Ringraziamo Andreas Radbruch per le discussioni di valore. Siamo grati a Sabine Gruczek, Patrick Thiemann e Manuela Ohde per l&#39;assistenza con la cura degli animali e Robert Günther per un&#39;eccellente assistenza tecnica. Ringraziamo i nostri valutatori qualificati Laura Oehme, Jannike Bayat-Sarmadi, Karolin Pollok, Katrin Roth, Firenze Pache e Katharina Horn per la valutazione dei campioni istologici e Randy Lindquist per revisione del manoscritto. Ringraziamo J. e N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, Arizona, Stati Uniti d&#39;America per gli anticorpi MBP-specifici. Questo lavoro è stato sostenuto dalla DFG HA5354 / 4-1, da Jimi-una sovvenzione nucleo DFG rete impianto per la microscopia intravitale e TRR130 / TP17 e DFG PER 2165 (HA5354 / 6-1) per AEHSZ è stata sostenuta dalla Max Planck Internazionale Scuola per le Malattie Infettive e Immunologia (IMPRS-IDI), Berlino.

Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dai comitati statali appropriate per il benessere degli animali (Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlino) e sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e le disposizioni vigenti (licenza esperimento animale G0194 / 11). 1. Generazione di topi fluorescente Midollo Osseo chimerici NOTA: La generazione di midollo osseo fluorescente topi chimerici per visualizzare le cellule stromali del midollo osseo viene eseguita come descritto prima delle 9. <ol><li> Inizia il trattamento di Del-Cre x topi ROSA-tdRFP (topi che esprimono la proteina tandem rosso fluorescente (tdRFP) ubiquitariamente 11-13) per prepararli per irraggiamento. In alternativa, utilizzare qualsiasi altro ceppo con l&#39;espressione ubiquitaria di proteina fluorescente. Somministrare 1 mg / ml di neomicina e 1 mg / ml di vitamine (A, D3, E, C) attraverso l&#39;acqua potabile due giorni prima irradiazione. </li><li> Irradiare topi due volte con 3,8 grigio con un Cesio-137 gamma-irradiatore wisottile un intervallo di 3 ore. Per questo, posizionare topi in una gabbia torta irraggiamento adatto per il rispettivo irradiatore. NOTA: Per l&#39;irradiazione dei topi, il nostro Istituto non richiede anestesia. Seguire le politiche istituzionali locali riguardanti l&#39;anestesia per l&#39;irradiazione. Trattare gli animali con 5 mg / kg per via sottocutanea di carprofen (sc) al giorno dopo l&#39;irradiazione, se ci sono segni di dolore. </li><li> Il giorno successivo, ricostituire topi da una iniezione endovenosa di 3 x 10 6 cellule di midollo osseo ottenuti da ossa lunghe di C57BL / 6 topi donatori nel buffer di trasferimento 9. Mantenere i topi su neomicina e vitamine per un massimo di 2 settimane e monitorare il loro benessere e il peso durante questo periodo. Attendere almeno 4 settimane per consentire la ricostituzione del sistema immunitario prima di iniziare i trattamenti sperimentali specifici (ad esempio, l&#39;immunizzazione) 9. </li><li> Sacrificio topi e metterli su una tavola di dissezione, sterilizzare le gambe con il 70% di etanolo. Euthanize topi in conformità con le politiche istituzionali locali. Il nostro Istituto svolge dislocazione cervicale. </li><li> Utilizzare pinze e forbici per rimuovere la pelle dalle cosce. Rimuovere il tessuto muscolare per esporre l&#39;osso femorale. Luxate l&#39;osso femorale dal dell&#39;anca e del ginocchio con pinze e forbici. Fare attenzione a non rompere o tagliare l&#39;osso. </li><li> Rimuovere accuratamente restanti grandi pezzi di tessuto muscolare e la cartilagine dall&#39;osso con le forbici. Rimuovere restante tessuto muscolare strofinando l&#39;osso con la carta velina di laboratorio. Raccogliere le ossa pulite in una capsula di Petri con tampone fosfato (PBS). </li><li> Fissare intere ossa femorali in 4% paraformaldeide (PFA, microscopia elettronica-grade) per 4 - 6 ore. </li><li> Eliminare PFA e incubare le ossa nel 10% di saccarosio in PBS O / N. Il giorno successivo, incubare le ossa nel 20% di saccarosio O / N. Il giorno dopo, incubare le ossa di 30% di saccarosio O / N. </li></ol> 2. criosezionamento of Bones NOTA: Dopo 16-24 ore nel 30% di saccarosio, congelare le ossa e cryosection loro secondo il metodo del nastro di Kawamoto 14,15. <ol><li> Preparare un grande bicchiere (2,000 ml volume) con ghiaccio secco e acetone (circa 2: 1 rapporto in volume, ad esempio, 400 ml di ghiaccio secco e 200 ml di acetone) sotto una cappa aspirante. Mettere un piccolo bicchiere (150-250 ml di volume) con esano interna (30 - 50 ml circa). Attendere la miscela si raffreddi (circa 10 min, fino a visualizzare gelo all&#39;esterno della grande becher). </li><li> Riempire ¾ della cryomold marcato con Super Cryoembedding Medium (SCEM); posizionare con cura le ossa dentro fino a quando non sono completamente immersi, facendo attenzione che non si tocchino i bordi dello stampo. Con grandi pinze tenere la cryomold nel becher con il fondo dello stampo sfiora la superficie del esano. <ol><li> Sia i bordi esterni del congelamento SCEM (indicato da opacità, questo richiede circa 15 sec). Poi rilasciare completamente lo stampo in esano e lasciarlo freEze 1 - 2 min. Estrarre il campione congelato e avvolgere nel cellophane e poi un foglio di alluminio (per proteggere il campione dalla disidratazione e per evitare l&#39;esposizione alla luce). Conservare a -80 ° C fino criosezionamento. </li></ol></li><li> Per criosezionamento delle ossa femorali utilizzare uno standard di lame microtomo e microtomo per tessuti duri. </li><li> Impostare la temperatura del campione e la lama del microtomo a -24 ° C. Lasciate riposare il campione all&#39;interno del microtomo per circa 15 minuti prima del taglio. <ol><li> Fissare il blocco campione al porta-campioni di metallo con SCEM o la temperatura ottimale di taglio (OCT) medio. Regolare l&#39;orientamento del blocco se necessario. Tagliare il campione fino all&#39;osso è completamente aperta e il midollo è visibile. Regolare lo spessore della sezione di 7 micron (scartare la prima sezione). </li><li> Fissare un pezzo di nastro Kawamoto con la parte adesiva sulla parte superiore del blocco campione utilizzando una spatola di legno cervi rivestita in cuoio. Successivamente, tagliare il campione e ruotare il nastro in modo che la sezioneposizionato sul lato superiore. Trasferire il nastro di un vetrino con pinze. Fissare il nastro al vetro scorrevole con scotch. </li></ol></li><li> Lasciate