Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni dal National Institutes of Health DK074656 e AI56374 (CEM), così come la Juvenile Diabetes Research Foundation.

1. Preparazione di cellule <ol><li> Obiettivo coltura cellulare: Cultura delle linee di cellule beta del mouse, NIT-1 e NIT-4, era un 1,2 precedentemente descritta in DMEM supplementato con 10% FBS, 0,02% BSA, non aminoacidi essenziali, HEPES 15mm, 16,5 mm Glocose e penicillina / streptomicina. Per 51 etichettatura Cr, le cellule di semi in un piatto fondo da 96 pozzetti alla piastra di coltura 5X10 4 cellule / pozzetto in 200 microlitri terreno di coltura. Per gli esperimenti di microscopia, le cellule di semi in un 8-ben Lab-Tak II chambered coprioggetti 5x10 a 4 per camera in 500 microlitri terreno di coltura, e consentono di crescere per 48 ore prima di utilizzare negli esperimenti di citotossicità. </li><li> Controllo di colture cellulari linea T: Utilizzare la riga di cellule Jurkat (ATCC, CD3 + umano linea cellulare dei linfociti) come controllo negativo. Cellule in coltura Jurkat RPMI1640 supplementato con 10% FBS, 2 mM L-glutammina, 1,5 g / L di bicarbonato di sodio, 10 HEPES mM e 1.0 mM di piruvato di sodio. </li></ol> 2. La raccolta e l&#39;attivazione di effettori autoreattivi cellule T CD8 + NOD.Cg-RAG1 tm1Mom Tg (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD-AI4a] e NOD.Cg-RAG1 tm1Mom Tg (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD-AI4b] sono stati acquistati da The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) e allevati nella nostra struttura mouse. F1 progenie ibrida da accoppiamenti di NOD-AI4a con NOD-AI4b [NOD-AI4a / b] sviluppare il diabete a 3-5 settimane di età. Tutti i topi sono stati ospitati in specifici esenti da organismi patogeni strutture e approvato dalla cura degli animali all&#39;istituzione competente e del comitato Usa. <ol><li> Eutanasia 3-4 settimana di vita NOD-AI4a / b topo, utilizzando CO 2. </li><li> Raccogliere milza di topi. Topi eutanasia sono preparati con spray etanolo e aperto sotto il cofano chirurgico. Milza vengono rimossi e messi in gelide tampone HBSS immediatamente. </li><li> Raccogliere le cellule della milza con un 7 ml di vetro omogeneizzatore. Due o tre ogni milza sono messi in 5 ml di HBSS freddo e omogeneizzato con una ML 7, vetro omogeneizzatore. Omogeneizzato viene raccolto e centrifugato a 1200rpm per 5 minuti a 4 ° C con una Sorvall RT7 centrifuga +. Pellet cellulari sono raccolti. </li><li> Rimuovere i globuli rossi con il trattamento ipotonico soluzione. I pellets sono trattati con 5 ml di soluzione ipotonica / milza in ghiaccio per 5 minuti, poi neutralizzato con l&#39;aggiunta di un uguale volume di HBSS. Raccogliere le cellule per centrifugazione, come sopra, e risospendere in 50 HBSS ml. Passare attraverso le cellule sospese filtro cellulare e conta con un emocitometro con colorazione TrypanBlue. </li><li> Attivare le cellule. Risospendere le cellule a 5x10 6 / ml e attivare utilizzando una cultura 3 giorni con 0,1 mM AI4 mimotopo (amino YFIENYLEL sequenza di acido) e 25 U / mL di IL-2 in RPMI1640 supplementato con 10% FBS, 2 mM L-glutammina, 1,5 g / L bicarbonato di sodio, 10 HEPES mM e 1.0 mM di piruvato di sodio. </li></ol> 3. 51 saggio di rilascio Cr esaminare CML <ol><li> Cellule bersaglio Etichetta: Aggiungi 51 Cr di indirizzare le cellule a 1 μCi / bene e cultura per 3 ore, e lavare 3 volte con terreno di coltura. </li><li> Sospendere cellule effettrici in RPMI 1640 medium, come indicato al punto 2,5 in modo che il volume finale aggiunti a ciascun pozzetto è di 200 microlitri. </li><li> Dopo l&#39;ultimo lavaggio delle cellule bersaglio marcato, aggiungere attivato cellule effettrici di colture di cellule effettrici il target a bersaglio desiderato (E: T) rapporti. Usiamo solitamente E: T