JH desidera riconoscere e ringraziare mentore, amico ed ex direttore di Valerie Berry per primo ci ha insegnato questo modello; e Gary Woodnutt, che ci ha insegnato le basi della e ispirato il nostro impegno nel campo della antibatterico PK / PD. Tutti gli autori desiderano ringraziare David Payne per il suo sostegno e apprezzamento per la nostra scienza. Vorremmo riconoscere la nostra prima in vivo colleghi di microbiologia che hanno contribuito al corpo di dati generati utilizzando questi metodi, soprattutto Pete DeMarsh, Rob Straub, Roni Page e Nerissa Simon. Infine, il nostro ringraziamento va ai nostri colleghi in vitro microbiologia per la loro assistenza, in particolare per la fornitura di tutte le MIC noi richiesta (Lynn McCloskey, Josh occidentale e Sharon min); e per il nostro team di microbiologia clinica che offre consulenza e supporto (Linda Miller, Nicole Scangarella-Oman e Deborah Butler).

<ol>
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Gli autori sono tutti dipendenti della GlaxoSmithKline Pharmaceuticals e azioni proprie di azioni versate all&#39;interno della società.

Per il successo ottimale nel riprodurre questo modello di infezione, i seguenti suggerimenti supplementari dovrebbero essere prese in considerazione. Virulenza dei nuovi isolati può essere migliorata passaging 2 - 3 volte in vivo prima utilizzazione in uno studio. Ceppi batterici congelati devono sempre essere preparati da un primario in vivo fonte -derived con il minor numero di passaggi possibile rispetto all&#39;originale, e ricongelamento o riutilizzo del magazzino scongelati è scoraggiato. Utilizzando isolati clinici recenti recuperati da pazienti affetti da polmonite, e / o la preparazione di culture in crescita fase di registro può anche contribuire a migliorare istituzione dell&#39;infezione. Una diluizione di cinque volte in agar (ad esempio 2 ml di sospensione salina aggiunto 8 mL agar) può essere usato al posto di dieci volte per aumentare l&#39;inoculo batterico, e il volume inoculo può essere regolata in base alle dimensioni dell&#39;animale (es 200 ml / animale di solito è inoculati in 250 g ratti). Prima dell&#39;aggiunta della sospensione batterica salina nelagar (cioè al punto 2.3), la densità batterica può essere prevista o stimata mediante ispezione visiva, gli standard MacFarland o misure di densità ottica. E &#39;utile per acquisire familiarità con le caratteristiche di crescita in vitro per ogni isolato prima di condurre esperimenti in vivo. Consistenza della crescita e movimentazione consente la stima più accurata della densità batterica per un dato isolato. metodi microbiologici standard diversi da quelli descritti, ad esempio media e omogeneizzatori tessuto alternativa, possono essere utilizzati come appropriato per la preparazione di inoculi e la conta dei batteri da tessuti infetti. Si consiglia vivamente di preparare o sciogliere l&#39;agar il giorno prima dell&#39;esperimento e riporlo durante la notte in un bagno d&#39;acqua separata impostato a 50 ° C. Ciò semplifica il processo e contribuire guardia contro l&#39;agar essere troppo caldo al momento dell&#39;infezione. Una temperatura di 41-42 ° C raggiunge un buon equilibrio tra manutenzione suning l&#39;agar allo stato liquido, senza essere troppo caldo per la sopravvivenza dei batteri a breve termine. Come possibile alternativa agar nutritivo, nobile agar è stato usato con successo in alcuni esperimenti. Un tubo di agar inoculo è solitamente sufficiente per un intero esperimento (ed è raccomandato), ma più provette può essere preparato per infettare un gran numero di animali (ad esempio più di 60), o quando il processo infettare richiede più di 30 - 45 min Se più tubi inoculo sono necessari, aggiungere la sospensione batterica salina per ciascun tubo di agar in quanto è necessario. Questo riduce il rischio che la sopravvivenza e / o idoneità batterica saranno influenzati dalla prolungata esposizione ad una temperatura elevata prima dell&#39;inoculo. Va notato che utilizzano tubi inoculo multipli possono anche richiedere ulteriori procedure animale randomizzazione. Per quanto possibile, di infettare tutti gli animali della stessa preparazione inoculo. Si consiglia di adattare la dimensione di esperimenti per l&#39;attuale livello di competenza con la TEchnique. Uno scienziato esperto può intubazione e inoculare un animale in meno di 30 s e inoculare fino a 5 - 6 animali per partita (ossia con una siringa piena di inoculo agar). Per coloro apprendimento della tecnica, la velocità è importante come agar inizierà a solidificare; Tuttavia, il posizionamento accurato del inoculo è più importante. Iniziare con 1 o 2 animali per partita, e aumentare la tecnica diventa più familiare. Gli animali continuano a respirare durante l&#39;intubazione; pertanto, la finestra temporale per l&#39;inoculazione dipende da quanto velocemente l&#39;animale recupera da isoflurano, che dovrebbe essere di circa 2 - 3 min. Gli animali che risvegliano durante il processo possono essere ri-anestetizzati e hanno tentato una seconda volta, ma non è raccomandato di farlo più volte. inoculazione di successo al primo tentativo è previsto in quasi il 100% degli animali una volta che si ottiene competenza. Si noti che è più facile imparare la tecnica utilizzando ratti prima; topi sono più delicate e minore troppoLS sono più inclini a blocco con agar solidificato se non manipolato in fretta. siringhe pre-riscaldamento, tubi e saline così come mantenere il dispositivo di intubazione su una superficie calda (non bollente), come ad esempio una piastra elettrica sulla regolazione bassa, possono aiutare a prevenire la solidificazione del agar. Quando imparare la tecnica, è anche utile per praticare il corretto posizionamento del inoculo utilizzando un colorante di colore scuro (come il blu di metilene concentrato) invece della sospensione batterica in agar. Eseguire la procedura descritta, ma l&#39;eutanasia dell&#39;animale subito dopo l&#39;inoculazione del colorante (non permettendo all&#39;animale di recuperare tra anestesia e l&#39;eutanasia). Sezionare per determinare dove il colorante è stato immesso, e regolare tecnica conseguenza. L&#39;endpoint primario in questo modello è CFU dai polmoni infetti. La sopravvivenza non è un buon indicatore di carica batterica e non è un endpoint consigliato. Per gli studi di efficacia, la suggerita N è di 5 - 6 animali per gruppo come questo è predicted per rilevare ≥1 log10 differenze CFU tra i gruppi con almeno il 90% di potenza. Gli animali possono essere infettati in gruppi in modo tale che compagni di gabbia rimangano insieme, o di un vero e proprio processo di randomizzazione possono essere seguiti. Si noti che se i gruppi sono assegnati da gabbia, i gruppi dovrebbero essere infettati in sequenza casuale con i controlli di crescita di fine studio infetti ultima (per confermare che la sopravvivenza batterica / fitness non è stata influenzata dalla lunghezza del tempo esposto ad una temperatura elevata nel bagnomaria). Metodi dati censurare dovrebbe essere necessario, e nessuno è consigliato con l&#39;eccezione di rimozione immediata di qualsiasi animale che è stata ovviamente mis-inoculati all&#39;inizio dello studio (prima dell&#39;inizio di eventuali trattamenti). Gli animali che sono eutanasia prima della fine dello studio dovrebbero essere campionati e risultati incluse nei set di dati a meno che un motivo valido per l&#39;esclusione è stata identificata in modo prospettico (vale a dire un evento estraneo alla infezione o trattamento). riporto farmaco può affect alcuni campioni ed è una considerazione importante in tutti i modelli di infezione in vivo. Se un composto viene determinata frequenza, vicino al tempo dell&#39;eutanasia o ha una lunga emivita, può essere presente nel tessuto omogenato ad una concentrazione sufficientemente elevata per continuare a uccidere i batteri ex vivo durante il processo di enumerazione batterica (diluizione e la placcatura di i campioni o sulle piastre di agar durante l&#39;incubazione durante la notte). Per evitare questo, carbone attivo e / o un additivo che degrada la molecola attiva senza danneggiare le cellule batteriche possono essere aggiunti al campione prima della omogeneizzazione. Altri metodi