> Aggiungere il composto dal tubo di DNA contenenti alla prima provetta e mescolare pipettando. </li><li> Incubare la miscela per 10-15 minuti a temperatura ambiente. Dopo l&#39;incubazione, aggiungere delicatamente la goccia a goccia mix trasfezione ai pozzetti in cima alla media NSC (500 pl / pozzetto). </li><li> Cambiare il mezzo 24 h dopo la trasfezione per il controllo di media (media NSC) o medio fame (500 pl / pozzetto). </li><li> Fissare le cellule cambiando il mezzo di 4% PFA dopo 24 he eseguire immunostaining; tipicamente, fino ad un&#39;efficienza di transfezione 10% è ottenuto usando questo protocollo. </li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

Qui, descriviamo un metodo per generare e mantenere colture di neurosfere da SVZ topo adulto. Alcuni punti pertinenti riguardanti le culture sono i seguenti. In primo luogo, le dimensioni delle sfere sono tipicamente tra 50 - 200 um. Nella nostra esperienza, quando un neurosfere diventa più grande di 300 micron di diametro, il momento ottimale per passaging è stato mancato. Queste sfere più grandi contengono cellule morte nel nucleo. In secondo luogo, come neurosfere sono comunemente usati per studiare le cellule sta...

Cilio primario è un compartimento subcellulare dinamica microtubuli-based che funziona come antenna sensoriale nel coordinare percorsi di segnalazione cellulare, tra cui la via di Sonic Hedgehog (Shh) durante lo sviluppo embrionale neuronale 1, 2, e compartimentato segnalazione subcellulare nell&#39;adulto funzione neuronale 3, 4 . Segnalazione componenti di queste vie, come il recettore Patched Shh 5; la via attivatore Smoothened (SMO) 6; e Gpr161 7, un recettore orfano accoppiato alla proteina G (GPCR) che regola negativamente il pathway Shh, localizzarsi a cilia in modo dinamico. GPCR Molteplici sono stati segnalati per localizzare alle ciglia nei neuroni nel cervello 7, 8, 9, 10 </sup&gt;, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Difetti di cilia e vie di segnalazione cilia generata influenzano molteplici tessuti e sono noti collettivamente come ciliopatie 17, 18, 19. Lo spettro malattia ciliopathy frequentemente include difetti neurologico, quali difetti craniofacciali 20, 21, 22. Inoltre, ciglia primarie nei neuroni ipotalamici regolare percorsi sazietà centrali, e difetti provocare obesità centrale 23, mirroring obesità in ciliopatie sindromici come Bardet Biedel sindrome 24. Inoltre, recettore neuropeptide segnalazione in cilia regola centrAl sazietà Percorsi di 11, 14. Localizzazione ciliare ciclasi III (ACIII) e GPCR come recettore della somatostatina 3 in neuroni ippocampali provocare difetti di riconoscimento dell&#39;oggetto nuovi e deficit di memoria 25, 26 e parallela una mancanza di integrità ciliare 27. Gli aspetti dello sviluppo di segnalazione cilia generati sono strettamente legate alla omeostasi tissutale; in particolare, cilia sono importanti per la progressione di medulloblastomas Shh-sottotipo derivanti da progenitori dei granuli nel cervelletto 28, 29. Così, cilia primarie svolgono un ruolo importante durante embrionale, postnatale e adulta sviluppo e la funzione neuronale. Neurali cellule staminali (NSC) risiedono nella zona sottoventricolare (SVZ) del ventricolo laterale, la zona subgranulare del giro dentato dell&#39;ippocampo, ezona ventricolare del terzo ventricolo nell&#39;ipotalamo nei mammiferi 30, 31, 32. NSC sono multipotenti, possiedono la capacità di auto-rinnovamento, e sono importanti per lo sviluppo del cervello e la medicina rigenerativa 30. La maggior parte NSC nella SVZ sono quiescenti e possiedono un cilium primario solitaria che, in molti casi, si estende verso il ventricolo laterale 33. I segnali cilium primarie tramite la localizzazione dei vari recettori, inducendo risposte cellulari a valle, in particolare in relazione alla Shh, TGFp, e del recettore tirosina chinasi vie 2, 34, 35, 36. Poiché cilia primarie estendono nel ventricolo laterale, si ipotizza che cilia primaria rilevare citochine nel liquido cerebrospinale (CSF) per attivare NSC 37 </sup&gt;. Studi recenti suggeriscono che la via di segnalazione Shh e ciglia primarie sono fondamentali per l&#39;attivazione delle cellule staminali nella riparazione e rigenerazione di tessuti multipli, tra l&#39;epitelio olfattivo, polmone, rene e 38, 39, 40, 41. Tuttavia, i meccanismi mediante i quali CSF comunica con NSC e se cilia primaria sono coinvolti non sono noti. NSC aderenti in coltura sono ciliato; localizzare componenti della via Shh, come Smo e Gpr161 in cilia; e sono Shh reattivo 42. Così, NSC possono servire come un importante sistema modello per studiare il percorso Shh, il traffico ciliare, e percorsi di differenziazione neuronale. Inoltre, i neuroni differenziati da NSC possono essere utilizzati anche per saggi traffico ciliare. Neurosfere sono costituiti da gruppi di cellule fluttuanti derivanti dalla proliferazione di neural