ratio a 0.4:1, 1:1, 2:1, 5:1, 10:1, 20:1 e 50:1. </li><li> Aggiungi fresca modificato RPMI 1640 medium (vedi punto 2.5) a 6 pozzi di cellule bersaglio per fungere da controllo lisi spontanea. </li><li> Co-coltura le cellule effettrici e la destinazione di 16 ore. </li><li> Raccogliere il supernatante in tubi 6x50 mm Vetro Lime </li><li> Lisare le cellule con l&#39;aggiunta di 100μl 2% SDS e pipettaggio più volte con delicatezza. </li><li> Raccogliere lisato cellulare in un altro insieme di tubi 6x50 mm Vetro Lime. </li><li> Lavare una volta con i pozzi puliti H 2 O e aggiungere il lavaggio di tubi lisato la cella. </li><li> Contare il supernatanti e lisati cellulari mediante un contatore gamma. </li><li> Calcolare lisi specifica quanto segue: <img src="files/ftp_upload/2724/2724eq1.jpg" alt="Equazione 1" /></li></ol> 4. Colorazione delle cellule per l&#39;imaging cellulare dal vivo Tra le più comunemente utilizzati coloranti potenziale della membrana mitocondriale, TMRM espone la tossicità mitocondriale meno. 3 Perciò, scegliamo TMRM per questi studi dal vivo imaging cellulare. <ol><li> Preparare uno stock 40 mM soluzione TMRM in DMSO e conservare a -20 ° C. Fare una [25 nM] fresca soluzione di lavoro in rosso fenolo senza DMEM con tutti i supplementi per NIT-1 coltura cellulare 1. </li><li> Macchia obiettivo NIT-1 con cellule TMRM 25 nM per 30 min a 37 ° C. </li><li> Sostituire il supporto con mezzi freschi contenente 5 nM TMRM a mantenere la distribuzione di equilibrio del colorante 4. </li><li> Conte attivato cellule T effettrici AI4 utilizzando un hematocytometer. </li><li> Macchia attivato AI4 effettrici delle cellule T con 1 ml / ml per PicoGreen5 minuti a temperatura ambiente e lavare con rosso fenolo senza terreno di coltura per 3 volte. </li></ol> 5. La valutazione dei linfociti T-mediata morte delle cellule beta utilizzando l&#39;imaging cellulare dal vivo <ol><li> Montare il coprioggetti camerati con le cellule NIT colorate sul palco di una Zeiss LSM 510 microscopio confocale. Rimuovere la linguetta con un dremmel e il gas sterilizzare il vetro con ossido di etheline camerati. Il palco è dotato di un live-cellule in camera di imaging che ha temperatura controllata a 37 ° C e 5% di CO 2 con l&#39;umidità. </li><li> Aggiungi attivato e colorate le cellule T per camere designato a diversi E: T ratio. </li><li> Ha aggiunto lo stesso numero di cellule Jurkat colorate alle camere di controllo. </li></ol> 6. Ottenere immagini di cellule vive Il microscopio è dotato di uno stadio motorizzato che ci ha permesso di acquisire le immagini riprese in luoghi diversi dalle camere stesso o diverso automaticamente nel corso del tempo l&#39;esperimento. <ol><li> Utilizza un obiettivo 63x obiettivo di olio, prendete le immagini ad un intervallo di ogni 3 minuti per un totale di 300 fotogrammi al luogo. </li><li> Rileva colorazione TMRM utilizzando una lunghezza d&#39;onda di eccitazione di 543 nm e set di filtri per l&#39;emissione di 565-619 nm </li><li> Rileva colorazione PicoGreen utilizzando una eccitazione 488 nm e un set di filtri per l&#39;emissione di 500-630 nm. Il video è stato creato utilizzando il software LSM Zeiss. </li></ol> 7. Conversione video per la pubblicazione <ol><li> Utilizzando il software LSM Zeiss, creare un file compresso filmato in un formato AVI. </li><li> Per convertire i video nel formato di pubblicazione, importare il video nel pacchetto software FIJI ( <a href="http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji">http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji</a> ), un ImageJ ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info. nih.gov / ij /</a> ) distribuzione, usando il plugin Bioformats da LOCI ( <a href="http://www.loci.wisc.edu/software/bio-formats">http://www.loci.wisc.edu/software/bio-formats</a> ). </li><li> Regolare