includono centrifugazione dei campioni per rimuovere la maggior parte del composto attivo (che dovrebbe rimanere nel supernatante) e impiegando diversa diluizione e placcatura regimi diluire sufficientemente composto attivo ad una concentrazione non-inibitrice. Come evidenziato dagli esempi illustrati nella Figura 2, questo modello con successo induces infezioni polmonari nei roditori con una vasta gamma di organismi, compresi quelli che non crescono bene in altri modelli (ad esempio H. influenzae). Queste infezioni sono coerenti e riproducibili, riducendo la probabilità che dovranno essere ripetuti a causa di insufficienza modello e / o scarso rendimento con un dato isolato esperimenti. Anche se gli animali sono immunocompetenti, non sono in grado di risolvere rapidamente l&#39;infezione, se non del tutto. Questo consente una maggiore flessibilità nella durata dello studio, come molti isolati mantengono una infezione fattibile attraverso almeno 96 h senza la necessità di iniezioni ripetute di mantenere neutropenia. Il potenziale vantaggio di studiare l&#39;efficacia antibatterica negli animali immunocompetenti è stato notato in precedenza 20, 21, e ci sono prove che, per alcuni composti (ad esempio ossazolidinoni), i dati di roditori non neutropenici possono più prevedere con precisione obiettivi di esposizione umani rispetto a quelli neutropenia reso 5. L&#39;utilità polivalente tegli modello è dimostrata nelle figure 3 e 4 e tabelle 1 e 2. Questi studi sono parte di una grande raccolta di dati pubblicati e non pubblicati che è stato generato con questo modello di sostenere gli sforzi di ottimizzazione di piombo 16, 17, 22-24, per il confronto e la conferma del dosaggio umano proposto regimi 19, 25-29 e PK / PD caratterizzazione 18, 30-32 .While questo modello è inizialmente più complesso per condurre rispetto al metodo intranasale inalazione, ci sono molti vantaggi come descritto sopra. Con la pratica e l&#39;uso di routine, le tecniche dovrebbero diventare semplice da eseguire. Si può osservare in alcuni studi che la carica batterica al basale era inferiore a quello tipicamente mirata in altri modelli di infezione polmonare. Ciò è dovuto in gran parte alla diluizione richiesta in agar e il volume sfida piccola, particolarmente nei topi. Tuttavia, dovrebbe anche essere notatoche la crescita batterica è stata osservata in tutti i casi, anche quando il peso iniziale era relativamente basso. La carica batterica di riferimento obiettivo è 6-6,5 log10 CFU / polmoni (6.8 a 7.3 log 10 CFU / g di tessuto nei topi a base di peso medio del polmone), che corrisponde a densità stimate in pazienti umani con grave polmonite 33. Un fardello basale superiore può essere ottenuto concentrare ulteriormente l&#39;inoculo batterico o ritardando l&#39;inizio della somministrazione composti per consentire la crescita batterica supplementare; tuttavia, aumentando il carico sfida troppo può portare a malattie anormalmente grave ed acuta (cioè la morte in meno di 24 ore), che è refrattario a tutti i trattamenti antibatterici a prescindere di suscettibilità. Anche se l&#39;inoculo è inizialmente posizionato preferibilmente nel polmone sinistro dell&#39;animale, l&#39;infezione si diffonde generalmente in entrambi i polmoni. malattia progressiva dei polmoni, la diffusione dei batteri ad altri organi, e l&#39;eventuale morbidità è spesso observEd con S. pneumoniae, K. pneumoniae e P. aeruginosa. Di interesse, infezioni da H. influenzae e A. baumannii di solito sono più contenuti e raramente portano alla morte nel inoculi batterica prescritto. I risultati di efficacia ottenuti da questo modello hanno correlato bene con i profili di sensibilità in vitro così come bersagli PK / PD definiti. Riduzioni di carica batterica sono regolarmente osservati per isolati ritenuti suscettibili all&#39;agente in prova, mentre quelli mostre resistente considerati nessun cambiamento o crescita batterica sopra il basale 16, 17, 19, 24-29. Studi condotti su ratti valutano due chinoloni e un macrolide utilizzando questo modello 32 hanno dimostrato che la porta PK / PD necessarie per un 1-log 10 riduzione S. pneumoniae rispetto al basale correlata con l&#39;obiettivo determinato topi neutropenici e, soprattutto, con obiettivi clinici per pneum batterica acquisita in comunitàonia 6, 7, 34, 35. Gepotidacin, un nuovo meccanismo di antibiotici, è stato testato contro multipla S. pneumoniae e ha richiesto un simile obiettivo PK / PD per un 1-log 10 riduzione di questo polmone modello di infezione 31 come quello richiesto per un 1-log 10 riduzione, nel modello coscia neutropenico 36 in cui la penetrazione del polmone è stato preso in considerazione (i dati su file). Allo stesso modo, i PK / PD obiettivi stabiliti nei topi per GSK2251052 contro P. aeruginosa sono stati coerenti per la stasi, 1 e 2 log10 riduzioni CFU tra questo modello polmone 30 e il modello di infezione coscia neutropenia in cui la penetrazione del polmone era considerato 37, 38 . Correlazione con un modello di infezione polmonare neutropenia con l&#39;inoculazione intranasale era povera; tuttavia, GSK2251052 non produceva più di una risposta statica in questo studio 38. Questo può essere attribuibile alla inoculo batterico superiore, che era 8 log 10 CFU / topo rispetto ai 6 log <sub&gt; 10 CFU / mouse nella neutropenico coscia 37 e intratracheale intubazione 30 modelli. Raccolta di dati di questo tipo è fondamentale per il benchmarking, in quanto consente un confronto diretto con i modelli esistenti e correlazione con i dati clinici per valutare la capacità predittiva traslazionale. Un uso più diffuso del modello di intubazione endotracheale infezione polmonare fornirà dati aggiuntivi per questi tipi di analisi. Esistono diverse limitazioni di questo modello polmonite immunocompetenti. In primo luogo, non è ben adatto a valutare comparsa di resistenza spontanea perché l&#39;alto inoculo batterico generalmente richiesto per tali studi si traduce in troppo grave un&#39;infezione. Dopo i tentativi di raggiungere oneri batteriche di 7 o 8 log 10 CFU al basale, la rapida morbilità è stato osservato (cioè gli animali che diventano moribondo in meno di 24 ore), nonostante il lavaggio accurato della inoculi per eliminare le tossine pre-esistente (dati su file). essopuò essere possibile superare questo problema utilizzando i roditori più grandi. Ratti, ratti particolarmente pesanti (&gt; 250 g), sembrano tollerare meglio superiore inoculi rispetto a topi e possono essere adatti per questi tipi di studi. Una seconda limitazione è che l&#39;uso di agar come un&#39;infezione-enhancer può precludere utilizzando il modello per la valutazione di alcuni host: patogeno. Si ritiene che l&#39;agar fornisce un punto focale protetta fino infezione è completamente stabilito all&#39;interno del polmone. E &#39;possibile consegnare l&#39;inoculo in soluzione salina invece di agar per aiutare a superare questo problema; Tuttavia, va notato che questo produrrà soltanto l&#39;infezione con alcuni isolati. In terzo luogo, vi è una curva di apprendimento ripida necessaria per diventare esperti nella tecnica. La procedura può essere delicato, soprattutto nei topi. È facile posizionare erroneamente la cannula metallica nell&#39;esofago, e forza eccessiva può portare alla puntura sia dell&#39;esofago o della trachea. posizionamento attento del inoculo è anchetenuti o animali possono o non recuperare o non essere adeguatamente infetti. Tuttavia, con pazienza e perseveranza, si può diventare altamente competente ed eseguire la tecnica in modo rapido, agevole e preciso. Rimuovendo il requisito per la neutropenia, aumentare la robustezza e la riproducibilità, permettendo ai ricercatori di studiare di più agenti patogeni e isolati, migliorare la flessibilità del disegno sperimentale e di fornire una infezione difficile da caratterizzare farmacodinamica per la polmonite, questo modello infezione polmonare immunocompetenti aggiunge valore sostanziale alla scoperta di antibiotici comunità. Un maggiore uso di questo modello dagli investigatori ulteriori contribuirà a fornire l&#39;analisi comparativa necessario per la sua guadagnare più diffusa accettazione e continuare a fornire informazioni di supporto per l&#39;interpretazione appropriata.

