Utilizzando la microscopia intravitale, questo protocollo consente la visualizzazione in tempo reale del tessuto intestinale fino a una risoluzione a singola cellula e lo studio di processi altamente dinamici come lo spargimento cellulare. In combinazione con gli esperimenti di tracciante standard, questo protocollo consente l'identificazione sia dei disturbi della permeabilità intestinale in vivo che della distinzione tra permeabilità para e transcellulare. Questo protocollo potrebbe essere utilizzato come base per lo sviluppo di ulteriori approcci di microscopia intravitale per visualizzare altri processi cellulari altamente dinamici di interesse all'interno di vari tessuti.
La dimostrazione visiva di questo metodo è essenziale per comprendere le fasi di preparazione chirurgica e posizionare l'animale vivente in modo da facilitare l'acquisizione dell'immagine sulla superficie della mucosa intestinale. Prima di iniziare la procedura, accendere la base e la scatola dello scanner di un microscopio a scansione laser confocale e premere start per accendere il computer. Avviare il software di acquisizione delle immagini e selezionare la configurazione appropriata.
Per impostare la risoluzione dell'immagine appropriata, selezionare configurazione, hardware, risoluzione, profondità di bit e 12. Nel menu di acquisizione, selezionate XYZT per la modalità di acquisizione dell'immagine e impostate l'obiettivo su 20 o 40X. Per impostare l'impostazione di acquisizione sequenziale, fate clic su cerca e aggiungete e selezionate tra i fotogrammi.
Per configurare la prima sequenza, attivare la scatola laser visibile. Impostare il tubo fotomoltiplicatore uno su e definire la lunghezza d'onda di emissione. Per configurare la seconda sequenza, attivare la scatola laser visibile.
Impostare il tubo fotomoltiplicatore due su e definire la lunghezza d'onda di emissione. Quindi attivare i laser appropriati. Dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del piedino, utilizzare un cotton fioc per applicare un unguento agli occhi del topo anestetizzato e fare un'incisione di un centimetro nella regione ventricolare sinistra dell'addome.
Utilizzare le forcep per esternarizzare un segmento da tre a cinque centimetri dell'intestino. Fare due piccole incisioni nella parte superiore e inferiore del segmento intestinale e introdurre una micropipetta di vetro nel lume intestinale. Quindi utilizzare l'elettrocauterizzazione per aprire longitudinalmente il segmento intestinale esteriore lungo il lato anti-mesenterico ed esporre la mucosa.
Risciacquare brevemente il tessuto con soluzione salina per rimuovere il contenuto fecale. Per la colorazione della superficie della mucosa intestinale, applicare 100 microlitri di un milligrammo per millilitro di soluzione di acriflavina in goccioline sulla superficie mucosa esposta e lasciare che la macchia si sviluppi per tre minuti prima di lavare la soluzione rimanente con PBS. Successivamente, applicare 100 microlitri di una soluzione di dextran di rodimina millilitro per millilitro in goccioline alla mucosa per un'incubazione di tre minuti prima del lavaggio con PBS.
Quindi posizionare la supina del mouse anestetizzata su uno scivolo di copertura montato sulla camera risciacquata con soluzione salina di 37 gradi Celsius, regolando la posizione se necessario, e posizionare la preparazione sullo stadio del microscopio invertito. Immediatamente dopo aver posizionato il mouse sul palco, accendere la sorgente luminosa e regolare la posizione XY fino a quando l'asse di illuminazione non è focalizzato sulla preparazione del tessuto. Per selezionare il campo visivo, selezionare il cubo di filtro appropriato.
Aprire l'otturatore e utilizzare le ruote macro e micro per concentrarsi sulla superficie della mucosa intestinale. Regolare la posizione XY per individuare un'area in cui è possibile visualizzare diversi villi all'interno del campo visivo e modificare il cubo del filtro per verificare che la colorazione di rodimina dextran sia visibile anche in quell'area. Quando è stata identificata un'area di interesse, avviare l'acquisizione dell'immagine e selezionare la sequenza uno per regolare la potenza, il guadagno e l'offset laser per la prima sequenza.
Quindi selezionare la sequenza due e regolare la potenza, il guadagno e l'offset laser per la seconda sequenza. Per definire l'intervallo Z-stack, aprite il menu di consegna z-stack. Utilizzare il controllo Z-access per concentrarsi sulla superficie della mucosa e fare clic su begin.
Concentrati sul limite inferiore di dove il segnale è ancora rilevabile e fai clic sull'estremità. Definire il numero di Z-stack, evitando time-lapse superiori a due minuti per due punti di tempo consecutivi e aprire il menu di tempo per selezionare riduci a icona e acquisire fino all'arresto. Per definire la media della linea, selezionare cercarne uno, la media delle linee due, cercarne due e la media della linea due.
Quindi, per acquisire immagini, impostare il formato su 1024 x 1024 pixel e la velocità su 400 e fare clic su Avvia. I topi condizionali carenti di GGTasi, specifici delle cellule epiteliali intestinali, hanno sviluppato una grave patologia intestinale, come dimostrato da un aumento del punteggio di danno istologico dell'intestino tenue e dall'aumento della permeabilità epiteliale intestinale può anche essere rilevato tramite tracciante in esperimenti in vivo utilizzando FITC-dextran somministrato per via orale. Gli eventi di spargimento cellulare potrebbero essere identificati come cellule che si spostano fuori dal monostrato epiteliale nel lume, portando a spazi temporanei nel soffitto dell'epitelio che vengono infine chiusi dal contatto tra le cellule vicine, un cosiddetto effetto cerniera.
Queste lacune si osservano sia nei topi carenti di controllo che in quello GGTase, sebbene la frequenza di questi fenomeni sia più alta in quest'ultimo. È interessante notare che anche altre cellule sembrano assumere dextran. Questi cosiddetti eventi cellulari permeabili si verificano anche principalmente nei topi knockout condizionali.
L'immunostaining di proteine di giunzione correlate al citoscheletro e strette di interesse può essere eseguita per identificare obiettivi specifici che contribuiscono a potenziali interruzioni della permeabilità epiteliale determinate tramite microscopia intravitale. Questo metodo può essere utilizzato per l'analisi di altri fenomeni sulla superficie della mucosa intestinale, come la perdita endoteliale o la comunicazione epiteliale immunitaria nel contesto dell'infezione intestinale.