le impostazioni di luminosità e il contrasto per bilanciare i segnali verde e rosso e il frame rate è stato fissato a 2 fotogrammi / secondo utilizzando il menu opzioni di animazione. </li><li> Ritagliare il video a 512 x 512 pixel ed esportare come un file AVI non compresso. </li><li> Aprire questo file AVI nel software QuickTime 7 (computer Apple, Cupertino, CA) e comprimere e di esportazione nel formato aperto di file video H264/MPEG-4 a 1200 kbs / secondo. </li></ol> 8. Rappresentante dei risultati: <ol><li> Un risultato rappresentativo di 51 test Cr CML. La Figura 1 mostra un risultato rappresentativo di un saggio in cui CML lisi specifiche per cento (asse Y) aumenta con l&#39;Effector: rapporto di destinazione (asse X) aumenta. Cellule bersaglio sono isolotti primarie isolate da immunodeficienti NOD RAG1-/ -. Topi ed etichettato con 51 Cr. Splenociti da topi transgenici NOD.AI4α / β sono isolati e attivata come descritto al punto 2. Obiettivi e effettori sono stati co-coltura per 16 ore. Lisi specifiche per cento è calcolato come descritto al punto 3.11. </li><li> Due rappresentative (positivi e negativi) i risultati di una T cellulo-mediata della membrana delle cellule beta dissipazione mitocondriale potenziali sono presentati. Le cellule sono colorate e le reazioni sono registrate come descritte ai punti 4, 5 e 6 di cui sopra, i file video sono creati come al punto 7. Video 1: La versione beta linea di topi cellule NIT-1 è stato macchiato il potenziale di membrana mitocondriale TMRM colorante (rosso). Attivato, autoreattivi delle cellule T CD8 + AI4 (verde tinto con PicoGreen) sono stati co-coltura con queste NIT-1 le cellule a E: T rapporto di 50:1. NIT-1 potenziale della membrana mitocondriale dissipata gradualmente nel corso di 400 minuti di durata, ma solo nei distretti che sono stati interagendo con le cellule T AI4. Video 2: Come esperimento di controllo, NIT-1 le cellule sono state colorate con TMRM e co-coltura con cellule Jurkat PicoGreen colorate a E: T rapporto di 50:1. Cellule Jurkat sono un essere umano linea di cellule T che è MHC non corrispondenti. NIT-1 le cellule mantenuto il potenziale della membrana mitocondriale per tutta la durata dei 400 minuti di co-incubazione. Cellule Jurkat non hanno interagito con NIT-1 cluster e quindi non provocare l&#39;uccisione. </li></ol><img src="files/ftp_upload/2724/2724fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1 risultato Rappresentante della LMC utilizzando come isolotti cellule bersaglio primario isolate da immunodeficienza NOD.Rag1-/ -. Topi e splenociti da topi transgenici NOD.AI4α / β. Obiettivi e effettori sono stati co-coltura per 16 ore. Lisi per cento specifica aumenta con l&#39;Effector: aumenta il rapporto di destinazione. Video 1. Linea di cellule beta del mouse NIT-1 è stato macchiato il potenziale della membrana mitocondriale TMRM colorante (rosso). Attivato autoreattivi delle cellule T CD8 + AI4 (verde tinto con PicoGreen) sono stati co-coltura con queste NIT-1 le cellule in E: rapporto T di 50:1. NIT-1 potenziale di membrana mitocondriale dissipazioneTed gradualmente nel corso di 400 minuti di durata, ma solo nei distretti che sono stati interagendo con verde AI4 cellule T. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2724/video.mov">Clicca qui per vedere il video</a> . Video 2. NIT-1 le cellule sono state colorate identiche a quelle descritte nel video 1 e co-coltura con PicoGreen macchiata linea di cellule umane Jurkat T. NIT-1 le cellule erano in grado di mantenere il potenziale della membrana mitocondriale pensato la durata di 400 minuti. Cellule Jurkat non hanno interagito con NIT-1 cluster e quindi non provocare l&#39;uccisione. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2724/Video2.mp4">Clicca qui per vedere il video</a> .