Valutare l&#39;efficacia di potenziali farmaci candidati in modelli animali di infezione è una componente fondamentale del processo di scoperta di nuovi farmaci antibatterici. In vivo studi di efficacia forniscono dati importanti per il processo decisionale in tutto l&#39;arco di attività di scoperta, da chiarire le relazioni struttura-attività (SAR) e l&#39;ottimizzazione serie chimica piombo attraverso la determinazione di farmacocinetica-farmacodinamica (PK / PD) caratteristiche di composti e sostenere la selezione della dose per sviluppo clinico e l&#39;approvazione regolamentare. Numerosi modelli di infezione animale sono descritti in letteratura per questi scopi. Uno dei modelli più comuni e diffusi è il neutropenico infezione del mouse coscia, che è stato lanciato da Aquila 1, 2 e successivamente ampliato da Vogelman e Craig 3, 4. Questo modello è stato prezioso per supportare la determinazione dei punti di interruzione di sensibilità batterica e per fornire obiettivi PK / PD per il dosaggio umana. Ci sono molti esamiples dove la capacità predittiva di questo modello è stato dimostrato 4-7. Tuttavia, uno degli svantaggi del modello di infezione coscia è la mancanza di rilevanza diretta per le infezioni polmonari. Vi è ora una maggiore enfasi sulla corrispondenza del sito di infezione in modelli animali al sito di infezione negli esseri umani; e quindi, per studiare composti per il trattamento di polmonite, è ideale per utilizzare un modello di infezione polmonare in animali. Diversi metodi per indurre infezioni polmonari in animali da laboratorio sono stati descritti ed utilizzati per studi di efficacia antibatteriche compresa intranasale inalazione, l&#39;aspirazione per via orofaringea, l&#39;esposizione dell&#39;aerosol e chirurgica inoculazione intratracheale 8. In molti casi, gli animali (in particolare topi) devono prima essere resi neutropenia per ottenere una infezione polmonare robusta. Nonostante questo stato gravemente immunocompromessi, il numero di batteri patogeni e ceppi che producono infezioni vitali nei roditori èlimitato. Ad esempio, può essere difficile stabilire con successo Haemophilus influenzae o Acinetobacter baumannii in modelli polmonite 9, 10, e anche più virulenti patogeni, come ad esempio lo Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa e Klebsiella pneumoniae, può rappresentare sfide 11-13. Nel 1991, Smith ha descritto un modello di infezione polmonare nei ratti appena svezzati immunocompetenti in cui l&#39;infezione è stata fondata da instillare batteri direttamente nei polmoni tramite un semplice metodo di intubazione endotracheale non chirurgico 14. Berry et al. successivamente modificato il metodo per infettare i topi 15. Usando un inoculo di agar-based, questa tecnica di inoculazione induce infezioni polmonari robusti in ratti e topi immunocompetenti con S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa e A. baumannii. Si è suscettibile di una vasta gamma di isolati, comprese quelle ospitare diversi resistdeterminanti ANCE e quelli che non producono una infezione praticabile attraverso altre vie di inoculazione. Consente inoltre l&#39;efficacia da determinarsi animali immunocompetenti, una condizione che è più rilevante rispetto al modello tradizionale del mouse neutropenico per popolazioni di pazienti che non sono gravemente immunocompromessi. La consistenza e l&#39;affidabilità di questo modello su più agenti patogeni e isolati rende particolarmente adatto per studi di efficacia antibatterica.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>TSA II Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood</td>
			<td>Becton Dickinson and Company</td>
			<td>4321261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chocolate II Agar</td>
			<td>Becton Dickinson and Company</td>
			<td>4321267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Brain Heart Infusion Broth Modified</td>
			<td>Becton Dickinson and Company</td>
			<td>299070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Trypticase Soy Broth with 20% Glycerol</td>
			<td>Becton Dickinson and Company</td>
			<td>297808</td>
			<td>storage media for frozen stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating loop</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>251586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride, USP</td>
			<td>Baxter Healthcare Corporation</td>
			<td>NDC 0338-0048-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Nutrient Agar</td>
			<td>Becton Dickinson and Company</td>
			<td>213000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 ml free standing centrifuge tube with cap</td>
			<td>EverGreen Scientific</td>
			<td>222-3530-G80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Polypropylene Conical Tube 30 x115mm</td>
			<td>Falcon, a Corning Brand</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 ml Polypropylene Round-Bottom Tube 17 x 100mm</td>
			<td>Falcon, a Corning Brand</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guide Tool</td>
			<td>Intek Services Ltd</td>
			<td>GT01</td>
			<td>custom-made metal cannula for rats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90&#39; Portex tubing</td>
			<td>SAI</td>
			<td>POR-080-100</td>
			<td>plastic cannula for rats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml TB syringe slip tip</td>
			<td>Becton Dickinson and Company</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle 25G x 5/8</td>
			<td>Becton Dickinson and Company</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal feeding needle - straight 20x3&#34; 2-1/4</td>
			<td>Popper and Sons, Inc</td>
			<td>7903</td>
			<td>used to create metal cannula for mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intramedic polyethylene tubing</td>
			<td>Clay Adams brand - Becton Dickinson and Company</td>
			<td>427401</td>
			<td>plastic cannula for mouse&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 TN 5.0ul syringe 26s/2&#34;/2</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87930</td>
			<td>HPLC glass injection syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex tube, culture 25x150 screwcap with rubber liner</td>
			<td>Corning</td>
			<td>9825-25</td>
			<td>to autoclave/store metal cannulae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% isopropyl alcohol</td>
			<td>Vi-Jon (Swan)</td>
			<td>NDC 0869-0810-43</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP</td>
			<td>Piramal Healthcare</td>
			<td>NDC 66794-013-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stomacher&#160;</td>
			<td>Seward</td>
			<td>Stomacher80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stomacher 80 classic bags</td>
			<td>Seward</td>
			<td>BA6040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay plate, 96 well, round bottom</td>
			<td>Costar, Corning Inc</td>
			<td>3795</td>
			<td>optional, for serial diluting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Omni Plates</td>
			<td>Hardy</td>
			<td>#A127</td>
			<td>optional, rectangular blood plates</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a robust pneumonia model in immunocompetent rodents to evaluate antibacterial efficacy against s. pneumoniae, h. influenzae, k. pneumoniae, p. aeruginosa or a. baumannii

