Questo protocollo per la localizzazione in vivo dell'immunofluorescenza, o IVIL, valuta la biodistribuzione in vivo di anticorpi diagnostici e terapeutici o agenti basati su anticorpi per la ricerca, il rilevamento e il trattamento del cancro. A differenza della colorazione immunofluorescente convenzionale in cui l'espressione cellulare degli antigeni si rivela ex vivo, il metodo IVIL chiarisce come gli anticorpi e gli agenti a base di anticorpi si distribuiscono nell'animale vivente. Questo video aivierà la comprensione del flusso di lavoro complessivo del metodo IVIL.
Mostra dettagli importanti per una riproduzione riuscita del protocollo per altre applicazioni e anticorpi. Osservare i topi dal modello di cancro desiderato per la crescita tumorale appropriata tramite palpazione o misurazione della pinza prima di procedere. Purificare gli anticorpi di controllo dell'isotipo IgG del coniglio B7-H3 e del coniglio su una colonna di dissalezione per rimuovere conservanti e tamponi di conservazione seguendo le istruzioni del produttore.
Dosaggi aliquoti di 33 microgrammi di ciascun anticorpo coniugati in singoli tubi di microcentrifugo. Dopo l'anestesia come descritto nel protocollo di testo, prepararsi per l'inoculazione della vena della coda delle soluzioni anticorpali. Disinfettare la coda dell'animale pulendo tre volte con una salvietta alcolica.
Dilatare le vene della coda riscaldando con un riscaldatore per circa 30 secondi. Evitare di riscaldare l'intero animale. Utilizzando un catetere della vena di coda calibro 27, inserire l'ago farfalla in una delle due vene posteriori della coda.
Visualizza il riflusso di sangue nel catetere per assicurarti che l'ago sia posizionato correttamente in modo che le soluzioni entrino completamente nell'animale rispetto a essere catturate nella coda. Utilizzare un pezzo di nastro chirurgico per fissare attentamente la coda con l'ago inserito sul palco. Lavare il catetere con 25 microlitri di soluzione salina sterile tamponata da fosfati.
Quindi, iniettare la soluzione anticorpale nel catetere usando siringhe di insulina. Lavare nuovamente il catetere con 25 microlitri di PBS sterile. Rimuovere l'ago dalla coda e applicare pressione per fermare qualsiasi sanguinamento.
Eseguire l'eutanasia umana del mouse come descritto nel protocollo di testo e posare il mouse in posizione supina. Usa forbici chirurgiche e forcelle per asportare i tessuti tumorali. Usa le fasci per afferrare solo lo strato esterno della pelle tra l'insieme delle ghiandole mammarie più vicine alla coda e fare una piccola incisione con un paio di forbici chirurgiche.
Introdurre le forbici chiuse nel taglio e aprire lentamente la punta per separare accuratamente la pelle dalla membrana della parete addominale sottostante, mantenendola intatta. Fai un'incisione verticale sull'addome, continuando a separare la pelle dalla membrana interna. Tra la terza e la quarta ghiandola mammaria, fai un taglio orizzontale sull'addome per consentire la retrazione della pelle e la visualizzazione delle ghiandole mammarie.
Afferrando ogni tumore o ghiandola normale con le forcep, tagliare con cura la pelle attaccata usando forbici chirurgiche. Posizionare i tessuti asportati negli stampi di base monouso dei tessuti che vengono preetichettati e riempiti con un mezzo di incorporamento ottimale della temperatura di taglio. Congelare rapidamente gli stampi posizionamento sul ghiaccio secco.
Al fine di studiare la consegna fuori bersaglio, asportare altri tessuti o organi di interesse. Utilizzando un criostato, se sezione blocchi di tessuto congelato con spessore di 10 micron e posizionare sezioni adiacenti su vetri di adesione preetichettati. Risciacquare i vetrini di tessuto congelato con PBS a temperatura ambiente per cinque minuti per rimuovere il mezzo di incorporamento.
Demarcare le sezioni tissutali con una penna barriera idrofobica per ridurre il volume di soluzioni necessarie durante la colorazione. Fissare le sezioni tissutali con soluzione di paraformaldeide al 4% per cinque minuti. Dopo aver risciacquato le diapositive in PBS per cinque minuti, permeabilizzare le sezioni di tessuto con 0,5%Triton X-100 in PBS per 15 minuti.