sezioni asciutti per almeno 30 minuti e conservare a -80 ° C fino al loro utilizzo. Conservare vetrini non colorati e montati in scatole di diapositive di plastica con distanziali tra singole diapositive in modo da evitare che si attaccano insieme. Macchiato e montati diapositive possono essere conservati fino a una settimana in cartone cartelle di diapositive a 4 ° C. </li></ol> 3. Immagine Collection <ol><li> Scongelare e criosezioni macchia secondo protocolli di immunofluorescenza comuni 9. Includere una macchia nucleare, ad esempio, 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindolo dicloridrato (DAPI) per visualizzare l&#39;integrità dei tessuti. NOTA: Mordente, per esempio, per RFP di visualizzare le cellule stromali (anti-RFP-biotina anticorpi e streptavidina Alexa Fluor 555), eosinofili macchia con topo anti-principale proteina di base (MBP) e anticorpi anti-rat-Alexa Fluor 647 anticorpi cellule B,con il ratto anti-B220-Alexa Fluor 594 anticorpi e PC con la luce anti-κ catena fluoresceina-iso-tiocianato (FITC) e anticorpi catena-FITC luce anti-λ1 (dettagli della procedura di colorazione sono descritti in 9). </li><li> Montare sezioni colorate: mettere una goccia di Fluoromount sulla sezione e poi coprire con un # 1 copertura in vetro antiscivolo, evitando accuratamente la formazione di bolle d&#39;aria. Successivamente, effettuare microscopio confocale a scansione laser con uno strumento equipaggiato con linee laser adatti per la colorazione. </li><li> Al fine di registrare le immagini per l&#39;analisi automatizzata di co-localizzazione di cellule ematopoietiche del midollo osseo con cellule stromali utilizzando lo strumento Wimasis, applicare le seguenti impostazioni: <ol><li> Utilizzare una lente obiettivo 20X e un campo visivo di 708,15 x 708,15 micron. Per l&#39;analisi automatizzata, mantenere le dimensioni di tutte le immagini coerenti a 2.048 x 2.048 pixel (px) per mantenere i risultati comparabili. </li><li> Registra un canale per strutture stromali (es, </em&gt; 561 linea laser nm), un canale per nuclei (ad esempio, DAPI, 405 nm) e canali aggiuntivi per le cellule ematopoietiche di interesse (ad esempio, 3 canali, 488/594/633 nm per eosinofili, cellule B e PC). </li><li> Registrare le immagini utilizzando la linea media di 4 16. Idealmente, coprono l&#39;intera sezione femorale prendendo immagini adiacenti singoli. In alternativa, scattare foto non adiacenti provenienti da varie regioni del midollo osseo (diafisario e epifisi). NOTA: Fare attenzione a non produrre sovrapposizioni tra immagini adiacenti (per evitare analisi ripetute delle cellule nelle zone di sovrapposizione). </li></ol></li><li> Salvare le immagini in un formato di file immagine al microscopio. Controllare e, se necessario, regolare il contrasto per tutti i canali del software immagine viewer / analisi. </li><li> Export 3 file .jpg per file immagine: un file .jpg per il canale DAPI (formato rosso / verde / blu (RGB), falso codice colore in giallo), un file .jpg per il canale stroma (scala di grigi) e uno .jpg file contenentei canali di cellule ematopoietiche (3 canali al massimo, formato RGB, ad esempio, FITC (PC, falsi colori: verde) / Alexa Fluor 594 (cellule B, falsi colori: blu) / Alexa Fluor 647 (eosinofili, falsi colori: rosso)) . </li></ol> 4. Automated Image Analysis <ol><li> Utilizzare uno strumento di analisi di immagine per eseguire la segmentazione di immagini, la quantificazione di co-localizzazione e dintorni analisi (vedi Discussione). </li><li> Se si utilizzano gli strumenti Wimasis, procedere come segue: <ol><li> Caricare i set di 3 file .jpg per immagine con lo stesso nome del file seguito da una sottolineatura e da un numero che indica il tipo di immagine. </li><li> Utilizzare _1 per il file jpg con le cellule ematopoietiche, _2 per il file .jpg per il canale DAPI, _3 per il file .jpg per il canale stroma. Per esempio: Image1_1.jpg (cellule ematopoietiche), Image1_2.jpg (canale DAPI), e Image1_3.jpg (canale stroma). Carica le immagini attraverso il conto cliente. </li><li> Per contatti cell quantificazionescegliere lo strumento di contatto delle cellule cliccando sul rispettivo campo. Per vicinanze cellule quantificazione, scegliere lo strumento vicinanze cellulare e inserire il raggio vicinanze preferito in micron (che si misura dai bordi delle celle). </li><li> Scarica i risultati. NOTA: I risultati sono forniti come file jpg mostrano le cellule ematopoietiche e il canale stroma i confini degli oggetti rilevati evidenziati, così come file .csv singoli contenenti le misurazioni per ogni immagine, in aggiunta a una sintesi .csv che contiene i dati relativi a tutte le immagini caricate. </li></ol></li><li> Dal contatto misurazioni determinano la frequenza di cellule ematopoietiche (rosso, verde, blu) o cellule a contatto con le cellule stromali, o le frequenze di globuli rossi, verdi, blu o contattando gli altri tipi di cellule ematopoietiche (un esempio è mostrato nella Rappresentante dei risultati , Figura 4). Per determinare le frequenze, dividere i dati di contatto conteggi per immagine dala cella totale conta per immagine. <ol><li> Per gli esperimenti con singoli topi, riassumere i conteggi totali contatto di tutte le immagini da singoli topi e dividere la somma della conta delle cellule totali di tutte le immagini. </li></ol></li><li> Dalle misurazioni vicinanze, determinare la frequenza di cellule rosse, verde o blu all&#39;interno della distanza selezionata da cellule stromali e / o le frequenze di globuli rossi, verdi o blu in prossimità preferito agli altri tipi di cellule ematopoietiche come descritto al punto 4.3 ( vedi anche Rappresentante dei risultati, Figura 4). </li></ol> 5. Simulazione di Random Midollo Osseo Posizionamento <ol><li> Prima di eseguire le simulazioni di posizionamento cellulare casuale sul midollo osseo immagini istologiche analizzate, preparare i seguenti file in anticipo: i file .csv singoli forniti dallo strumento di contatto delle cellule, i file .jpg originali per il canale DAPI ei file .jpg originali per il canale stromale. </li><li> Per effettuaresimulazioni lotti su una serie di immagini (ad esempio, tutte le immagini di una sezione femorale), raccolgono tutti i file originali .jpg (_1, _2 e _3) ei relativi file .csv singoli in una cartella. NOTA: Lo strumento di simulazione per il posizionamento di cellule di midollo osseo casuale è disponibile su richiesta. </li><li> Avviare lo strumento di simulazione, selezionare la casella &quot;Auto-load dati di immagine&quot;. NOTA: Il programma leggerà i conteggi cellulari e dimensione media delle cellule dal file .csv automaticamente. Questi valori vengono visualizzati nelle caselle per &quot;numero Cell&quot; e &quot;size cellulare AVG&quot; (Figura 5A). </li><li> Inserisci il tag comune per i file .csv, cioè, il fattore comune nei loro nomi. Inserire il numero di set di immagini che dovrebbero essere utilizzati per la simulazione in modalità batch. </li><li> Caricare il file .jpg generato dal canale stroma (con il nome del file che termina _3). </li><li> Immettere le impostazioni per la generazione la maschera dal canale DAPI: <ol><li> Seleziona la casella &quot;? Applicare maschera &quot;Impostare la soglia per convertire l&#39;immagine DAPI in una maschera binaria a 10 (gamma 0 - 255). </li><li> Seleziona la casella &quot;8-bit?