L&#39;efficacia di candidati trattamenti antibatterici deve essere dimostrato in modelli animali di infezione, come parte del processo di scoperta e lo sviluppo, preferibilmente in modelli che imitano l&#39;indicazione clinica prevista. Un metodo per indurre infezioni polmonari robusti in ratti e topi immunocompetenti è descritto che permette la valutazione dei trattamenti in un modello di gravi polmonite da S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae o A. baumannii. Gli animali sono anestetizzati, e un inoculo di agar-based si deposita in profondità nei polmoni tramite intubazione endotracheale non chirurgica. L&#39;infezione risultante è coerente, riproducibile e stabile per almeno 48 ore e fino a 96 ore per la maggior parte degli isolati. Studi con antibatterici commercializzati hanno dimostrato una buona correlazione tra l&#39;efficacia in vivo e in sensibilità in vitro, e la concordanza tra farmacocinetica / farmacodinamica obiettivi determinatoin questo modello e gli obiettivi clinicamente accettate è stato osservato. Sebbene non vi sia un investimento di tempo iniziale quando l&#39;apprendimento della tecnica, può essere eseguita rapidamente ed efficientemente una volta raggiunta competenza. I vantaggi del modello comprendono eliminazione del requisito di neutropenia, maggiore robustezza e riproducibilità, capacità di studiare più agenti patogeni e isolati, una maggiore flessibilità nel disegno dello studio e la creazione di una infezione difficile in un host immunocompetenti.