<ol>
	<li>Hamaguchi, K., Gaskins, H. R., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIT-1,+a+pancreatic+beta-cell+line+established+from+a+transgenic+NOD/Lt+mouse.">NIT-1, a pancreatic beta-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse.</a> Diabetes. 40, 842-849 (1991).</li><li>Chen, J., Gusdon, A. M., Piganelli, J., Leiter, E. H., Mathews, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mt-Nd2a+modifies+resistance+against+autoimmune+Type+1+diabetes+in+NOD+mice+at+the+level+of+the+pancreatic+beta+cell.">mt-Nd2a modifies resistance against autoimmune Type 1 diabetes in NOD mice at the level of the pancreatic beta cell.</a> Diabetes. , (2010).</li><li>Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives.">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophys J. 76, 469-477 (1999).</li><li>Lemasters, J. J., Ramshesh, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+mitochondrial+polarization+and+depolarization+with+cationic+fluorophores.">Imaging of mitochondrial polarization and depolarization with cationic fluorophores.</a> Methods Cell Biol. 80, 283-295 (2007).</li><li>Abel, M., Krokowski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+immune-mediated+(type+1)+diabetes+mellitus:+potential+for+immunotherapy.">Pathophysiology of immune-mediated (type 1) diabetes mellitus: potential for immunotherapy.</a> BioDrugs. 15, 291-301 (2001).</li><li>Mathews, C. E., Graser, R. T., Savinov, A., Serreze, D. V., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unusual+resistance+of+ALR/Lt+mouse+beta+cells+to+autoimmune+destruction:+role+for+beta+cell-expressed+resistance+determinants.">Unusual resistance of ALR/Lt mouse beta cells to autoimmune destruction: role for beta cell-expressed resistance determinants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , 235-240 (2001).</li><li>Szabadkai, G., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+mediated+cell+death+in+diabetes.">Mitochondria mediated cell death in diabetes.</a> Apoptosis. 14, 1405-1423 (2009).</li><li>Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+membrane+potential+(deltapsi(m))+in+apoptosis;+an+update.">The mitochondrial membrane potential (deltapsi(m)) in apoptosis; an update.</a> Apoptosis. 8, 115-128 (2003).</li><li>Dudek, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+T-cells+from+T-cell+receptor+transgenic+NOD8.3+mice+destroy+beta-cells+via+the+perforin+and+Fas+pathways.">Cytotoxic T-cells from T-cell receptor transgenic NOD8.3 mice destroy beta-cells via the perforin and Fas pathways.</a> Diabetes. 55, 2412-2418 (2006).</li><li>Pakala, S. V., Chivetta, M., Kelly, C. B., Katz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+autoimmune+diabetes+the+transition+from+benign+to+pernicious+insulitis+requires+an+islet+cell+response+to+tumor+necrosis+factor+alpha.">In autoimmune diabetes the transition from benign to pernicious insulitis requires an islet cell response to tumor necrosis factor alpha.</a> J Exp Med. 189, 1053-1062 (1999).</li></ol>

Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e dei regolamenti previsti dalla University of Animal Care Florida e del Comitato Istituzionale Usa.

Cellule T citotossiche mediate la morte delle cellule beta è la fisiopatologia principale di diabete di tipo 1 5. Saggi di CML con 51 rilascio Cr ci permettono di studiare il grado di effettrici bersaglio risposta 6. Tuttavia, il processo dettagliate e percorsi di T mediata dalle cellule morte delle cellule beta non è ancora pienamente compreso. Dal momento che i mitocondri sono fondamentali per la funzione delle cellule beta e la morte 7, ci siamo concentrati sui cambiament...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> CR-51 </td><td> Perkin Elmer </td><td> NEZ030500IMC </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-60 </td><td></td></tr><tr><td> Tetrametil rodamina estere metilico (TMRM) </td><td> Invitrogen </td><td> T668 </td><td></td></tr><tr><td> PicoGreen </td><td> Invitrogen </td><td> P7581 </td><td></td></tr><tr><td> AI4 mimotopo </td><td> mimotopes.com </td><td> aminoacido sequenza: YFIENYLEL </td><td></td></tr><tr><td> IL-2 </td><td> R &amp; S </td><td> 485-MI </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11885 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30071.03 </td><td></td></tr><tr><td> Albumina di siero bovino </td><td> Sigma </td><td> A8412 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Cellgro </td><td> 25-060-Cl </td><td></td></tr><tr><td> MEM aminoacidi non essenziali </td><td> GIBCO </td><td> 11140 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina </td><td> Gemelli </td><td> 400-109 </td><td></td></tr><tr><td> Rosso fenolo senza DMEM </td><td> Sigma </td><td> D5303 </td><td></td></tr><tr><td> Incubatore CO2 </td><td> Thermo Fisher </td><td> HERAcell 150i </td><td> Mantenuto sterile per colture cellulari </td></tr><tr><td> Cappa di sicurezza biologica </td><td> Thermo Fisher </td><td> Forma 1440 </td><td></td></tr><tr><td> Tubi cultura usa e getta, 6x50 millimetri di vetro Lime </td><td> Pescatore </td><td> 14-958-A </td><td></td></tr><tr><td> Gamma contatore </td><td> Perkin Elmer </td><td> Wizard 1470 Gamma contatore automatico </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio confocale </td><td> Zeiss </td><td> Confocale LSM 510 Meta </td><td> Con stadio motorizzato e la camera di cellule vive </td></tr><tr><td> Pipetta (1 ml, 200μl, 20μl, 10μl, 2μl) </td><td> Eppendorf </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tubi (Ambra) </td><td> Pescatore </td><td> 50819772 </td><td></td></tr><tr><td> Centrifuga </td><td> Sorvall Legenda RT + </td><td> 75004377 </td><td></td></tr><tr><td> Emocitometro </td><td> Fisher Scientific </td><td> 267110 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio verticale </td><td> Zeiss </td><td> Axioskop40 </td><td></td></tr><tr><td> NOD.Cg-RAG1 tm1Mom Tg (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ Mice </td><td> The Jackson Laboratory </td><td> 004347 </td><td></td></tr><tr><td> NOD.Cg-RAG1 tm1Mom Tg (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ Mice </td><td> The Jackson Laboratory </td><td> 004348 </td><td></td></tr><tr><td> NOD-AI4α / mice β F1 </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Impianto di animali allevati in UF </td></tr></tbody></table>