&quot; Seleziona la casella &quot;Dilatare?&quot; E impostare il grado di dilatazione di 5 px. Seleziona la casella &quot;w / erosione?&quot;. </li><li> Inserire il valore desiderato per il raggio vicinanze (raggio quartiere) utilizzati per l&#39;analisi delle immagini simulate. Per un&#39;immagine di 708,15 x 708,15 micron con una dimensione di 2.048 x 2.048 px (pixel scala xy: 0,346 micron), 29 px corrisponde a 10 micron. </li></ol></li><li> Casella &quot;Usa Otsu?&quot;, Per usare l&#39;algoritmo di Otsu 17 per il rilevamento automatico delle strutture stromali. NOTA: Questo è lo stesso algoritmo utilizzato dallo strumento di contatto e dintorni. Utilizzando lo stesso algoritmo di segmentazione di immagini in analisi automatizzata dell&#39;immagine registrata e l&#39;immagine simulata è cruciale per mantenere i dati comparabili. </li><li> Immettere le impostazioni per le cellule ematopoietiche, che are simulato come forme circolari. NOTA: I numeri di cellulari per i globuli rossi, verdi e blu sono direttamente caricate dal file .csv (vedi anche punto 5.6). <ol><li> Utilizzare lo strumento di simulazione per calcolare il diametro medio in px dei globuli rossi, verdi e blu. Determinare la superficie media di una singola cella, la superficie complessiva di ogni tipo di cellula nell&#39;immagine px diviso per il numero totale di cellule per immagine. Utilizzare l&#39;area media per calcolare il raggio del disco usando la formula. Raddoppiare la distanza per determinare il diametro medio. </li></ol></li><li> Misurare la distribuzione delle dimensioni delle cellule dei tipi di cellule analizzate con qualsiasi software di analisi delle immagini che include funzioni di segmentazione degli oggetti. Determinare σ per tutti i tipi di cellule ematopoietiche (18 e Figura 5B). NOTA: Poiché le distribuzioni dimensionali cella delle celle registrati non sono determinati dalla analisi di immagine automatica, utilizzare una distribuzione gaussiana come approssimazione delle distribuzioni reali. La larghezza di tegli curva di distribuzione è descritto da σ e può essere molto diverso per i vari tipi di cellule. (Per i dettagli, vedere la Figura 5B). <ol><li> Da queste misurazioni, determinare il &quot;dimensioni della cella cutoff&quot;: il diametro in px che descrive l&#39;oggetto più piccolo ancora riconosciuta come cella completo con lo strumento di analisi dell&#39;immagine. </li></ol></li><li> Immettere i parametri nelle rispettive caselle sull&#39;interfaccia utente grafica (Figura 5A). <ol><li> Inserire la dimensione della cella tagliato, cioè, la dimensione minima consentita celle nella simulazione, come diametro px. </li><li> Inserire σ in px per la simulazione della distribuzione delle dimensioni delle cellule per cellule rosse, verde e blu (dal punto 5.9). </li><li> Seleziona la casella &quot;Elimina&quot; nella sottosezione &quot;Celle in Maschera&quot;. Con questa impostazione, il programma sceglierà una nuova posizione per una cella se si sovrappone con almeno un pixel con una zona no-go della maschera. Seleziona la casella &quot;evitare sovrapposizioni cellulare? ̶1; nella sottosezione &quot;esclusione Cell&quot;. </li><li> Inserire la distanza minima consentita tra i centri di due cellule in px. NOTA: La distanza minima deve essere determinato dalle immagini registrate. Erroneamente distanze minime misurate porteranno a / risultati artificiali parziali per il confronto delle immagini registrate e simulati. </li><li> Impostare la massima area di sovrapposizione al 100% se la sovrapposizione è definita dalla distanza minima da centro a centro. </li><li> Impostare lo strumento di simulazione a 1.000 ripetizioni. </li><li> Selezionare la casella &quot;cellule di salvataggio automatico?&quot; Per salvare le coordinate degli oggetti simulati per tutte le ripetizioni di ogni immagine del lotto come file .rect (in formato testo). Selezionare la casella &quot;immagini di salvataggio automatico?&quot; Per salvare un file TIFF per ciascuna immagine simulata. Immettere un tag comune per i file salvati. NOTA: Il &quot;? Cellule di salvataggio automatico&quot; opzione riduce la simulazione in esecuzione il tempo e la dimensione complessiva dei dati, rispetto a quando si salva l&#39;attuale simulato imaGES. I file .rect memorizzare le coordinate delle celle simulati come rettangoli e possono quindi essere convertiti in immagini simulate se necessario. </li></ol></li><li> Avviare la simulazione facendo clic su &quot;Esegui simulazione&quot;. NOTA: Lo strumento di simulazione genera automaticamente un file .csv per 1.000 simulazioni di ogni immagine, compresi i conti di contatto medi e conta vicinanze di globuli rossi, verdi e blu con globuli rossi, verdi, blu, e stromali per ogni serie di simulazioni ripetute . Inoltre, per tutti questi valori, vengono forniti medie dei 1.000 simulazioni con deviazione standard (STD) e l&#39;errore standard della media (SEM). </li><li> Determinare la media frequenza di contatto e le frequenze vicinanze di un gruppo di 1.000 immagini simulate. Per questo, dividere il contatto media e conta vicinanze del conteggio delle cellule registrate per immagine. Confrontare le frequenze ai risultati dell&#39;analisi co-localizzazione automatizzata dell&#39;immagine registrata. </li><li> Applicare STATI appropriateMetodi stical funzione dell&#39;analisi del 19 (per la figura 7, abbiamo usato un Wilcoxon a due code firmato rank test). </li></ol>