cellule staminali / progenitrici che crescono in presenza di fattori di crescita specifici e superfici non adesivo 43, 44. Neurosfere servono come importante in modelli di coltura in vitro per studiare le cellule staminali / progenitrici neurali nello sviluppo normale e malattie 31, 45, 46, 47. Qui, descriviamo un saggio neurosfere-based per la coltura di cellule progenitrici / staminali neurali e di differenziazione in neuroni / glia. Si sottolinea in particolare il traffico di segnalazione componenti cilia di staminali neurali / cellule progenitrici e neuroni differenziati (Figura 1). Al contrario di coltura neuroni primari, neurosfere primarie sono relativamente facili da coltura, sono suscettibili di passaggi multipli e congelare-disgelo, e possono differenziarsi in neuroni / glia. È importante sottolineare che abbiamo stabilito che neurale neurosfere di derivazionecellule staminali / progenitrici e neuroni dissociati sono Ciliated in coltura e localizzare molecole di segnalazione relativi alla funzione ciliare in questi compartimenti. i metodi di coltura neurosfere-based può servire come un sistema modello ideale per lo studio del traffico ciliogenesis e ciliare in NSC e neuroni differenziati.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 mm round cover glass</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545-80&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 % paraformaldehyde</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>19943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95 mm X 15 mm petri dish, slippable lid</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB0875714G</td>
			<td>10 cm dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Affinipure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>711-545-152</td>
			<td>Donkey anti Rabbit, Alexa 488 secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arl13B, Clone N295B/66</td>
			<td>Neuromab</td>
			<td>AB_11000053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17504001</td>
			<td>B27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>ST 40R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vial</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancrease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025-15KU</td>
			<td>Dnase I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418-100ML</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Vinyl Specimen Molds</td>
			<td>Sakura Tissue-Tek Cryomold</td>
			<td>4565</td>
			<td>10 mm X 10 mm X 5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 10&#215;, Modified, without calcium chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1408-500ML</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9026-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G solution</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>mounting solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Z0334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21127</td>
			<td>Goat anti Mouse IgG1, Alexa 555 secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti Mouse IgG2a Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21137</td>
			<td>Goat anti Mouse IgG2a, Alexa 555 secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gpr161</td>
			<td>home made</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human bFGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0291</td>
			<td>FGF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>0.100 mm deep</td>
			<td>improved neubauer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-0500-2</td>
			<td>Isofluorane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm Sarcoma basement membrane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td>Laminin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty</td>
			<td>Nalgene&#160;</td>
			<td>5100-0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17502001</td>
			<td>N2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>Sakura Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td>OCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human EGF protein, CF</td>
			<td>R and D systems</td>
			<td>236-EG-200</td>
			<td>EGF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>14060-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus microscope slide</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution (10X)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4174-100</td>
			<td>Trypsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COSTAR 6 Well Plate, With Lid Flat Bottom Ultra-Low Attachment Surface Polystyrene, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td>ultra-low binding 6 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-tubulin III</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-435P</td>
			<td>TUJ1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using primary neurosphere cultures to study primary cilia