methods to assess beta cell death mediated by cytotoxic t lymphocytes

Diabete di tipo 1 (T1D) è una malattia mediata da cellule T autoimmuni. Durante la patogenesi, i pazienti diventano progressivamente più insulinopenic come la produzione di insulina è perso, probabilmente questa è dovuta alla distruzione delle cellule beta pancreatiche da parte delle cellule T. La comprensione dei meccanismi di morte delle cellule beta durante lo sviluppo del diabete di tipo 1 fornirà spunti per generare una cura efficace per questa malattia. Cellulo-mediata linfocitotossicità (LMC), saggi, storicamente, hanno utilizzato il radionuclide cromo 51 (51 Cr) per etichettare le cellule bersaglio. Questi obiettivi sono quindi esposti alle cellule effettrici e il rilascio di 51 Cr da cellule bersaglio viene letto come un&#39;indicazione di mediata dai linfociti morte cellulare. Inibitori di conseguenza la morte cellulare in versione ridotta di 51 Cr. Come cellule effettrici, abbiamo utilizzato un autoreattivi attivati ​​popolazione clonale di CD8 + linfociti T citotossici (CTL) isolato da un topo transgenico magazzino sia per l&#39;alfa e catene beta del recettore AI4 delle cellule T (TCR). AI4 cellule T attivate sono state co-coltura con 51 cellule bersaglio Cr etichettati NIT per 16 ore, il rilascio di 51 Cr è stato registrato per calcolare lisi specifiche Mitocondri partecipare a molti eventi fisiologici importanti, come la produzione di energia, regolazione della trasduzione del segnale, e l&#39;apoptosi. Lo studio delle cellule beta cambia mitocondriale funzionale durante lo sviluppo di diabete di tipo 1 è una zona nuova della ricerca. Utilizzando il potenziale di membrana mitocondriale colorante tetrametile rodamina estere metilico (TMRM) e confocale di immagini microscopiche cellule vive, abbiamo monitorato il potenziale della membrana mitocondriale nel corso del tempo nella linea di cellule beta NIT-1. Per gli studi di imaging, le cellule T effettrici AI4 sono stati etichettati con il colorante fluorescente nucleare colorazione PicoGreen. NIT-1 le cellule e le cellule T sono state co-coltura in chambered coprioggetti e montato sul palco microscopio dotato di una camera di cellule vive, controllata a 37 ° C, con il 5% di CO 2, e umidificata. Durante questi esperimenti immagini sono state prese di ogni cluster ogni 3 minuti per 400 minuti. Più di un corso di 400 minuti, abbiamo osservato la dissipazione del potenziale di membrana mitocondriale in NIT-1 gruppi di cellule in cui sono state allegate AI4 cellule T. Nell&#39;esperimento controllo simultaneo in cui NIT-1 cellule sono state co-coltura con MHC mis-matched cellule umane Jurkat linfociti, potenziale di membrana mitocondriale è rimasto intatto. Questa tecnica può essere usata per osservare in tempo reale i cambiamenti del potenziale di membrana mitocondriale nelle cellule sotto l&#39;attacco dei linfociti citotossici, citochine o altri reagenti citotossici.

Watch this Scientific Journal Video about Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes at JoVE.com

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Cellulo-mediata linfocitotossicità (LMC) test può essere usato per testare le risposte autoreattivi e lo studio dei meccanismi di morte cellulare in vitro. Tuttavia, utilizzando tecniche confocale live-cell immagini microscopiche con coloranti fluorescenti, il tipo e la cinetica di morte cellulare così come i percorsi utilizzati possono essere studiati in maggiore dettaglio.

Metodi per valutare la morte delle cellule beta Mediata da linfociti T citotossici

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

methods-to-assess-beta-cell-death-mediated-by-cytotoxic-t-lymphocytes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.3K Views.  University of Florida. Cellulo-mediata linfocitotossicità (LMC) test può essere usato per testare le risposte autoreattivi e lo studio dei meccanismi di morte cellulare in vitro. Tuttavia, utilizzando tecniche confocale live-cell immagini microscopiche con coloranti fluorescenti, il tipo e la cinetica di morte cellulare così come i percorsi utilizzati possono essere studiati in maggiore dettaglio.