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	<li>Kunisaki, Y., Frenette, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secrets+of+the+bone+marrow+niche:+Enigmatic+niche+brings+challenge+for+HSC+expansion.">The secrets of the bone marrow niche: Enigmatic niche brings challenge for HSC expansion.</a> Nat Med. 18, 864-865 (2012).</li><li>Morrison, S. J., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells.">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505, 327-334 (2014).</li><li>Tokoyoda, K., Egawa, T., Sugiyama, T., Choi, B. I., Nagasawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+niches+controlling+B+lymphocyte+behavior+within+bone+marrow+during+development.">Cellular niches controlling B lymphocyte behavior within bone marrow during development.</a> Immunity. 20, 707-718 (2004).</li><li>Cariappa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perisinusoidal+B+cells+in+the+bone+marrow+participate+in+T-independent+responses+to+blood-borne+microbes.">Perisinusoidal B cells in the bone marrow participate in T-independent responses to blood-borne microbes.</a> Immunity. 23, 397-407 (2005).</li><li>Sapoznikov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+clusters+of+dendritic+cells+provide+critical+survival+signals+to+B+cells+in+bone+marrow+niches.">Perivascular clusters of dendritic cells provide critical survival signals to B cells in bone marrow niches.</a> Nat Immunol. 9, 388-395 (2008).</li><li>Tokoyoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Professional+memory+CD4++T+lymphocytes+preferentially+reside+and+rest+in+the+bone+marrow.">Professional memory CD4+ T lymphocytes preferentially reside and rest in the bone marrow.</a> Immunity. 30, 721-730 (2009).</li><li>Mazo, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+is+a+major+reservoir+and+site+of+recruitment+for+central+memory+CD8++T+cells.">Bone marrow is a major reservoir and site of recruitment for central memory CD8+ T cells.</a> Immunity. 22, 259-270 (2005).</li><li>Lin, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+4-1BBL+on+radioresistant+cells+in+providing+survival+signals+through+4-1BB+expressed+on+CD8(+)+memory+T+cells+in+the+bone+marrow.">Contribution of 4-1BBL on radioresistant cells in providing survival signals through 4-1BB expressed on CD8(+) memory T cells in the bone marrow.</a> Eur J Immunol. 42, 2861-2874 (2012).</li><li>Zehentmeier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Static+and+dynamic+components+synergize+to+form+a+stable+survival+niche+for+bone+marrow+plasma+cells.">Static and dynamic components synergize to form a stable survival niche for bone marrow plasma cells.</a> Eur J Immunol. 44, 2306-2317 (2014).</li><li>Nagasawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+niches+in+the+bone+marrow+required+for+B-cell+development.">Microenvironmental niches in the bone marrow required for B-cell development.</a> Nat Rev Immunol. 6, 107-116 (2006).</li><li>Luche, H., Weber, O., Nageswara Rao, T., Blum, C., Fehling, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Faithful+activation+of+an+extra-bright+red+fluorescent+protein+in+'knock-in'+Cre-reporter+mice+ideally+suited+for+lineage+tracing+studies.">Faithful activation of an extra-bright red fluorescent protein in 'knock-in' Cre-reporter mice ideally suited for lineage tracing studies.</a> Eur J Immunol. 37, 43-53 (2007).</li><li>Schwenk, F., Baron, U., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cre-transgenic+mouse+strain+for+the+ubiquitous+deletion+of+loxP-flanked+gene+segments+including+deletion+in+germ+cells.">A cre-transgenic mouse strain for the ubiquitous deletion of loxP-flanked gene segments including deletion in germ cells.</a> Nucleic Acids Res. 23, 5080-5081 (1995).</li><li>Kawamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+new+adhesive+film+for+the+preparation+of+multi-purpose+fresh-frozen+sections+from+hard+tissues,+whole-animals,+insects+and+plants.">Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants.</a> Arch Histol Cytol. 66, 123-143 (2003).</li><li>Kawamoto, T., Kawamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+thin+frozen+sections+from+nonfixed+and+undecalcified+hard+tissues+using+Kawamot's+film+method.">Preparation of thin frozen sections from nonfixed and undecalcified hard tissues using Kawamot's film method.</a> Arch Histol Cytol. 1130 (2012), 149-164 (2012).</li><li>Smith, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+confocal+microscopy.">Basic confocal microscopy.</a> Current protocols in neuroscience / editorial board, Jacqueline N. Crawley ... [et al.]. 2 (Unit 2.2), (2001).</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+threshold+selection+method+from+gray-level+histograms.">A threshold selection method from gray-level histograms.</a> IEEE Trans. Sys., Man., Cyber. 9, 62-66 (1979).</li><li>Hughes, I., Hase, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Measurements and Their Uncertainties: A Practical Guide To Modern Error Analysis. , (2010).</li><li>Quinn, G. P., Keough, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Experimental Design and Data Analysis for Biologists. , (2002).</li><li>Kiel, M. J., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncertainty+in+the+niches+that+maintain+haematopoietic+stem+cells.">Uncertainty in the niches that maintain haematopoietic stem cells.</a> Nat Rev Immunol. 8, 290-301 (2008).</li><li>MacQueen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+Methods+for+classification+and+Analysis+of+Multivariate+Observations.">Some Methods for classification and Analysis of Multivariate Observations.</a> Proceedings of 5th Berkeley Symposium on Mathematical Statistics and Probability Vol. 1. , 666 (1967).</li><li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li><li>Jarjour, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+mapping+reveals+origin+and+dynamics+of+lymph+node+follicular+dendritic+cells.">Fate mapping reveals origin and dynamics of lymph node follicular dendritic cells.</a> J Exp Med. 211, 1109-1122 (2014).</li><li>Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histo-cytometry:+a+method+for+highly+multiplex+quantitative+tissue+imaging+analysis+applied+to+dendritic+cell+subset+microanatomy+in+lymph+nodes.">Histo-cytometry: a method for highly multiplex quantitative tissue imaging analysis applied to dendritic cell subset microanatomy in lymph nodes.</a> Immunity. 37, 364-376 (2012).</li><li>Moreau, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+in+situ+cytometry+uncovers+T+cell+receptor+signaling+during+immunological+synapses+and+kinapses+in+vivo.">Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo.</a> Immunity. 37, 351-363 (2012).</li><li>Siffrin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+partially+reversible+th17+cell-induced+neuronal+dysfunction+in+the+course+of+encephalomyelitis.">In vivo imaging of partially reversible th17 cell-induced neuronal dysfunction in the course of encephalomyelitis.</a> Immunity. 33, 424-436 (2010).</li><li>Shen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+SVZ+stem+cells+lie+in+a+vascular+niche:+a+quantitative+analysis+of+niche+cell-cell+interactions.">Adult SVZ stem cells lie in a vascular niche: a quantitative analysis of niche cell-cell interactions.</a> Cell Stem Cell. 3, 289-300 (2008).</li><li>Danielsson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Euclidian+distance+mapping.">Euclidian distance mapping.</a> Computer Graphics and Image Processing. 14, 21 (1980).</li><li>Tellier, J., Kallies, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+a+home+for+plasma+cells+-+a+niche+to+survive.">Finding a home for plasma cells - a niche to survive.</a> Eur J Immunol. , (2014).</li><li>Winter, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megakaryocytes+constitute+a+functional+component+of+a+plasma+cell+niche+in+the+bone+marrow.">Megakaryocytes constitute a functional component of a plasma cell niche in the bone marrow.</a> Blood. 116, 1867-1875 (2010).</li><li>Rozanski, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+antibody+responses+depend+on+CD28+function+in+bone+marrow-resident+plasma+cells.">Sustained antibody responses depend on CD28 function in bone marrow-resident plasma cells.</a> J Exp Med. 208, 1435-1446 (2011).</li><li>Rodriguez Gomez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basophils+support+the+survival+of+plasma+cells+in+mice.">Basophils support the survival of plasma cells in mice.</a> J Immunol. 185, 7180-7185 (2010).</li><li>Belnoue, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homing+and+adhesion+patterns+determine+the+cellular+composition+of+the+bone+marrow+plasma+cell+niche.">Homing and adhesion patterns determine the cellular composition of the bone marrow plasma cell niche.</a> J Immunol. 188, 1283-1291 (2012).</li><li>Kohler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-CSF-mediated+thrombopoietin+release+triggers+neutrophil+motility+and+mobilization+from+bone+marrow+via+induction+of+Cxcr2+ligands.">G-CSF-mediated thrombopoietin release triggers neutrophil motility and mobilization from bone marrow via induction of Cxcr2 ligands.</a> Blood. 117, 4349-4357 (2011).</li></ol>