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, postnatal, and adult life. In addition, most differentiated neurons possess primary cilia that house signaling receptors, such as G-protein-coupled receptors, and signaling molecules, such as adenylyl cyclases. The primary cilium determines the activity of multiple developmental pathways, including the sonic hedgehog pathway during embryonic neuronal development, and also functions in promoting compartmentalized subcellular signaling during adult neuronal function. Unsurprisingly, defects in primary cilium biogenesis and function have been linked to developmental anomalies of the brain, central obesity, and learning and memory deficits. Thus, it is imperative to study primary cilium biogenesis and ciliary trafficking in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. However, culturing methods for primary neurons require considerable expertise and are not amenable to freeze-thaw cycles. In this protocol, we discuss culturing methods for mixed populations of neural stem/progenitor cells using primary neurospheres. The neurosphere-based culturing methods provide the combined benefits of studying primary neural stem/progenitor cells: amenability to multiple passages and freeze-thaw cycles, differentiation potential into neurons/glia, and transfectability. Importantly, we determined that neurosphere-derived neural stem/progenitor cells and differentiated neurons are ciliated in culture and localize signaling molecules relevant to ciliary function in these compartments. Utilizing these cultures, we further describe methods to study ciliogenesis and ciliary trafficking in neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. These neurosphere-based methods allow us to study cilia-regulated cellular pathways, including G-protein-coupled receptor and sonic hedgehog signaling, in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons.

Dopo la placcatura le cellule dalla SVZ in terreno NSC per una settimana, neurosfere galleggianti sono stati osservati (Figura 2A). Le dimensioni delle sfere variavano tra 50 e 200 um. Per esaminare se le sfere sono state derivate da cellule staminali / progenitrici neurali, le neurosfere furono piastrate su PLL- e coprioggetto in terreno NSC laminina rivestite per 2 giorni. Sono stati poi immunostained contro il marcatore staminali / progenitrici neurali delle cellule, ...

Watch this Scientific Journal Video about Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia at JoVE.com

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

Cilium principale è di fondamentale importanza nella proliferazione delle cellule progenitrici neurali, la differenziazione neuronale e la funzione neuronale adulta. Qui, si descrive un metodo per studiare ciliogenesis e il traffico di segnalazione proteine ​​di cilia nelle cellule staminali / progenitrici neurali e neuroni differenziati utilizzando colture di neurosfere primarie.

Utilizzando colture di neurosfere primarie al primario dello studio Cilia

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

using-primary-neurosphere-cultures-to-study-primary-cilia

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.3K Views.  University of Texas Southwestern Medical Center.  Cilium principale è di fondamentale importanza nella proliferazione delle cellule progenitrici neurali, la differenziazione neuronale e la funzione neuronale adulta. Qui, si descrive un metodo per studiare ciliogenesis e il traffico di segnalazione proteine ​​di cilia nelle cellule staminali / progenitrici neurali e neuroni differenziati utilizzando colture di neurosfere primarie. 

Video: Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and Schwann cells in the peripheral nervous system (PNS). We use an in vitro myelination assay, an established model for studying CNS myelination in vitro. To do this, oligodendrocyte precursor cells (OPCs) are added to the purified primary rodent dorsal root ganglion (DRG) neurons to form myelinating co-cultures. In order to specifically interrogate the roles that particular proteins expressed by oligodendrocytes exert upon myelination we have developed protocols that selectively transduce OPCs using the lentivirus overexpressing wild type, constitutively active or dominant negative proteins before being seeded onto the DRG neurons. This allows us to specifically interrogate the roles of these oligodendroglial proteins in regulating myelination. The protocols can also be applied in the study of other cell types, thus providing an approach that allows selective manipulation of proteins expressed by a desired cell type, such as oligodendrocytes for the targeted study of signaling and compensation mechanisms. In conclusion, combining the in vitro myelination assay with lentiviral infected OPCs provides a strategic tool for the analysis of molecular mechanisms involved in myelination.

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Here we present protocols that offer a flexible and strategic foundation for virally manipulating oligodendrocyte precursor cells to overexpress proteins of interest in order to specifically interrogate their role in oligodendrocytes via the in vitro model of central nervous system myelination.

