L'aumento delle prove suggerisce l'impatto della segnalazione degli estrogeni sulla parte colon della fisiologia, l'immunoistochimica è una tecnica promettente per identificare i recettori degli estrogeni nel colon e si evolvono in colite. Presentiamo un protocollo completo e convalidato per la visualizzazione immunoistochimica dei recettori degli estrogeni nel colon, utilizzando l'immunofluorescenza. Insieme alla Dott.ssa Sylwia Michlewska del Laboratorio di Imaging Microscopico dell'Università di Lodz, dimostreremo la procedura.
Mettere il colon in una piastra di Petri. Tagliare i due punti in frammenti da uno a due centimetri. Posizionare ogni frammento su una spugna in una cassetta istologica opportunamente etichettata.
Posizionare una cassetta contenente un frammento di due punti in paraformaldeide al 4%. Incubare per almeno 24 ore a quattro gradi celsius. Preparare e programmare il processore tissutale per un'ora di incubazione solo in 50%70%90%95% e 100%etanolo, xilene 100%etanolo e xilene, nonché per almeno tre ore di incubazione in paraffina liquida.
Trasferire il frammento del colon in una scatola istologica. Posizionare la scatola nel processore tissue pre-programmato ed eseguire il processore. Dopo l'incubazione nel processore tissutale rimuovere il colon dalla scatola istologica e posizionare il frammento del colon in uno stampo metallico, in modo che le due estremità del colon siano in posizione verticale.
Riempire un terzo dello stampo con paraffina liquida. Posizionare lo stampo nell'area di raffreddamento a meno cinque gradi Celsius per alcuni secondi, quindi spostare lo stampo nell'area di riscaldamento a 70 gradi celsius. Quindi posizionare lo stampo nella parte inferiore della scatola istologica e coprire l'intero frammento del colon con paraffina liquida.
Posizionare lo stampo metallico contenente il frammento del colon e la paraffina nell'area di raffreddamento per alcuni minuti. Quindi rimuovere lo stampo metallico dal colon e dal blocco di paraffina. Incubare il colon e il blocco di paraffina per almeno 24 ore a quattro gradi Celsius.
Dopo l'incubazione, rimuovere la paraffina in eccesso dal blocco. Inserire il colon e il blocco di paraffina in un microtomo rotante completamente automatizzato. Tagliare il frammento del colon in cinque sezioni di micrometro.
Trasferire una sezione del colon in un bagno d'acqua, preriscaldato a 40 gradi celsius. Utilizzare lo scivolo di vetro etichettato per rimuovere la sezione del colon dal bagno d'acqua e incubare lo scivolo di vetro a temperatura ambiente per 24 ore. In primo luogo, rimuovere la paraffina incubando lo scivolo di vetro in xilene per cinque minuti.
Ripetere questo passaggio tre volte. Quindi posizionare lo scivolo di vetro in una miscela uno-a-uno di xilene e 100%etanolo per cinque minuti. Ripetere questo passaggio tre volte.
Utilizzare una serie di concentrazioni di etanolo decrescente per reidratare la sezione del colon. Immergere lo scivolo nell'etanolo per cinque minuti. Ripetere tre volte ad ogni concentrazione prima di procedere alla concentrazione successiva.
Risciacquare lo scivolo di vetro sotto l'acqua corrente per cinque minuti. Surriscaldare il buffer di recupero dell'antigene a 95-98 gradi celsius. Quindi riscaldare lo scivolo di vetro in soluzione di recupero dell'antigene bollente per 10 minuti.
Per evitare sprechi di reagenti, utilizzare una penna idrofobica per disegnare un cerchio intorno alla sezione del colon. Quindi, incubare lo scivolo per 10 minuti in una soluzione al 3% di perossidasi e acqua di idrogeno. Lavare lo scivolo in soluzione di lavaggio per cinque minuti.
Quindi incubare lo scivolo nella soluzione di blocco per un'ora a temperatura ambiente. Rimuovere la soluzione di blocco e aggiungere da 20 a 50 microlitri di anticorpo primario contro E-R alfa, E-R beta o G-P-E-R diluiti. Incubare l'anticorpo primario durante la notte a quattro gradi Celsius nell'oscurità.
Rimuovere la soluzione anticorpale. Lavare lo scivolo tre volte in soluzione di lavaggio per cinque minuti ogni volta. Quindi, aggiungere anticorpi secondari diluiti.
Incubare lo scivolo con anticorpo secondario coniugato con colorante per un'ora a temperatura ambiente al buio. Rimuovere la soluzione anticorpale secondaria dallo scivolo. Lavare lo scivolo tre volte in soluzione di lavaggio per cinque minuti ogni volta.
Aggiungere il fluorocromo diluito per la visualizzazione della membrana e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente nell'oscurità. Rimuovere la soluzione e lavare lo scivolo tre volte in soluzione di lavaggio per cinque minuti ogni volta. Aggiungere alcune gocce di DAPI liquido a base di glicerolo, un fluorocromo per la visualizzazione dei nuclei cellulari, direttamente sulla sezione del colon.
Coprirlo con cura con uno scivolo di copertura. Incubare la sezione del colon per almeno 24 ore a quattro gradi celsius. Analizza la sezione del colon al microscopio confocale con obiettivi 20x o 63x e immersione dell'olio.
La specificità degli anticorpi utilizzati nello studio è stata convalidata utilizzando cellule MCF-7. Gli anticorpi del recettore degli estrogeni hanno permesso il rilevamento dei recettori degli estrogeni nucleari E-R alpha ed E-R beta, nonché del recettore degli estrogeni legato alla membrana G-P-E-R. È stato anche eseguito un controllo negativo in cui le cellule MCF-7 sono state macchiate solo con anticorpi secondari coniugati con fluorocromo e un liquido a base di glicerolo con DAPI.
Un forte segnale citoplasmatico di E-R alpha è stato trovato nelle sezioni del colon ottenute da topi di controllo e da topi con malattia di Crohn indotta da TNBS. Tuttavia, solo i due punti ottenuti dai topi di controllo avevano E-R alfa localizzato nel citoplasma delle cellule del calice. La microscopia confocale ha anche rivelato la localizzazione citoplasmatica della beta E-R nelle sezioni del colon sia del controllo che dei topi trattati con TNBS.
Allo stesso modo, la localizzazione citoplasmatica del G-P-E-R è stata documentata nelle sezioni del colon ottenute dai topi di controllo e dai topi trattati con TNBS. Il corretto posizionamento dei due punti nello stampo è essenziale per generare la sezione trasversale corretta. Il fluorocromo deve essere selezionato in base al proprio spettro di eccitazione ed emissione.
Questo metodo può anche essere applicato ad altre proteine che possono essere coinvolte nello sviluppo della colite. Il rilevamento dell'immunoistochimica mediante immunofluorescenza può essere esteso per macchiare altre proteine nello stato di direzione proteina-proteina.