Juan Escribano Navarro is affiliated with Wimasis GmbH, Munich, Germany. The other authors have no conflicts of interest to declare.

Nonostante i progressi in moderni metodi di imaging ottico, l&#39;analisi dei dati istologica è ancora spesso ostacolato dalla mancanza di strumenti di quantificazione ei modi, o da analisi parziali che si concentrano su una piccola area di interesse. L&#39;approccio sinergico qui presentato combina analisi dell&#39;immagine che copre l&#39;intera regione di midollo osseo, la segmentazione automatica e rilevamento di oggetti di diversi tipi di cellule ematopoietiche e stromali, analisi co-localizzazione, ed infine uno ...

A causa di recenti sviluppi tecnologici rapidi microscopio, tra cui imaging ottico, l&#39;analisi di cellule nel contesto di tutto il tessuto è diventato sempre più accessibile per immunologi. La caratterizzazione di singole cellule in sospensione rappresenta un metodo prezioso e indispensabile per comprendere la funzione cellulare e molecolare. Tuttavia, l&#39;analisi delle cellule all&#39;interno del loro (micro) ambiente -anatomical è essenziale per la comprensione delle interazioni tra i vari tipi di cellule che collaborano in processi complessi come lo sviluppo delle risposte immunitarie. Mentre è relativamente facile per microscopisti di ottenere informazioni qualitative da immagini, rimane una sfida per quantificare questi dati, in parte a causa del fatto che i metodi di analisi in questo campo sono in ritardo rispetto a quanto è possibile in acquisizione dell&#39;immagine. Molti ricercatori si affidano ancora a conteggio manuale delle cellule nelle loro immagini istologici che richiede tempo,introducendo così una polarizzazione tra i diversi valutatori e ostacolare la replica da parte di altri gruppi. Spesso, una immagine rappresentativa viene scelto per sottolineare una dichiarazione sulla posizione di cellulare o di co-localizzazione in una pubblicazione, il che rende difficile per il lettore a giudicare la rilevanza statistica di un tale evento. Insieme con il fatto che l&#39;intero contenuto informazioni di dati dell&#39;immagine è raramente sfruttata, questo sottolinea la necessità di un approccio più imparziale, veloce e completo per analizzare immagini istologiche. Il midollo osseo è un tessuto complesso, che assume importanti funzioni vitali come organo di ematopoiesi in vertebrati adulti. Oltre ad essere il luogo di nascita di cellule ematopoietiche 1,2 e giocando un ruolo importante nello sviluppo dei linfociti B 3, agisce anche come un luogo in cui vengono avviate le reazioni immunitarie 4 e supporta, le cellule B mature ricircolo 5. Inoltre, il suo ruolo nel mantenere imemoria mmunological è diventato sempre più apprezzato negli ultimi dieci anni, come sono stati trovati per soggiornarvi 6-9 diversi tipi di cellule che costituiscono la memoria immunitaria. Il rapporto tra l&#39;architettura tissutale complesso del midollo osseo e delle sue funzioni rimangono ancora sfuggente. A differenza di organi linfoidi secondari, che sono organizzati in macro-comparti, come le zone delle cellule T e B, il midollo osseo non ha un chiaro macro-compartimentazione. Finora compartimenti distinti nel midollo osseo sono definite dalla loro vicinanza al corticale ossea o vascolare. L&#39;importanza delle varie popolazioni cellulari stromali residenti nel midollo osseo per un certo numero di processi come le cellule staminali di supporto, sviluppo di cellule B o manutenzione di popolazioni di cellule immunitarie memoria (quali cellule plasmatiche lunga durata (PC), CD4 + e CD8 + cellule T di memoria) indica chiaramente che vi sia un certo grado di micro-compartimentalizzazione nel midollo osseo. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Queste osservazioni hanno portato al concetto di nicchie microanatomical distinte, che sono specializzati in alcune funzionalità (staminali mantenimento delle cellule, lo sviluppo delle cellule B in varie fasi, e il mantenimento della memoria immunologica) nel midollo osseo. Anche se sembra esserci una certa eterogeneità tra le nicchie che servono diverse funzioni, alcuni dei fattori prodotte dalle cellule stromali, quali CXC-chemochina legante 12 (CXCL12) o interleuchina 7 (IL-7), sono componenti essenziali per molte di queste nicchie 10. La visualizzazione e la caratterizzazione delle cellule stromali del midollo osseo è difficile a causa delle loro caratteristiche morfologiche con lunghi, sottili estensioni dendritiche formando una rete attraverso il midollo osseo, e la mancanza di marcatori appropriati per discriminare sottopopolazioni stromali. Non è ancora chiaro in quale misura queste nicchie condividono caratteristiche comuni rispetto alla loro compositio cellulare e molecolaren, e quali elementi rendono una certa nicchia unico. Oltre alle cellule stromali, tipi di cellule ematopoietiche hanno dimostrato di giocare un ruolo cruciale fornendo alcuni segnali almeno per alcune delle nicchie. Chiaramente, la complessità della composizione nicchia richiede loro analisi in situ, ed è diventato sempre più importante per immunologi e hematologists per ingrandire osseo microarchitettura ossea, ad esempio, analizzando le relazioni spaziali tra i suoi componenti cellulari. Qui, una strategia per quantificare cellulari co-localizzazione e di vicinato relazioni nel midollo osseo in modo automatizzato e imparziale è presentato. Un flusso di lavoro dettagliate inclusa la generazione di topi chimerici, l&#39;ospitare cellule fluorescenti stromali e cellule ematopoietiche non fluorescenti, preparazione di sezioni istologiche di ossa undecalcified, acquisizione di immagini confocali coprono l&#39;intero osso, così come l&#39;analisi delle immagini automatizzata di c cellulareo-localizzazione e la convalida / discriminazione dal posizionamento casuale per uno strumento di simulazione è fornito (Figura 8).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1864">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:145px;">Company</td>
			<td style="width:155px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:1200px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Neomycin</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:155px;">N6386 SIGMA</td>
			<td>Neomycin trisulfate salt hydrate, EU hazard code: GHS08; www.sigmaaldrich.com</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:365px;">Ursovit AD3EC</td>
			<td style="width:145px;">Serumwerke Bernburg</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>1 ml contains: 50.000 I.E retinyl palmitate,&#160; 5.000 I.E. cholecalciferol, 30 mg tocopheryl acetate, 100 mg ascorbic acid, 1 mg sorbic acid, 200 mg polyoxyl 35 castor oil, 0,5 mg propyl gallate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:365px;">Transfer buffer (100ml PBS, 1ml 1M HEPES, 50U/ml Penicillin/Streptomycin)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:155px;">P4333&#160;&#160; Sigma&#160;&#160;&#160;&#160; H3375&#160;&#160; Sigma&#160;&#160;</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:365px;">4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl hapten conjugated to chicken gamma globulin)</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Chicken gamma globulin (CGG) 100 mg</td>
			<td style="width:145px;">Rockland</td>
			<td style="width:155px;">D602-0100</td>
			<td>www.rockland-inc.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">20 % Paraformaldehyde solution (EM-grade)</td>
			<td style="width:145px;">Science Services</td>
			<td style="width:155px;">15713</td>
			<td>EU hazard codes: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">D(+)-Sucrose</td>
			<td style="width:145px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:155px;">4621.1</td>