Produzione e l&#39;uso di Lentivirus a celle selettivamente trasdurre primaria Oligodendrocyte precursore<em&gt; In Vitro</em&gt; Saggi mielinizzazione

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop within the uterus. A newly developed ex vivo upright droplet culture method provides an attractive alternative to studies performed in utero. The ex vivo droplet culture provides the ability to examine and manipulate cellular interactions and diverse signaling pathways through use of various blocking and activating compounds; additionally, the effects of various pharmacological reagents on the development of specific organs can be studied without unwanted side effects of systemic drug delivery in utero. As compared to other in vitro systems, the droplet culture not only allows for the ability to study three-dimensional morphogenesis and cell-cell interactions, which cannot be reproduced in mammalian cell lines, but also requires significantly less reagents than other ex vivo and in vitro protocols. This paper demonstrates proper mouse fetal organ dissection and upright droplet culture techniques, followed by whole organ immunofluorescence to demonstrate the effectiveness of the method. The ex vivo droplet culture method allows the formation of organ architecture comparable to what is observed in vivo and can be utilized to study otherwise difficult-to-study processes due to embryonic lethality in in vivo models. As a model application system, a small-molecule inhibitor will be utilized to probe the role of vascularization in testicular morphogenesis. This ex vivo droplet culture method is expandable to other fetal organ systems, such as lung and potentially others, although each organ must be extensively studied to determine any organ-specific modifications to the protocol. This organ culture system provides flexibility in experimentation with fetal organs, and results obtained using this technique will help researchers gain insights into fetal development.

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

The&#160;ex vivo&#160;upright droplet culture is an alternative to current&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo&#160;experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.

Utilizzando<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Upright Droplet Culture di interi organi fetali per studiare i processi evolutivi durante mouse Organogenesi

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell lines. However, primary cell cultures usually have a finite life span and need to be frequently re-established. Fibroblasts are an easily accessible source of primary cells. Here, we discuss a simple and quick experimental procedure to establish primary fibroblast cultures from ears and tails of mice. The protocol can be used to establish primary fibroblast cultures from ears stored at RT for up to 10 days. When the protocol is carefully followed, contaminations are unlikely to occur despite the use of non-sterile tissue stored for extended time in some cases. Fibroblasts proliferate rapidly in culture and can be expanded to substantial numbers before undergoing replicative senescence.

We describe a simple and quick experimental procedure for generating primary fibroblasts from the ears and tails of mice. The procedure does not require special animal training and can be used for the generation of fibroblast cultures from ears stored at RT for up to 10 days.

Generazione di primaria fibroblasti culture da orecchio e coda tessuti di topo

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density centrifugation, media gradient isolation and immunomagnetic purification. As observed in vivo, mononucleated villous cytotrophoblast cells in primary culture differentiate into multinucleated syncytiotrophoblast cells after 72 hr. Compared to normoxia (8% O2), villous cytotrophoblast cells that undergo hypoxia/reoxygenation (0.5% / 8% O2) undergo increased oxidative stress and intrinsic apoptosis, similar to that observed in vivo in pregnancy complications such as preeclampsia, preterm birth, and intrauterine growth restriction. In this context, primary villous trophoblasts cultured under hypoxia/reoxygenation conditions represent a unique experimental system to better understand the mechanisms and signalling pathways that are altered in human placenta and facilitate the search for effective drugs that protect against certain pregnancy disorders. Human villous trophoblasts produce melatonin and express its synthesizing enzymes and receptors. Melatonin has been suggested as a treatment for preeclampsia and intrauterine growth restriction because of its protective antioxidant effects. In the primary villous cytotrophoblast cell model described in this paper, melatonin has no effect on trophoblast cells in normoxic state but restores the redox balance of syncytiotrophoblast cells disrupted by hypoxia/reoxygenation. Thus, human villous trophoblast cells in primary culture are an excellent approach to study the mechanisms behind the protective effects of melatonin on placental function during hypoxia/reoxygenation.

This manuscript presents a unique in vitro model of immunopurified human villous cytotrophoblast cells cultured under hypoxia/reoxygenation. This model is suitable to study the protective effects of promising treatments, such as melatonin, on pregnancy complications associated with increased oxidative stress and altered placental function.