Gli strumenti necessari, orientamento dell&#39;animale, e la profondità di intubazione sono mostrati in Figura 1. Anche mostrato è un esempio rappresentativo di colonie che crescono su una piastra di agar dopo la diluizione seriale e la placcatura triplice copia di un campione omogenato polmone. Un aumento della carica batterica di vari log 10 CFU sopra controlli di base è tipicamente osservata nei polmoni infetti per isolati batterici più, anche dopo l&#39;infezione, 96 h, e la variabilità tra animali è basso (figura 2). Per alcuni H. influenzae, ci può essere poca crescita; tuttavia, l&#39;infezione non dovrebbe cominciare ad auto-determinazione entro un periodo di tempo 48 o 96 ore (Figura 2B). Questo modello di infezione polmonare può essere utilizzato durante l&#39;ottimizzazione di serie chimica piombo per sostenere SAR, come mostrato in figura 3 per i composti rappresentativi di due diverse serie 16, 17. Esso fornisce un costante, riproducibile incontratohod per valutare PK / PD negli animali immunocompetenti ed è stato utilizzato per determinare quella zona libera di droga sotto la curva concentrazione-tempo sopra la concentrazione minima inibente (fAUC / MIC) correlata con l&#39;efficacia di un polipeptide deformylase romanzo (PDF) inibitore contro S. pneumoniae e H. influenzae (Figura 4). Inoltre, gli obiettivi / MIC fAUC per stasi e un 1-log 10 CFU riduzione dai controlli di base sono stati determinati attraverso 11 S. pneumoniae e 5 isolati H. influenzae (Tabella 1) 18. Accoppiamento questo modello di infezione con un sistema di somministrazione di farmaci per ricreare profili farmacocinetici umani in ratti crea un potente strumento per valutare regimi di dosaggio umani prima degli studi clinici. Un esempio di questo è riassunto nella tabella 2, il che dimostra che una formulazione a rilascio prolungato di amoxicillina-acido clavulanico è stato più efficace regimi di dosaggio esistenti per gli organismi con ElevaTed MIC Valori 19. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55068/55068fig1.jpg" /> Figura 1: non chirurgico intratracheale intubazione. Gli strumenti sono indicati per intubazione ratto (A) e il mouse (B). Una volta anestetizzato, l&#39;animale deve essere posizionato come mostrato in C, con la testa a destra e la coda a sinistra se la persona che esegue la tecnica è destrorso. Mettere il dito indice sinistro delicatamente sulla gola per aiutare a palpare gli anelli tracheali per la conferma del posizionamento della cannula corretta. L&#39;inoculo deve essere collocato in profondità nel polmone sinistro, come mostrato nella vista ventrale di un polmone di ratto (D). Le colonie che crescono su agar dopo diluizione seriale e placcatura di un campione dovrebbe apparire simile a quello mostrato in E. Figura 1D, Copyright © Gill Smith [animali da laboratorio, Volume 25 (1991), G. Smith, Ametodo non chirurgico semplice di instillazione endobronchiale per la costituzione delle infezioni respiratorie nel ratto, pagine 46 - 49] 14. Ristampato con il permesso. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55068/55068fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55068/55068fig2.jpg" /> Figura 2: esempi rappresentativi di batterica crescita nei polmoni di animali infetti. Media ± deviazione dati CFU standard da N = 5 animali / gruppo viene mostrato per diversi isolati di S. pneumoniae (A), H. influenzae (B), P. aeruginosa (C), K. pneumoniae (D) e A. baumannii (E). La prima barra di ogni coppia (grigio chiaro) è la linea di base bacteonere rial a infezioni post 1 o 2 ore, mentre il secondo bar è il controllo della crescita di fine studio a 48 ore dopo l&#39;infezione (grigio scuro) o infezione dopo 96 h (nero). sono stati applicati No Metodi Censura dati; in tal modo, questi risultati includono i dati provenienti da tutti i 5 animali per gruppo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55068/55068fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55068/55068fig3.jpg" /> Figura 3: valutare l&#39;efficacia delle varie serie chimica durante l&#39;ottimizzazione di piombo. modelli di infezione polmonare, utilizzando le tecniche descritte sono stati utilizzati per esplorare le relazioni struttura-attività come parte di tipo abacterial programma IIA topoisomerasi. Promettenti composti 7 e 1 sono stati valutati contro i chinoloni-sensibili (A) 16 o resistenti ai chinoloni(B) 17 isolati di S. pneumoniae, rispettivamente. Ciascun simbolo rappresenta CFU determinato dai polmoni di un ratto con linee che rappresentano il gruppo media e deviazione standard. Limite inferiore di quantificazione (LLQ) era 1,7 log 10 CFU / polmoni. I composti sono stati pesati (56 o 112 mg di pura molecola genitore gratuito), sciolto in 9 ml di acqua sterile, diluita 3 ml in 3 ml di acqua (1: 1) e gestito da sonda gastrica di 1 ml / 125 g di ratto due volte al giorno ( 6 - 7 h a parte) per 2 giorni, a partire da dopo l&#39;infezione 1 h. controlli non trattato (NTC) sono stati campionati dopo l&#39;infezione 1 h per basale o trattate con soluzione salina e campionati alla fine dello studio (48 h) per i controlli di crescita. Figura 3A ristampato da Bioorganici &amp; Medicinal Chemistry Letters, Volume 21, TJ Miles et al, Novel cicloesil-amidi come antibatterici potenti di targeting di tipo batterico IIA topoisomerasi, Pages 7483 -. 7488, Copyright (2011) 16, con il permesso di Elsevier.Figura 3B ristampato da Bioorganici &amp; Medicinal Chemistry Letters, Volume 26, TJ Miles et al, triciclici Novel (ad es GSK945237) inibitori come potenti di tipo batterico IIA topoisomerasi, Pagine 2464 -. 2469, Copyright (2016) 17, con il permesso di Elsevier. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55068/55068fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55068/55068fig4.jpg" /> Figura 4: PK / PD Caratterizzazione di un inibitore PDF Novel. Modelli Emax sono stati creati utilizzando dosi che vanno dati di efficacia nei topi immunocompetenti infettati nel polmone con isolati di S. pneumoniae (A) o H. influenzae (B) per determinare gli obiettivi PK / PD per un inibitore PDF novel 18. Circlesrappresentare la carica batterica media 4-5 topi / gruppo trattato con dosi variabili di composto. Le analisi sono state eseguite per correlare l&#39;efficacia con libera dalla droga 24 ore AUC (circoli aperti) o AUC / MIC (cerchi pieni). Ristampato con il permesso, Copyright © American Society for Microbiology, [agenti antimicrobici e Chemioterapia, il volume 60, 2016, pagine 180 - 189] 18. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55068/55068fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> Stasi </td><td colspan="2"> 1-log 10 riduzione </td><td></td></tr><tr><td> Organismo </td><td> MIC (mg / ml) </td><td> R 2 per linea fit (%) </td><td> fAUC </td><td> fAUC / MIC </td><td> fAUC </td><td> fAUC / MIC </td><td> Max uccisione (log 10 riduzione) </td></tr><tr><td> S. pneumoniae </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10127 </td><td> 0.25 </td><td> 99,9 </td><td> 2.0 </td><td> 8.1 </td><td> 3.6 </td><td> 14.4 </td><td> 2.8 </td></tr><tr><td> 1316009S </td><td> 0.25 </td><td> 96.1 </td><td> 6.5 </td><td> 26.0 </td><td> 15.1 </td><td> 60.3 </td><td> 1.8 </td></tr><tr><td> ATCC10813 </td><td> 0.5 </td><td> 100 </td><td> 8.4 </td><td> 16.9 </td><td> 22.2 </td><td> 44.5 </td><td> 1.2 </td></tr><tr><td> 1307007S </td><td> 1 </td&gt; <td> 95,8 </td><td> 16.1 </td><td> 16.1 </td><td> 20.1 </td><td> 20.1 </td><td> 2.7 </td></tr><tr><td> ATCC6303 </td><td> 1 </td><td> 99,8 </td><td> 19.8 </td><td> 19.8 </td><td> 24.8 </td><td> 24.8 </td><td> 2.8 </td></tr><tr><td> 1629 </td><td> 2 </td><td> 100 </td><td> 15.8 </td><td> 7.9 </td><td> 21.2 </td><td> 10.6 </td><td> 2.4 </td></tr><tr><td> 298.443 </td><td> 2 </td><td> 99,9 </td><td> 26,5 </td><td> 13.2 </td><td> 31,0 </td><td> 15.5 </td><td> 2.3 </td></tr><tr><td> 336.808 </td><td> 2 </td><td> 86 </td><td> 8.2 </td><td> 4.2 </td><td> 19,0 </td><td> 9.5 </td><td> 2.6 </td></tr><tr><td> 338.860 </td><td> 2 </td><td> 99.5 </td><td> 2.9 </td><td> 1.5 </td><td> 6.7 </td><td> 3.4 </td><td> 2.8 </td></tr><tr><td> &amp; #160; 340449 </td><td> 2 </td><td> 94,6 </td><td> 8.0 </td><td> 4.0 </td><td> 14.9 </td><td> 7.4 </td><td> 2.1 </td></tr><tr><td> L11259 </td><td> 2 </td><td> 100 </td><td> 7.1 </td><td> 3.5 </td><td> 9.0 </td><td> 4.5 </td><td> 2.0 </td></tr><tr><td> Media ± DS </td><td> NA un </td><td> N / A </td><td> 11.0 ± 7.5 </td><td> 11.0 ± 7.9 </td><td> 17.0 ± 8.2 </td><td> 19.5 ± 17.8 </td><td> 2.3 ± 0.5 </td></tr><tr><td> Mediano </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 8.2 </td><td> 8.1 </td><td> 19,0 </td><td> 14.4 </td><td> 2.4 </td></tr><tr><td> H. influenzae </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1998-100-126H </td><td> 1 </td><td> 99,7 </td><td> 7.3 </td><td> 7.3 </td><td> 13.4 </td><td> 13.4 </td><td> 2.9 </td></tr><tr><td> 503-008H </td><td> 1 </td><td> 99,8 </td><td> 7.1 </td><td> 7.1 </td><td> 13.9 </td><td> 13.9 </td><td> 2.7 </td></tr><tr><td> 08003H </td><td> 2 </td><td> 99,9 </td><td> 14.5 </td><td> 7.2 </td><td> 16,7 </td><td> 8.3 </td><td> 2.7 </td></tr><tr><td> H128 </td><td> 2 </td><td> 96.6 </td><td> 15.3 </td><td> 7.6 </td><td> 26.0 </td><td> 13,0 </td><td> 2.7 </td></tr><tr><td> 19001H </td><td> 4 </td><td> 91,9 </td><td> 14.8 </td><td> 3.7 </td><td> 37.3 </td><td> 9.3 </td><td> 3.0 </td></tr><tr><td> Media ± DS </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 11.8 ± 4.2 </td><td> 6.6 ± 1.6 </td><td> 21.5 ± 10.2 </td><td> 11.6 ± 2.6 </td><td> 2.8 ± 0.1 </td></tr><tr><td> Mediano </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 14.5 </td><td> 7.2 </td><td> 16,7 </td><td> 13,0 </td><td> 2.7 </td></tr><tr><td> un NA, non applicabile. </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 1: PK / PD Obiettivi per un inibitore PDF romanzo contro S. pneumoniae e H. influenzae Isolati. AUC libera dalla droga e AUC / MIC obiettivi di stasi e un 1-log 10 CFU riduzione dal basale sono stati determinati per 11 S. pneumoniae e 5 H. influenzae in topi immunocompetenti infettati nel polmone e trattati con il composto 18. il DATuna è stata utilizzata per aiutare a selezionare le dosi umane per lo sviluppo clinico. Questa tabella è stata adattata e ristampato con il permesso, Copyright © American Society for Microbiology, [agenti antimicrobici e Chemioterapia, il volume 60, 2016, pagine 180 - 189] 18. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> Gruppo di trattamento a </td><td colspan="8"> Significano log 10 S. pneumoniae (CFU / polmone) b ± SD per ceppo (AMX / CA MIC): </td></tr><tr><td> 05010S (2 mg / ml) </td><td> 16001S c (4 mg / ml) </td><td> 16001S (4 mg / ml) </td><td> 30005S (4 mg / ml) </td><td> 20009S (4 mg / ml) </td><td> 05003S (8 mg / ml) </td><td> 404.053 (8 mg / ml) </td><td> 47003S (8 mg / ml) </td></tr><tr><td> Controllo </strong&gt; </td><td> 7.3 ± 0.4 </td><td> 7,0 ± 0,8 </td><td> 5.7 ± 1.2 </td><td> 7.1 ± 0.7 </td><td> 7.1 ± 0.4 </td><td> 6.4 ± 0.6 </td><td> 6.8 ± 0.4 </td><td> 6.0 ± 0.3 </td></tr><tr><td> AMX / CA </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2.000 / 125 mg bid (rapporto 16: 1) </td><td> ≤ 1,7 ** </td><td> 2.8 ± 1.2 ** </td><td> 2.2 ± 0.8 ** </td><td> 2.3 ± 0.9 ** </td><td> 2,5 ± 0,9 ** </td><td> 2.0 ± 0.9 ** </td><td> 3.8 ± 1.4 ** </td><td> 1.8 ± 0.2 ** </td></tr><tr><td> 1.000 / 125 mg tre volte al giorno (rapporto 8: 1) </td><td> NT </td><td> NT </td><td> 2.8 ± 0.5 ** </td><td> 2.7 ± 1.3 ** </td><td> 3.3 ± 0.9 ** </td><td> 4.9 ± 0.5 ** </td><td> 6.6 ± 1.3 </td><td> 4.7 ± 0.7 ** </td></tr><tr> &lt;td&gt; 875/125 mg tid (rapporto 7: 1) </td><td> NT </td><td> NT </td><td> 3.0 ± 1.3 * </td><td> 2.1 ± 0.7 ** </td><td> 3.2 ± 0.4 ** </td><td> 5.2 ± 0.9 * </td><td> 6.4 ± 0.6 </td><td> 4.9 ± 0.4 ** </td></tr><tr><td> 875/125 mg bid (rapporto 7: 1) </td><td> NT </td><td> NT </td><td> 4,5 ± 1,2 * </td><td> 5.6 ± 1.3 * </td><td> 5.2 ± 0.7 ** </td><td> 6.3 ± 0.7 </td><td> 6.4 ± 0.7 </td><td> 5.5 ± 0.4 </td></tr><tr><td> 500/125 mg tre volte al giorno (rapporto 4: 1) </td><td> 3.1 ± 1.3 ** </td><td> 4,5 ± 0,9 ** </td><td> NT </td><td> NT </td><td> NT </td><td> NT </td><td> NT </td><td> NT </td></tr><tr><td> Azitromicina, 1.000 / 500 mg od </td><td> NT </td><td> NT </td><td> NT </td><td> 5.8 ± 2.0 </td><td> 7.1 ± 0.9 </td><td> 3.1 ± 1.0 ** </td><td> 6.6 ± 0.4 </td><td> 6.07; 0.6 </td></tr><tr><td> Levofloxacina, 500 mg od </td><td> NT </td><td> NT </td><td> 4.2 ± 0.8 * </td><td> 5.7 ± 0.8 * </td><td> 4.9 ± 0.8 ** </td><td> 3.0 ± 1.3 ** </td><td> 3.5 ± 0.2 ** </td><td> 3.9 ± 0.8 ** </td></tr><tr><td rowspan="2"> Gruppo di trattamento d </td><td colspan="8"> Media log 10 H. influenzae (CFU / polmone) ± SD per ceppo: </td></tr><tr><td colspan="4"> H128 (β-lattamasi positivi) </td><td colspan="4"> Chesterfield (β-lattamasi negativo, resistente ampicillina) </td></tr><tr><td> Controllo </td><td colspan="4"> 6.4 ± 0.6 </td><td colspan="4"> 6,7 ± 0,6 </td></tr><tr><td> AMX / CA </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2.000 / 125 mg bid (rapporto 16: 1) </td><td colspan="4"> 2.0 ± 0.7 ** </td><td colspan="4"> 3.1 ± 0.9 ** </td></tr><tr><td> 1.000 / 125 mg tre volte al giorno (rapporto 8: 1) </td><td colspan="4"> 2.1 ± 1.0 ** </td><td colspan="4"> 3.6 ± 1.1 ** </td></tr><tr><td> 875/125 mg TID (rapporto 7: 1) </td><td colspan="4"> 2.8 ± 1.3 ** </td><td colspan="4"> 3.8 ± 1.3 ** </td></tr><tr><td> 875/125 mg bid (rapporto 7: 1) </td><td colspan="4"> 2.0 ± 0.8 ** </td><td colspan="4"> 5.1 ± 1.1 ** </td></tr><tr><td> Azitromicina, 1.000 / 500 mg od </td><td colspan="4"> 3.2 ± 1.7 * </td><td colspan="4"> 5.8 ± 1.1 </td></tr><tr><td> Levofloxacina, 500 mg od </td><td colspan="4"> ≤ 1,7 ** </td><td colspan="4"> ≤ 1,7 ** </td></tr><tr><td colspan="9"> un AMX / CA, amoxicillina-acido clavulanico; offerta, due volte al giorno; tid., tre volte al giorno; od una volta al giorno. </td></tr><tr><td colspan="9"> B Il limite di rilevazione è stato &lt;1,7; *, Significativamente differenti dal controllo (P ≤ 0,05); **, Significativamente differenti dal controllo (P ≤ 0,01); NT, non testato. </td></tr><tr><td colspan="9"> c Strain 16001S è stato testato in due esperimenti separati. </td></tr><tr><td colspan="9"> d amoxicillina-acido clavulanico 500/125 mg (4: 1) tre volte al giorno non è stato testato contro i ceppi di H. influenzae. </td></tr></tbody></table> Tabella 2: Efficacia di Recreated plasma umano profili di esposizione per i diversi Amoxicillina / Clavulanate regimi di dosaggio. I dati generati nei ratti infetti immunocompetenti nel polmone con isolati di S. pneumoniae o H. influenzae che utilizzano questo modello hanno dimostrato che una migliore formulazione di amoxicillina-acido clavulanico (2, 000/125 mg due volte al giorno) è stato più efficace di regimi di dosaggio standard, nei confronti di isolati con elevata sensibilità in vitro 19. Questa tabella è stata adattata e ristampato con il permesso, Copyright © American Society for Microbiology, [agenti antimicrobici e Chemioterapia, il volume 49, 2005 pagine 908 - 915] 19.