			<td>www.carlroth.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Dry ice</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:365px;">Acetone</td>
			<td style="width:145px;">Sigma.Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">179124 SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>EU hazard codes: GHS02, GHS07; www.sigmaaldrich.com</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:365px;">Hexane</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">208752 SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>EU hazard codes: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09; www.sigmaaldrich.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Tissue-Tek cryomolds (standard)</td>
			<td style="width:145px;">Sakura&#160;</td>
			<td style="width:155px;">4557</td>
			<td>25 x 20 x 5 mm; www.sakuraus.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Tissue-Tek O.C.T.</td>
			<td style="width:145px;">Sakura&#160;</td>
			<td style="width:155px;">4583</td>
			<td>&#160;www.sakuraus.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Kawamoto&#39;s SCEM embedding medium</td>
			<td style="width:145px;">Section-Lab, JP</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>http://section-lab.jp/index.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Kawamoto&#39;s cryosection preparation kit&#160;</td>
			<td style="width:145px;">Section-Lab, JP</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>http://section-lab.jp/index.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Kawamoto&#39;s cryofilm type 2C(9)</td>
			<td style="width:145px;">Section-Lab, JP</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>http://section-lab.jp/index.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Microtome blade MX35 Premier Plus, Low Profile</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:155px;">3052835</td>
			<td>L X W: 80 x 8 mm (31.5 x 3.13&#34;), thickness: 0.25 mm (0.01&#34;);www.thermoscientific.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">polyclonal rabbit anti-RFP antibody, biotinylated</td>
			<td style="width:145px;">Rockland</td>
			<td style="width:155px;">600-406-379</td>
			<td>www.rockland-inc.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Alexa Fluor 555 streptavidin</td>
			<td style="width:145px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:155px;">S-32355</td>
			<td>www.lifetechnologies.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">rat anti-MBP</td>
			<td style="width:145px;">J. and N. Lee</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>available from: J. and N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ , U.S.A., clone MT-14.7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">goat anti-rat-Alexa Fluor 647</td>
			<td style="width:145px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:155px;">A-21247</td>
			<td>www.lifetechnologies.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">rat anti-B220 - Alexa Fluor 594</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>produced and coupled in-house (DRFZ), clone RA3.6B2, Alexa Fluor 594 from Life Technologies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">mouse anti-l1 light chain -FITC</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>produced and coupled in-house (DRFZ), clone LS136</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">rat anti-k light chain - FITC</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>produced and coupled in-house (DRFZ), clone 187.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:155px;">D9542 SIGMA</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Fluorescent mounting medium</td>
			<td style="width:145px;">DAKO</td>
			<td style="width:155px;">S3023</td>
			<td>www.dako.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Cover slips (24mm x 24mm x 0.13-0.16 mm)</td>
			<td style="width:145px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:155px;">H875.2</td>
			<td>www.carlroth.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Superfrost slides glasses (75 mm x 25 mm)</td>
			<td style="width:145px;">VWR</td>
			<td style="width:155px;">48311-703</td>
			<td>www.vwr.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Laser scanning confocal microscope&#160;</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>equipped with laser lines of 405, 488, 561, 594, 633 nm and a 20x/0.8 NA air objective lens; We used a Zeiss LSM710 and Zen 2010 Version 6.0 software.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Automated image analysis tools for bone marrow</td>
			<td style="width:145px;">Wimasis, Munich</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>The cell contact tool and cell vicinity tool will be made available by Wimasis upon request: www.wimasis.de</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VC2012 Runtime</td>
			<td style="width:145px;">Microsoft</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>free download: http://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=30679</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Simulation tool for random cell positioning</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>available from us, upon request</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:365px;">Image analysis software with image segmentation functions</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>We used Volocity (Perkin Elmer) for measuring cell size distributions of hematopoietic cell types in bone marrow (Figure 5). Alternatives are Definiens Image Analysis (Definiens) or Cell Profiler (free download: http://www.cellprofiler.org)&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Fiji image analysis software&#160;</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>free download: http://fiji.sc/Fiji. Fiji was used by trained raters for manual cell count (Figure 3).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated quantification of hematopoietic cell &#8211; stromal cell interactions in histological images of undecalcified bone

Microscopia confocale è il metodo di scelta per l&#39;analisi della localizzazione di molteplici tipi di cellule all&#39;interno dei tessuti complessi come il midollo osseo. Tuttavia, l&#39;analisi e la quantificazione di localizzazione cellulare è difficile, come in molti casi si basa sul conteggio manuale, portando così il rischio di introdurre una polarizzazione rater-dipendente e riducendo l&#39;affidabilità interrater. Inoltre, è spesso difficile giudicare se la co-localizzazione tra due celle risultati di posizionamento casuale, soprattutto quando tipi cellulari differiscono fortemente la frequenza del loro verificarsi. Qui, viene introdotto un metodo per la quantificazione obiettiva cellulari co-localizzazione nel midollo osseo. Il protocollo descrive la preparazione del campione utilizzato per ottenere sezioni istologiche di intere murini ossa lunghe, compreso il midollo osseo, così come il protocollo di colorazione e l&#39;acquisizione di immagini ad alta risoluzione. Un flusso di lavoro di analisi che va dal riconoscimento di ematopoietiche e non-hemattipi di cellule opoietic in 2 dimensioni immagini midollo (2D) ossa alla quantificazione dei contatti diretti tra queste cellule è presentato. Questo include anche un&#39;analisi quartiere, per ottenere informazioni sul microambiente cellulare che circonda un certo tipo di cellula. Per valutare se la co-localizzazione di due tipi di cellule è il semplice risultato del posizionamento cella casuale o riflette associazioni preferenziali tra le cellule, uno strumento di simulazione che è adatto per testare questa ipotesi nel caso di ematopoietiche e cellule stromali, è utilizzato. Questo approccio non è limitato al midollo osseo, e può essere estesa ad altri tessuti per consentire riproducibili, analisi quantitativa dei dati istologici.