Umana Trophoblast primaria coltura cellulare modello per studiare gli effetti protettivi della melatonina contro ipossia / riossigenazione Disruption-indotta

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density ...

Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells, represent a unique type of undifferentiated cells with promise in tissue engineering and for reprogramming into iPSC for future pediatric interventions and stem cell banking. The protocol presented here describes an optimized procedure for extracting and culturing primary amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells and generating episomal induced pluripotent stem cells from these cells in fully chemically defined culture conditions utilizing human recombinant vitronectin and the E8 medium. Characterization of the new lines by applying stringent methods &#8211; flow cytometry, confocal imaging, teratoma formation and transcriptional profiling &#8211; is also described. The newly generated lines express markers of embryonic stem cells &#8211; Oct3/4A, Nanog, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4 &#8211; while being negative for the SSEA-1 marker. The stem cell lines form teratomas in scid-beige mice in 6-8 weeks and the teratomas contain tissues representative of all three germ layers. Transcriptional profiling of the lines by submitting global expression microarray data to a bioinformatic pluripotency assessment algorithm deemed all lines pluripotent and therefore, this approach is an attractive alternative to animal testing. The new iPSC lines can readily be used in downstream experiments involving the optimization of differentiation and tissue engineering.

This protocol describes the reprogramming of primary amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells into induced pluripotent stem cells using a non-integrating episomal approach in fully chemically defined conditions. Procedures of extraction, culture, reprogramming, and characterization of the resulting induced pluripotent stem cells by stringent methods are detailed.

Riprogrammazione primario del liquido amniotico e le celle a membrana di pluripotenza in condizioni prive di Xeno

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic ...

Isolation and Characterization of Primary Rat Valve Interstitial Cells: A New Model to Study Aortic Valve Calcification

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in the elderly and end-stage renal disease (ESRD) patients, who commonly suffer from hyperphosphatemia and hypercalcemia. At present, there are no medication therapies that can stop its progression. The mechanisms that underlie this pathological process remain unclear. The aortic valve leaflet is composed of a thin layer of valve endothelial cells (VECs) on the outer surfaces of the aortic cusps, with valve interstitial cells (VICs) sandwiched between the VECs. The use of a rat model enables the in vitro study of ectopic calcification based on the in vivo physiopathological serum phosphate (Pi) and calcium (Ca) levels of patients who suffer from hyperphosphatemia and hypercalcemia. The described protocol details the isolation of a pure rat VIC population as shown by the expression of VIC markers: alpha-smooth muscle actin (&#945;-SMA) vimentin and tissue growth factor beta (TGF&#946;) 1 and 2, and the absence of cluster of differentiation (CD) 31, a VEC marker. By expanding these VICs, biochemical, genetic, and imaging studies can be performed to study and unravel the key mediators underpinning CAVD.

This protocol describes the isolation, culture, and calcification of rat-derived valve interstitial cells, a highly physiological in vitro model of calcific aortic valve disease (CAVD). Exploitation of this rat model facilitates CAVD research in exploring the cell and molecular mechanisms that underlie this complex pathological process.

Valvola di isolamento e caratterizzazione del ratto primario cellule interstiziali: un nuovo modello per studiare la calcificazione della valvola aortica

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in ...

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. In addition, keratinocytes play an essential role in the initiation, maintenance, and regulation of epidermal immune responses by being part of the innate immune system responding to antigenic stimuli in a fast, nonspecific manner. Here, we describe a protocol for isolation of primary human keratinocytes from adult skin, and demonstrate that these cells respond to calcium-induced terminal differentiation, as measured by an increased expression of the differentiation marker involucrin. In addition, we show that the isolated keratinocytes are responsive to IL-1&#946;-induced activation of intracellular signaling pathways as measured by the activation of the p38 MAPK pathway. Taken together, we describe a method for isolation and culturing of primary human keratinocytes from adult skin. Because the keratinocytes are the predominant cell type in the epidermis, this method is useful to study molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

The human skin acts as a first line of defense against the external environment. We present a method for isolating primary human keratinocytes from adult skin. These isolated keratinocytes are useful in numerous experimental setups, and are a highly suitable model for studying molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

