Escherichia Coli è il batterio gram-negativo più comune che causa meningite neonatale. Il verificarsi di meningite batterica neonatale inizia puramente con la batteriemia e quindi i batteri nel sangue penetrano attraverso la barriera eencefalica per causare meningite. I neutrofili sono la prima linea di difesa contro le infezioni batteriche.
Durante l'invasione batterica, i neutrofili attivi rilasciano ROS. Il ROS rappresenta i principali meccanismi batteriocidi delle cellule ospiti per distruggere gli agenti patogeni invasori. Misurare la produzione di ROS nei neutrofili è un metodo utile per iniziare la difesa dell'ospite durante l'interazione batteri-ospite.
Prendi una singola colonia batterica dal piatto con una pipetta sterile e mettila in un mezzo di infusione Brain-Heart da cinque millilitri contenente Rifampicin in un pallone concavo. Incubare la coltura batterica a 37 centigradi, con 90 giri/min per 17 ore nello shaker di incubazione. Centrifugare i campioni di sangue periferico a 2000 giri/min per cinque minuti.
Dopo la centrifuga, i campioni di sangue vengono divisi in tre strati. Dal basso verso l'alto, lo strato di globuli rossi, lo strato di globuli bianchi e lo strato plasmatico. Aspirare lo strato di globuli bianchi a un nuovo tubo con una pipetta sterile.
Aggiungere tre volte il tampone dilisi dei globuli rossi. Frullare accuratamente la miscela e posizionarsi a temperatura ambiente per cinque minuti. Centrifugare il tubo a 2000 giri/min per cinque minuti.
Aspirare completamente il supernatante e scartare. Ripetere la procedura dilisi dei globuli rossi per una o due volte, fino a quando i sedimenti diventano bianchi. Lavare le cellule sospendendo il sedimento con due millilitri PBS.
Quindi centrifugare il tubo a 1000 giri/min per cinque minuti. Risosopendare il sedimento con un buffer di smistamento delle celle magnetiche precodifica di 15 microliter per 15 milioni di cellule. Aggiungere microperline magnetiche a 15 microliter e mescolare accuratamente.
Incubare la miscela a quattro centigradi per 30 minuti. In condizioni normali, l'essere umano adulto ha da quattro a 10.000 globuli bianchi per sangue microlitro. Quindi il costo dei globuli bianchi totali in cinque millilitri di sangue periferico umano, quasi meno di 50 milioni.
E 50 perline magnetiche a microliter in tampone magnetico da 15 microliter sono sufficienti. La percentuale normale dei neutrofili è dal 50 al 70% del totale dei globuli bianchi. Quindi circa 10 milioni di neutrofili possono essere ottenuti da cinque millilitri di sangue.
Lavare le cellule aggiungendo due tamponi magnetici di smistamento millilitro, per 10 milioni di cellule al tubo, e centrifugare a quattro centigradi, 1.200 rpm per 10 minuti. Assemblare la colonna magnetica e separare lo scaffale. Scartare completamente il supernatante e risosopendare i sedimenti con un tampone di smistamento magnetico a 500 microliter per un massimo di 100 milioni di cellule.
Risciacquare la colonna con un buffer di smistamento magnetico a tre millilitri. Applicare la sospensione cellulare sulla colonna per consentire ai neutrofili etichettati dalle perline magnetiche, attaccate alla colonna. Lavato via le celle specifiche non specifiche aggiungendo tre buffer di millilitro per tre volte, una volta che il serbatoio della colonna è vuoto ogni volta.
Rimuovere la colonna dal separatore magnetico e metterla in un nuovo tubo. Aggiungere cinque buffer di ordinamento magnetico millilitro nella colonna. Spingere fuori le celle magnetiche etichettate usando uno stantuffo.
Centrifugare il tubo a 1.200 giri/min per cinque minuti. Aspirare completamente il supernatante e rimescolare il sedimento con un mezzo di coltura millilitro. Determinare il numero di cella con un contatore.
Regolata la concentrazione cellulare a 2 milioni per millilitro nel mezzo di coltura contenente sonda a fluorescenza DHE. Posizionare i neutrofili nell'incubatrice per 30 minuti per caricare la sonda DHE. Allocare la sospensione cellulare a una micropiatta nera da 96 pozzetto con 200 microliter per pozzo.
Accendere il lettore di micropiatte. Impostare la temperatura su 37 centigradi, scegliere la modalità di lettura a fluorescenza, il tipo di lettura cinetica, impostare la lunghezza d'onda della fluorescenza. Scegliere il formato piastra.
Determinare l'area di lettura. Misurare l'intensità della fluorescenza ogni cinque minuti per un'ora. Agitare la piastra per tre secondi prima di ogni lettura.
Esegna la micropiatta dall'incubatrice. Aggiungere ceppi PMA o E44 con tre ripetizioni. Mettere la piastra nel lettore di micropiastrine, premere il pulsante start per iniziare immediatamente il test.
Utilizzando il profilo del protocollo in questo articolo, i neutrofili sono stati isolati dal sangue periferico umano e caricati con sonda a fluorescenza DHE. Aggiungendo PMA, il ROS intracellulare nei neutrofili, ha mostrato un aumento significativo da 20 a 40 minuti e ha raggiunto il picco a 60 minuti. Ma penso che i ceppi E44, la produzione di ROS avvenga immediatamente e aumenti il tempo in modo dipendente.
L'espressione del ROS causata dal ceppo E44 è simile a quella causata dal PMA. L'individuazione della produzione di ROS nei neutrofili può contribuire all'ulteriore studio dei meccanismi batteriocidi dei neutrofili. In questo protocollo, forniamo un modo più semplice per rilevare la produzione di ROS nei neutrofili in tempo reale.
Il metodo semplice potrebbe anche essere usato per monitorare la produzione di ROS in altri tipi di cellule ospiti durante le interazioni ospite-batterio.