Taglio criosezioni di osso undecalcified con il metodo del nastro Kawamoto permette l&#39;osso intero da tagliare come sezione intatta, con midollo osseo della regione endosseo ancora attaccato all&#39;osso mineralizzato, sia nella diafisi nonché nelle zone epifisarie con la loro alta densità trabecolare ossea (Figura 1). Colorazione nucleare delle sezioni rivela che anche se piccole crepe nel preparato non possono essere completamente evitati, la struttura delle sinusoidi e arterie e la rete reticola...

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Automated Quantification of Hematopoietic Cell &amp;#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.

Automated quantificazione di cellule ematopoietiche - Interazioni cellule stromali in istologici Immagini di Undecalcified Bone

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Automated Quantification of Hematopoietic Cell &#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

11.4K Views.  German Rheumatism Research Center, a Leibniz Institute. A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.

Video: Automated Quantification of Hematopoietic Cell &#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

Quantification of  Colonic Stem Cell Mutations

The ability to measure stem cell mutations is a powerful tool to quantify in a critical cell population if, and to what extent, a chemical can induce mutations that potentially lead to cancer. The use of an enzymatic assay to quantify stem cell mutations in the X-linked glucose-6-phosphate dehydrogenase gene has been previously reported.1 This method requires the preparation of frozen sections and incubation of the sectioned tissue with a reaction mixture that yields a blue color if the cells produce functional glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) enzyme. If not, the cells appear whitish. We have modified the reaction mixture using Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) medium in place of polyvinyl alcohol. This facilitates pH measurement, increases solubilization of the G6PD staining components and restricts diffusion of the G6PD enzyme. To demonstrate that a mutation occurred in a stem cell, the entire crypt must lack G6PD enzymatic activity. Only if a stem cell harbors a phenotypic G6PD mutation will all of the progeny in the crypt lack G6PD enzymatic activity. To identify crypts with a stem cell mutation, four consecutive adjacent frozen sections (a level) were cut at 7 &#181;m thicknesses. This approach of making adjacent cuts provides conformation that a crypt was fully mutated since the same mutated crypt will be observed in adjacent sections. Slides with tissue samples that were more than 50 &#181;m apart were prepared to assess a total of &#62;104 crypts per mouse. The mutation frequency is the number of observed mutated (white) crypts &#247; by the number of wild type (blue) crypts in a treatment group.

We report significant improvements for the reproducible measurement of somatic colonic stem cell mutations after exposure of mice to potential DNA damaging agents.

Quantificazione del colon le mutazioni delle cellule staminali

The ability to measure stem cell mutations is a powerful tool to quantify in a critical cell population if, and to what extent, a chemical can induce ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Competitive Transplants to Evaluate Hematopoietic Stem Cell Fitness

The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to reestablish blood cell production for the lifespan of the recipient. This protocol explains how to set up a functional assay to compare the HSC capacities of two different populations of cells, such as bone marrow from mice of two different genotypes, and how to analyze the recipient mice by flow cytometry. The protocol uses HSC equivalents rather than cell sorting for standardization and discusses the advantages and disadvantages of both approaches. We further discuss different variations to the basic protocol, including serial transplants, limiting dilution assays, homing assays and non-competitive transplants, including the advantages and preferred uses of these varied approaches. These assays are central for the study of HSC function and could be used not only for the investigation of fundamental HSC intrinsic aspects of biology but also for the development of preclinical assays for bone marrow transplant and HSC expansion in culture.

This protocol provides step-by-step guidelines for setting up competitive mouse bone marrow transplant experiments to study hematopoietic stem/progenitor cell function without prior purification of stem cells by cell sorting.

Trapianti competitivi per valutare staminali ematopoietiche cellule Fitness

The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to ...

Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a strict species-specific periodicity. The periodicity of the process is regulated by a molecular oscillator, known as the "segmentation clock," acting in the PSM cells. This clock drives the oscillatory patterns of gene expression across the PSM in a posterior-anterior direction. These so-called clock genes are key components of three signaling pathways: Wnt, Notch, and fibroblast growth factor (FGF). In addition, Notch signaling is essential for synchronizing intracellular oscillations in neighboring cells. We recently gained insight into how this may be mechanistically regulated. Upon ligand activation, the Notch receptor is cleaved, releasing the intracellular domain (NICD), which moves to the nucleus and regulates gene expression. NICD is highly labile, and its phosphorylation-dependent turnover acts to restrict Notch signaling. The profile of NICD production (and degradation) in the PSM is known to be oscillatory and to resemble that of a clock gene. We recently reported that both the Notch receptor and the Delta ligand, which mediate intercellular coupling, themselves exhibit dynamic expression at both the mRNA and protein levels. In this article, we describe the sensitive detection methods and detailed image analysis tools that we used, in combination with the computational modeling that we designed, to extract and overlay expression data from distinct points in the expression cycle. This allowed us to construct a spatio-temporal picture of the dynamic expression profile for the receptor, the ligand, and the Notch target clock genes throughout an oscillation cycle. Here, we describe the protocols used to generate and culture the PSM explants, as well as the procedure to stain for the mRNA or protein. We also explain how the confocal images were subsequently analyzed and temporally ordered computationally to generate ordered sequences of clock expression snapshots, hereafter defined as "kymographs," for the visualization of the spatiotemporal expression of Delta-like1 (Dll1) and Notch1 throughout the PSM.

The segmentation clock drives oscillatory gene expression across the pre-somitic mesoderm (PSM). Dynamic Notch activity is key to this process. We use imaging and computational analyses to extract temporal dynamics from spatial expression data to demonstrate that Delta ligand and Notch receptor expression oscillate in the vertebrate PSM.

Temporale ordinazione di espressione Dynamic Data di espressione spaziale dettagliata Mappe

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

Isolamento e caratterizzazione di cellule mesenchimali stromali dal Cordone ombelicale e placenta fetale

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper vessel development and homeostasis. However, studies on endothelial lineage hierarchy remain elusive due to the lack of tools to gain access as well as to directly evaluate their behavior in vivo. To address this shortcoming, a new tissue model to study angiogenesis using the mammary fat pad has been developed. The mammary gland develops mostly in the postnatal stages, including puberty and pregnancy, during which robust epithelium proliferation is accompanied by extensive vascular remodeling. Mammary fat pads provide space, matrix, and rich angiogenic stimuli from the growing mammary epithelium. Furthermore, mammary fat pads are located outside the peritoneal cavity, making them an easily accessible grafting site for assessing the angiogenic potential of exogenous cells. This work also describes an efficient tracing approach using fluorescent reporter mice to specifically label the targeted population of vascular endothelial stem cells (VESCs) in vivo. This lineage tracing method, coupled with subsequent tissue whole-mount microscopy, enable the direct visualization of targeted cells and their descendants, through which the proliferation capability can be quantified and the differentiation commitment can be fate-mapped. Using these methods, a population of bipotent protein C receptor (Procr) expressing VESCs has recently been identified in multiple vascular systems. Procr+ VESCs, giving rise to both new ECs and pericytes, actively contribute to angiogenesis during development, homeostasis, and injury repair. Overall, this manuscript describes a new mammary fat pad transplantation and in vivo lineage tracing techniques that can be used to evaluate the stem cell properties of VESCs.