Generazione e la coltura dei Keratinocytes umani primari da pelle adulta

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to manipulate gene expression in organoids have made limited progress in this arena. While CRISPR/Cas9 technology allows for precise genome editing of cells for organoid generation, this strategy requires extensive selection and screening by sequence analysis, which is both time-consuming and costly. Here, we provide a detailed protocol for efficient viral transduction of intestinal organoids. This approach is rapid and highly efficient, thus decreasing the time and expense inherent in CRISPR/Cas9 technology. We also present a protocol to generate frozen sections from intact organoid cultures for further analysis with immunohistochemical or immunofluorescent staining, which can be used to confirm gene expression or silencing. After successful transduction of viral vectors for gene expression or silencing is achieved, intestinal stem cell and crypt function can be rapidly assessed. Although most organoid studies employ in vitro assays, organoids can also be delivered to mice for in vivo functional analyses. Moreover, our approaches are advantageous for predicting therapeutic responses to drugs because currently available therapies generally function by modulating gene expression or protein function rather than altering the genome.

We describe step-by-step instructions to: 1) efficiently engineer intestinal organoids using magnetic nanoparticles for lenti- or retroviral transduction, and, 2) generate frozen sections from engineered organoids. This approach provides a powerful tool to efficiently alter gene expression in organoids for investigation of downstream effects.

Ingegneria genetica degli organiidi intestinali dei topi primari utilizzando vettori virali magnetici di trasduzione nanoparticella per la sezionamento congelato

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a hallmark of various pathophysiological conditions including tumor suppression, tissue remodeling and aging. The inducers of cellular senescence in vivo are still poorly characterized. However, a number of stimuli can be used to promote cellular senescence ex vivo. Among them, most common senescence-inducers are replicative exhaustion, ionizing and non-ionizing radiation, genotoxic drugs, oxidative stress, and demethylating and acetylating agents. Here, we will provide detailed instructions on how to use these stimuli to induce fibroblasts into senescence. This protocol can easily be adapted for different types of primary cells and cell lines, including cancer cells. We also describe different methods for the validation of senescence induction. In particular, we focus on measuring the activity of the lysosomal enzyme Senescence-Associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-gal), the rate of DNA synthesis using 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine (EdU) incorporation assay, the levels of expression of the cell cycle inhibitors p16 and p21, and the expression and secretion of members of the Senescence-Associated Secretory Phenotype (SASP). Finally, we provide example results and discuss further applications of these protocols.

Here, we discuss a series of protocols for induction and validation of cellular senescence in cultured cells. We focus on different senescence-inducing stimuli and describe the quantification of common senescence-associated markers. We provide technical details using fibroblasts as a model, but the protocols can be adapted to various cellular models.

Induzione e convalida della senescenza cellulare in cellule umane primarie

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical applications. The conventional isolation method of human keratinocytes involves a two-step sequential enzymatic digestion procedure, which has been proven to be inefficient in generating primary cells from adult tissues due to the low cell recovery rate and reduced cell viability. We recently reported an advanced method to isolate human primary epidermal progenitor cells from skin tissues that utilizes the Rho kinase inhibitor Y-27632 in the medium. Compared with the traditional protocol, this new method is simpler, easier, and less time-consuming, and increases epithelial stem cell yield and enhances their stem cell characteristics. Moreover, the new methodology does not require the separation of the epidermis from the dermis, and, therefore, is suitable for isolating cells from different types of adult tissues. This new isolation method overcomes the major shortcomings of conventional methods and is more suitable for producing large numbers of epidermal cells with high potency both for laboratory and for clinical applications. Here, we describe the new method in detail.

Here we present a protocol to efficiently isolate primary human keratinocytes from adult skin tissues. This method simplifies the conventional procedure by using the ROCK Inhibitor Y-27632 in the inoculation medium to spontaneously separate epidermal cells from dermal cells.

Un metodo semplificato ed efficiente per isolare i Keratinocytes umani primari dal tessuto pelle adulta

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Utilizzando colture di neurosfere primarie al primario dello studio Cilia

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video

Produzione e l'uso di Lentivirus a celle selettivamente trasdurre primaria Oligodendrocyte precursore

Utilizzando