Questo è un semplice protocollo per la sintesi di nanocluster d'oro fotoluminescenti funzionalizzabili e vicini all'infrarosso e il loro rilevamento utilizzando una configurazione commerciale. Uno dei principali vantaggi di questa tecnica è che l'attacco del ligando funzionalizzato al tiolo e l'accoppiamento del ligando funzionalizzato all'ammina sulla superficie dei nanocluster d'oro non influisce negativamente sulle proprietà fotoluminescenti e sulla stabilità della bobina. Si può prevedere che la combinazione di intense proprietà di fotoluminescenza e coniugazione con biomolecole consentirà il rilevamento in vitro di anilidi a bassa concentrazione, biosensing, solubling e bio-imaging.
A dimostrare la procedura sarà Klaudia Kvakova, la mia dottoranda. La citometria del flusso sarà dimostrata dall'assistente di ricerca Alzbeta Magdolenova. La parte microscopica sarà dimostrata da Vaclav Bocan, studente laureato del Laboratorio Lenka Libusova.
Iniziare aggiungendo 7,8 milligrammi di acido tiottico in 60 microlitri di idrossido di sodio bimolare a 23,4 millilitri di acqua ultrapura e mescolando la miscela fino a completa dissoluzione. Aggiungere quindi 10,2 microlitri di tetraclororato di idrogeno alla soluzione e, dopo 15 minuti, aggiungere 480 microlitri di boroidride di sodio appena preparato mescolando vigorosamente. Continuare a mescolare la miscela di reazione durante la notte.
Il giorno successivo, purificare la soluzione utilizzando tre cicli di ultrafiltrazione con un taglio del peso molecolare di tre kilodaltoni, quindi aggiungere 15,6 milligrammi di glicole polietilene terminato dal tiolo alla soluzione, regolare il pH tra 7 e 7,5 e mescolare la miscela durante la notte per ottenere nanocluster 1. Il giorno seguente, ripetere i tre cicli di centrifugazione e filtrazione per purificare la dispersione. Mescolare la soluzione di nanocluster 1 con TPP, quindi regolare il pH a 4,5 con cloruro di idrogeno un molare.
Iniziare la reazione aggiungendo un eccesso di EDC HCL e monitorare il pH della miscela per la prima ora. Se il pH aumenta sopra i sei, ridurlo aggiungendo cloruro di idrogeno. Mescolare la miscela di reazione durante la notte a temperatura ambiente.
Il giorno successivo, eseguire tre cicli di centrifugazione e filtrazione come descritto in precedenza per ottenere il nanocluster 2. Diluire 2 con acqua ultrapura ad un volume di 24 millilitri. Seminare le cellule in una piastra di 12 po 'ad una densità di 20.000 cellule per pozzo.
Incubarli per 48 ore, quindi aspirare il mezzo e aggiungere 400 microlitri di mezzo di coltura completo con o senza 500 microgrammi di nanoparticelle per pozzo. Riportare le cellule all'incubatore Celsius di 37 gradi per l'internalizzazione del nanocluster. Dopo due ore, staccare le celle con la tripsininazione standard.
Raccoglili in tubi a microcentrifugo in polipropilene e centrifuga per cinque minuti a 350 volte g e quattro gradi Celsius. Preparare il tampone FCM in base alle indicazioni del manoscritto e utilizzare un millilitro del tampone per lavare i pellet cellulari. Centrifugare le cellule per altri cinque minuti, quindi rimornerle in 500 microlitri del buffer FCM e conservarle a quattro gradi Celsius.
Prima dell'acquisizione del campione, assicurarsi che lo strumento abbia la corrispondente configurazione ottica. Posizionare il filtro passa banda 780 over 60 davanti al rilevatore 405A. Filtrare tutti i campioni utilizzando un tubo a fondo rotondo in polistirolo a cinque millilitri con tappo filtrante a celle.
Specificare la configurazione del citometro. Tracciate un plottaggio a punti a due parametri delle FSC-A e dell'SSC-A per mostrare la distribuzione delle celle. Per escludere i doppietti, create un plot di punti a due parametri di FSC-H rispetto a FSC-A e tracciate un istogramma a parametro singolo per l'area del canale fluorescente per monitorare l'intensità relativa della fluorescenza nel campione.