Watch this Scientific Journal Video about A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or  

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or  A. baumannii

A method for establishing lung infections in immunocompetent rodents is described. With proficiency, this method can be performed quickly and easily to induce stable infection with many isolates of S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae and A. baumannii.

Una polmonite Modello robusto in immunocompetenti roditori per valutare antibatterico efficacia contro<i&gt; S. pneumoniae</i&gt;,<i&gt; H. influenzae</i&gt;,<i&gt; K. pneumoniae</i&gt;,<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; o<em&gt; A. baumannii</em

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, ...

a-robust-pneumonia-model-immunocompetent-rodents-to-evaluate

Research

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Immunology and Infection

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii

14.5K Views.  GlaxoSmithKline. A method for establishing lung infections in immunocompetent rodents is described. With proficiency, this method can be performed quickly and easily to induce stable infection with many isolates of S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae and A. baumannii.

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Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

Utilizzando Imaging Bioluminescent per Indagare il sinergismo tra Streptococcus pneumoniae E Influenza A virus in topi neonati

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

Cellulare Imaging in diretta di Bacillus subtilis E Streptococcus pneumoniae Utilizzando automatico Time-lapse Microscopia

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

Uso di un terreno dell&#39;espettorato artificiale per testare l&#39;efficacia degli antibiotici contro<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; In condizioni più rilevanti al polmone Fibrosi Cistica

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing the mucosal surface of the nasopharynx, where it can reside, multiply and eventually overcome host defences to invade to other tissues of the host. Establishment of an infection in the normally lower respiratory tract results in pneumonia. Alternatively, the bacteria can disseminate into the bloodstream causing bacteraemia, which is associated with high mortality rates2, or else lead directly to the development of pneumococcal meningitis. Understanding the kinetics of, and immune responses to, nasopharyngeal colonization is an important aspect of S. pneumoniae infection models.
Our mouse model of intranasal colonization is adapted from human models3 and has been used by multiple research groups in the study of host-pathogen responses in the nasopharynx4-7. In the first part of the model, we use a clinical isolate of S. pneumoniae to establish a self-limiting bacterial colonization that is similar to carriage events in human adults. The procedure detailed herein involves preparation of a bacterial inoculum, followed by the establishment of a colonization event through delivery of the inoculum via an intranasal route of administration. Resident macrophages are the predominant cell type in the nasopharynx during the steady state. Typically, there are few lymphocytes present in uninfected mice8, however mucosal colonization will lead to low- to high-grade inflammation (depending on the virulence of the bacterial species and strain) that will result in an immune response and the subsequent recruitment of host immune cells. These cells can be isolated by a lavage of the tracheal contents through the nares, and correlated to the density of colonization bacteria to better understand the kinetics of the infection.

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Colonization of the murine nasopharynx with Streptococcus pneumoniae and the subsequent extraction of adherent or recruited cells is described. This technique involves flushing the nasopharynx and collection of the fluid through the nares and is adaptable for various readouts, including differential cell quantification and analysis of mRNA expression in situ.