This work demonstrates a novel approach to assess the proliferation, differentiation, and vessel-forming potential of vascular endothelial stem cells (VESCs) through mammary fat pad transplantation followed by whole-mount tissue preparation for microscopic observation. A lineage tracing strategy to investigate the behavior of VESCs in vivo is also presented.

Una tecnica novel di trapianto di grassi del grasso mammario per visualizzare la generazione di vascelli delle cellule staminali endoteliali vascolari

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

Bioingegneria dei microrganismi del midollo osseo umano nel mouse e la loro visualizzazione mediante imaging live

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

Tissue engineering has gained substantial recognition due to the high demand for human cornea replacements with an estimated 10 million people worldwide suffering from corneal vision loss1. To address the demand for viable human corneas, significant progress in three-dimensional (3D) tissue engineering has been made2,3,4. These cornea models range from simple monolayer systems to multilayered models, leading to 3D full-thickness corneal equivalents2.
However, the use of a 3D tissue-engineered cornea in the context of in vitro disease models studied to date lacks resemblance to the multilayered 3D corneal tissue structure, function, and the networking of different cell types (i.e., nerve, epithelium, stroma, and endothelium)2,3. In addition, the demand for in vitro cornea tissue models has increased in an attempt to reduce animal testing for pharmaceutical products. Thus, more sophisticated models are required to better match systems to human physiological requirements, and the development of a model that is more relevant to the patient population is absolutely necessary. Given that multiple cell types in the cornea are affected by diseases and dystrophies, such as Keratoconus, Diabetic Keratopathy, and Fuchs, this model includes a 3D co-culture model of primary human corneal fibroblasts (HCFs) from healthy donors and neurons from the SH-SY5Y cell line. This allows us for the first time to investigate the interactions between the two cell types within the human corneal tissue. We believe that this model could potentially dissect the underlying mechanisms associated with the stromal-nerve interactions of corneal diseases that exhibit nerve damages. This 3D model mirrors the basic anatomical and physiological nature of the corneal tissue in vivo and can be used in the future as a tool for investigating corneal defects as well as screening the efficacy of various agents before animal testing.

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

This protocol describes a novel three-dimensional in vitro model, where corneal stromal cells and differentiated neuronal cells are cultured together to assist in the examination and understanding of the interactions of the two cell types.

Ingegneria tissutale corneale: Un In Vitro modello delle interazioni Stromal-nervo della Cornea umana

Tissue engineering has gained substantial recognition due to the high demand for human cornea replacements with an estimated 10 million people worldwide ...

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result in a series of bone metabolic diseases, including osteoporosis. To develop pharmaceutical targets for the prevention of pathological bone mass loss, the mechanisms by which osteoclasts differentiate from precursors must be understood. The ability to isolate and culture a large number of osteoclasts in vitro is critical in order to determine the role of specific genes in osteoclast differentiation. Inactivation of the mammalian/mechanistic target of rapamycin complex 1 (TORC1) in osteoclasts can decrease osteoclast number and increase bone mass; however, the underlying mechanisms require further study. In the present study, a RANKL-based protocol to isolate and culture osteoclasts from mouse bone marrow and to study the influence of mTORC1 inactivation on osteoclast formation is described. This protocol successfully resulted in a large number of giant osteoclasts, typically within one week. Deletion of Raptor impaired osteoclast formation and decreased the activity of secretory tartrate-resistant acid phosphatase, indicating that mTORC1 is critical for osteoclast formation.

This manuscript describes a protocol to isolate and culture osteoclasts in vitro from mouse bone marrow, and to study the role of the mammalian/mechanistic target of rapamycin complex 1 in osteoclast formation.

Un base di RANKL Osteoclast cultura Assay di midollo osseo del topo per studiare il ruolo di mTORC1 nella formazione degli osteoclasti

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used approaches to determine protein half-life are either limited to population averages from lysed cells or require the use of protein synthesis inhibitors. This protocol describes a method to measure protein half-lives in single living adherent cells, using SNAP-tag fusion proteins in combination with fluorescence time-lapse microscopy. Any protein of interest fused to a SNAP-tag can be covalently bound by a fluorescent, cell permeable dye that is coupled to a benzylguanine derivative, and the decay of the labeled protein population can be monitored after washout of the residual dye. Subsequent cell tracking and quantification of the integrated fluorescence intensity over time results in an exponential decay curve for each tracked cell, allowing for determining protein degradation rates in single cells by curve fitting. This method provides an estimate for the heterogeneity of half-lives in a population of cultured cells, which cannot easily be assessed by other methods. The approach presented here is applicable to any type of cultured adherent cells expressing a protein of interest fused to a SNAP-tag. Here we use mouse embryonic stem (ES) cells grown on E-cadherin-coated cell culture plates to illustrate how single cell degradation rates of proteins with a broad range of half-lives can be determined.

This protocol describes a method to determine protein half-lives in single living adherent cells, using pulse labeling and fluorescence time-lapse imaging of SNAP-tag fusion proteins.

Cella singola quantificazione dei tassi di degradazione delle proteine mediante microscopia a fluorescenza time-lapse in coltura delle cellule aderenti

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early embryo and the lack of assays that functionally identify the long-term multilineage engraftment potential of individual putative HSC precursors. Here, we describe methodology that enables the isolation and characterization of functionally validated HSC precursors at the single cell level. First, we utilize index sorting to catalog the precise phenotypic parameter of each individually sorted cell, using a combination of phenotypic markers to enrich for HSC precursors with additional markers for experimental analysis. Second, each index-sorted cell is co-cultured with vascular niche stroma from the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region, which supports the maturation of non-engrafting HSC precursors to functional HSC with multilineage, long-term engraftment potential in transplantation assays. This methodology enables correlation of phenotypic properties of clonal hemogenic precursors with their functional engraftment potential or other properties such as transcriptional profile, providing a means for the detailed analysis of HSC precursor development at the single cell level.

Here we present methodology for the clonal analysis of hematopoietic stem cell precursors during murine embryonic development. We combine index sorting of single cells from the embryonic aorta-gonad-mesonephros region with endothelial cell co-culture and transplantation to characterize the phenotypic properties and engraftment potential of single hematopoietic precursors.

Analisi clonale di cellule embrionali staminali ematopoietiche precursori utilizzando indice della singola cella ordinamento combinato con cellule endoteliali nicchia co-cultura

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...