Risciacquare nuovamente le diapositive in PBS per cinque minuti. Bloccare i tessuti con PBS contenente il 3% di peso per volume di albumina di siero bovino e il 5% di volume per volume di siero di capra per un'ora a temperatura ambiente. Dopo aver risciacquato le diapositive in PBS per cinque minuti, incubare le sezioni con anticorpi primari da record come un marcatore nucleare, vascolare o citoplasmatico comune.
Qui, il CD31 anti-mouse del ratto viene utilizzato con una diluizione uno-a-100 nella soluzione di blocco. Le diapositive con anticorpo primario vengono lasciate durante la notte a quattro gradi Celsius, protette dalla disidratazione su un vassoio scorrevole. Dopo l'incubazione, sciacquare le diapositive in PBS per cinque minuti tre volte.
Cambiare il PBS ogni volta. Incubare le diapositive con anticorpi secondari per etichettare gli anticorpi primari. Per questa applicazione, visualizzare l'anticorpo anti-B7-H3 utilizzando l'anticorpo anti-coniglio di capra coniugato Alexa Fluor 546 e visualizzare CD31 con l'anticorpo secondario anti-ratto di capra Alexa Fluor 488 in soluzione di blocco.
Proteggere i vetrini dalla luce e dalla disidratazione su un vassoio scorrevole per un'ora a temperatura ambiente. Dopo aver risciacquato le diapositive in PBS come prima, applicare una goccia del mezzo di montaggio al centro della fetta di tessuto. Posizionare con cura un coverslip, evitando l'intrappolamento delle bolle d'aria.
Sigillare i bordi del coverslip con smalto chiaro e lasciare asciugare. Procedere con l'imaging confocale della microscopia e l'analisi quantitativa delle immagini come descritto nel protocollo di testo. Le micrografie confocali rappresentative mostrano il confronto di specifici anticorpi B7-H3-ICG coniugati e anticorpi di controllo dell'isotipo non specifici-localizzazione coniugata ICG in ghiandole mammarie murine contenenti tessuti normali o carcinomi.
Le ghiandole mammarie murine normali di un animale iniettato per via endovenosa con Iso-ICG o B7-H3-ICG e contrososteniate con CD31 non mostrano alcuna colorazione dei coniugati anticorpali. È stato dimostrato che i tessuti normali non hanno espressione di B7-H3 mediante colorazione standard ad immunofluorescenza ex vivo. Nei tumori mammari invasivi, il B7-H3-ICG si lega fortemente alla vascucolatura, il primo punto di contatto in vivo, e quindi è in grado di estrapolare dalla vascucolatura alla macchia eterogenea dell'epitelio tumorale.
Iso-ICG mostra un accumulo non specifico all'interno dei tessuti tumorali. La colorazione immunofluorescente ex vivo standard mostra un'espressione uniforme del marcatore B7-H3 sulle cellule epiteliali ed endoteliali. Le micrografie confocali rappresentative mostrano il metodo di localizzazione dell'immunofluorescenza in vivo per rilevare l'espressione netrin-1 o l'espressione di controllo dell'isotipo nel carcinoma murino e nelle ghiandole mammarie normali.
La localizzazione dell'immunofluorescenza in vivo conferma il segnale epiteliale per netrin-1 nei tumori MMTV-PyMT ma non nelle normali ghiandole mammarie. Inoltre, c'è un forte segnale netrin-1 sulle cellule endoteliali nei tumori al seno, come indicato dal segnale giallo colocalizzato. Il segnale è significativamente più debole nelle ghiandole mammarie normali.
Il metodo IVIL dovrà essere ottimizzato in termini di dosaggio degli anticorpi, tempi di raccolta dei tessuti e diluizione secondaria degli anticorpi per un'implementazione di successo. IVIL consente di mirare epitopi conformazionali che non possono essere rilevati utilizzando la colorazione immunofluorescenza standard, che richiede la lavorazione dei tessuti. Inoltre, gli organi sani dei topi portanti di tumore possono essere raccolti per valutare l'erogazione off-target di anticorpi terapeutici.
Con l'aumento dell'uso di terapie a base di anticorpi e agenti di contrasto nella ricerca e nella gestione del cancro, il metodo IVIL è altamente applicabile alla ricerca e allo sviluppo farmaceutico. I ricercatori in terapie oncologiche, imaging molecolare, infiammazione e altre aree possono scoprire che il metodo IVIL fornisce informazioni utili.