Caratterizzazione delle risposte infiammatorie durante la colonizzazione intranasale con streptococco pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact cellular functions, including energetics and signal transductions. While both fluorescent and electrophysiological methods, including electrode usage and patch-clamping, have been well developed for measuring these events in eukaryotic cells, methodology for measuring similar events in microorganisms have proven more challenging to develop given their small size in combination with the more complex outer surface of bacteria shielding the membrane. During our studies of death-initiation in Streptococcus pneumoniae (pneumococcus), we wanted to elucidate the role of membrane events, including changes in polarity, integrity, and intracellular ion concentrations. Searching the literature, we found that very few studies exist. Other investigators had monitored radioisotope uptake or equilibrium to measure ion fluxes and membrane potential and a limited number of studies, mostly in Gram-negative organisms, had seen some success using carbocyanine or oxonol fluorescent dyes to measure membrane potential, or loading bacteria with cell-permeant acetoxymethyl (AM) ester versions of ion-sensitive fluorescent indicator dyes. We therefore established and optimized protocols for measuring membrane potential, rupture, and ion-transport in the Gram-positive organism S. pneumoniae. We developed protocols using the bis-oxonol dye DiBAC4(3) and the cell-impermeant dye propidium iodide to measure membrane depolarization and rupture, respectively, as well as methods to optimally load the pneumococci with the AM esters of the ratiometric dyes Fura-2, PBFI, and BCECF to detect changes in intracellular concentrations of Ca2+, K+, and H+, respectively, using a fluorescence-detection plate reader. These protocols are the first of their kind for the pneumococcus and the majority of these dyes have not been used in any other bacterial species. Though our protocols have been optimized for S. pneumoniae, we believe these approaches should form an excellent starting-point for similar studies in other bacterial species.

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Unlike that seen for eukaryotes, there is a paucity of studies that detail membrane depolarization and ion concentration changes in bacteria, primarily as their small size makes conventional methods of measurement difficult. Here, we detail protocols for monitoring such events in the significant Gram-positive pathogen Streptococcus pneumoniae utilizing fluorescence techniques.

Monitoraggio dei cambiamenti di polarità membrana, membrana integrità e intracellulare di ioni concentrazioni in<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Utilizzo di tinture fluorescenti

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal epidemiology, capsular serotyping can provide useful information for vaccine efficacy and impact studies.&#160;The Quellung reaction is the gold standard method for pneumococcal capsular serotyping. The method involves testing a pneumococcal cell suspension with pooled and specific antisera directed against the capsular polysaccharide. The antigen-antibody reactions are observed microscopically. The protocol has three main steps: 1) preparation of a bacterial cell suspension, 2) mixing of cells and antisera on a glass slide, and 3) reading the Quellung reaction using a microscope. The Quellung reaction is reasonably simple to perform and can be applied wherever a suitable microscope and antisera are available.

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

The Quellung reaction is the gold standard technique for serotyping Streptococcus pneumoniae. This technique utilizes a microscope and specific pneumococcal antisera and is commonly used in reference and research laboratories worldwide.

Capsulare Sierotipizzazione di<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Utilizzo della reazione Quellung

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major cause of morbidity and mortality world-wide. Current vaccines target the pneumococcal capsule, and there are over 90 capsular serotypes. Serotyping pneumococcal isolates is therefore important for assessing the impact of vaccination programs and for epidemiological purposes. The World Health Organization has recommended latex agglutination as an alternative method to the &#8216;gold standard&#8217; Quellung test for serotyping pneumococci. Latex agglutination is a relatively simple, quick and inexpensive method; and is therefore suitable for resource-poor settings as well as laboratories with high-volume workloads. Latex agglutination reagents can be prepared in-house utilizing commercially-sourced antibodies that are passively attached to latex particles. This manuscript describes a method of production and quality control of latex agglutination reagents, and details a sequential testing approach which is time- and cost-effective. 
This method of production and quality control may also be suitable for other testing purposes.

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Latex agglutination testing is a simple, rapid and inexpensive method for serotyping Streptococcus pneumoniae, and has also been widely applied in diagnostic microbiology. This manuscript describes the in-house production of latex agglutination reagents, quality control procedures and the application of this technique to pneumococcal serotyping.

Capsulare Sierotipizzazione di<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Da agglutinazione al lattice

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major ...

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte function, in general these are limited in terms of the information they can provide. For example, most existing assays merely provide a percentage of how many granulocytes are activated following a single, fixed length incubation. Complicating matters, most assays focus on only one aspect of function due to limitations in detection technology. This report demonstrates a technique for simultaneous measurement of granulocyte phagocytosis of bacteria and oxidative burst. By measuring both of these functions at the same time, three unique phenotypes of activated granulocytes were identified: 1) Low Activation (minimal phagocytosis, no oxidative burst), 2) Moderate Activation (moderate phagocytosis, some oxidative burst, but no co-localization of the two functional events), and 3) High Activation (high phagocytosis, high oxidative burst, co-localization of phagocytosis and oxidative burst). A fourth population that consisted of inactivated granulocytes was also identified. Using assay incubations of 10, 20, and 40-min the effect of assay incubation duration on the redistribution of activated granulocyte phenotypes was assessed. A fourth incubation was completed on ice as a control. By using serial time incubations, the assay may be able to able to detect how a treatment spatially affects granulocyte function. All samples were measured using an image-based flow cytometer equipped with a quantitative imaging (QI) option, autosampler, and multiple lasers (488, 642, and 785 nm).

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.

Immagine a base di Citometria a flusso Tecnica per valutare le variazioni Granulocyte Funzione<em&gt; In Vitro</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We demonstrate the procedure for preparing H. influenzae inoculum, intra-tracheal instillation of H. influenzae into the lung, collection of broncho-alveolar lavage fluid (BALF), analysis of immune cells in the BALF, and RNA isolation for differential gene expression analysis. This procedure can be used to study the lung inflammatory response to any bacteria, virus or fungi. Direct tracheal instillation is mostly preferred over intranasal or aerosol inhalation procedures because it more efficiently delivers the bacterial inoculum into the lower respiratory tract with less ambiguity.

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

We demonstrate the procedure for intra-tracheal inoculation of Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. This is a very useful tool to study signaling pathways that regulate airway inflammation in mouse models.

Intra-tracheale Amministrazione<em&gt; Haemophilus influenzae</em&gt; In modelli murini per studiare infiammazione delle vie aeree

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Una polmonite Modello robusto in immunocompetenti roditori per valutare antibatterico efficacia contro

Riepilogo

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Utilizzando Imaging Bioluminescent per Indagare il sinergismo tra Streptococcus pneumoniae E Influenza A virus in topi neonati

Cellulare Imaging in diretta di Bacillus subtilis E Streptococcus pneumoniae Utilizzando automatico Time-lapse Microscopia

Uso di un terreno dell'espettorato artificiale per testare l'efficacia degli antibiotici contro

Caratterizzazione delle risposte infiammatorie durante la colonizzazione intranasale con streptococco pneumoniae

Monitoraggio dei cambiamenti di polarità membrana, membrana integrità e intracellulare di ioni concentrazioni in

Capsulare Sierotipizzazione di

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Immagine a base di Citometria a flusso Tecnica per valutare le variazioni Granulocyte Funzione

Intra-tracheale Amministrazione

Un test compatibile high-throughput per valutare Drug efficacia contro macrofagi diversi passaggi