Acquisire campioni non trattati a bassa portata per ridurre al minimo gli eventi coincidenti. Durante l'acquisizione, regolare le tensioni PMT per ottenere la popolazione non trattata su larga scala sul grafico FSC rispetto a SSC. Se necessario, regolare le tensioni PMT per il canale FL per posizionare la popolazione non macchiata nell'angolo sinistro dell'istogramma.
Quindi selezionare la scheda Gate specifica nel software e disegnare un cancello appropriato intorno alla popolazione desiderata. Le celle all'interno del cancello si sposteranno al checkpoint successivo. Impostare l'esperimento e registrare i dati.
A 24 ore dopo la semina, aggiungere 100 microgrammi di 2 a ogni camera del piatto contenente 0,5 millilitri di mezzo con cellule HeLa. Riportare il piatto nell'incubatrice e lasciare che le cellule internalizzino i nanocluster, quindi scartare il mezzo e lavare le cellule con mezzo prebellico e fresco. Riempire ogni camera con 800 microlitri di mezzo fresco e procedere con l'imaging.
Per immagini le celle, utilizzare un microscopio confocale con Plan-APOCHROMAT e un obiettivo olio 63x. Montare il piatto sullo stadio invertito con la camera riscaldata fino a 37 gradi Celsius e fornita con un'atmosfera umidificata al 5% di anidride carbonica. Rileva nanocluster d'oro interiorizzati utilizzando un laser da 405 nanometri impostato sul 2% di potenza con uno splitter a fascio appropriato, impostando l'intervallo di lunghezze d'onda di rilevamento tra 650 e 760 nanometri.
Impostare la risoluzione dell'immagine su 2048 per 2048 pixel. Nell'impostazione della velocità di acquisizione, puntare a un tempo di permanenza dei pixel intorno ai quattro microsecondi e acquisire l'immagine con una media due volte superiore, quindi impostare il foro stenopeica su un'unità di area e, per una maggiore sensibilità, utilizzare la modalità di conteggio dei fotoni. Per una corretta illuminazione e luce trasmessa con DIC utilizzare l'impostazione kohler del condensatore e dell'arresto del campo.
Per acquisire luce trasmessa, utilizzare un laser da 488 nanometri con una potenza dello 0,7% senza alcun rilevatore di fluorescenza assegnato, assicurandosi di impostare uno splitter a fascio appropriato per la lunghezza d'onda del laser. Gli spettri di assorbimento indicavano che i nanocluster d'oro 1 e 2 non hanno una caratteristica banda di plasmone superficiale e mostrano un'ampia emissione da 550 a 850 nanometri. La fotoluminescenza è fortemente aumentata dopo l'attacco di TPP alla superficie di 1.
L'emissione dai nanocluster era visibile anche sotto una luce UV di 365 nanometri. L'emissione era stabile e la sua lunghezza d'onda era indipendente dalla lunghezza d'onda di eccitazione, ma l'intensità era massima quando eccitata con la luce UV. La citometria a flusso è stata usata per confermare l'assorbimento del nanocluster 2 da parte delle cellule HeLa.
La quasi fluorescenza dipendeva sia dal tempo di incubazione che dalla concentrazione del nanocluster 2. I nanocluster d'oro all'interno delle cellule sono stati immagini non invasivamente con un microscopio a scansione laser confocale standard. Le cellule sono state macchiate con nanocluster 2 e, dopo 24 ore di incubazione, è stata osservata fotoluminescenza rossa brillante all'interno delle cellule.
Quando si tenta questo protocollo, è importante ricordare che la rimozione del boroidro di sodio non reatto e idrolizzato è molto importante, altrimenti il glicole polietilene tiolato non si lega alla superficie del nanocluster d'oro. Inoltre, la fotoluminescenza dei nanocluster d'oro inizia da 560 nanometri. Per evitare l'autofluorescente di fondo negli esperimenti di microscopia confocale, i fotoni devono essere raccolti sopra i 650 nanometri.
