Questo protocollo può essere utilizzato per applicare un analizzatore di flusso extracellulare per monitorare i cambiamenti nel metabolismo energetico durante la capacità dello sperma. Abbiamo sviluppato questo protocollo per confrontare i cambiamenti nella glicolisi e nella fosforilazione ossidativa in tempo reale tra sperma di topo non condensato e capacitato. Il giorno prima del test, rimuovere la cartuccia del sensore da un kit di dosaggio del flusso extracellulare e posizionare la cartuccia capovolta accanto alla piastra di utilità.
Riempire un serbatoio di soluzione con 25 millilitri di acqua distillata doppia e aggiungere 200 microlitri di acqua a ogni pozzo della piastra di utilità, quindi riposizionare la cartuccia del sensore nella piastra di utilità. Posizionare la piastra in un incubatore di anidride carbonica non di 37 gradi Celsius. Successivamente, aliquota 25 millilitri di calibratore di analizzatore di flusso extracellulare in un tubo conico da 50 millilitri e posizionare il tubo nell'incubatore di anidride carbonica non di 37 gradi Celsius.
Per preparare micro piastre rivestite con ConA, sciogliere 2,5 milligrammi di ConA in cinque millilitri di acqua distillata doppia e utilizzare una pipetta multicanale per riempire ogni pozzo di un analizzatore di flusso extracellulare piastra da 96 po 'con 50 microlitri della soluzione ConA, quindi lasciare aperto il coperchio per lasciare asciugare la piastra durante la notte. Per preparare il tampone dello sperma, riscaldare 250 millilitri dell'analizzatore di flusso extracellulare TYH tampone a 37 gradi Celsius e regolare il pH a 7,4. Il giorno del saggio, sostituire l'acqua in ogni pozzo della piastra di utilità con 200 microlitri di calibrant XF per pozzo e riposizionare la piastra nell'incubatore di anidride carbonica per almeno un'ora.
Per generare un modello di onda, attivare l'analizzatore di flusso extracellulare. Mentre la temperatura si sta stabilizzando a 37 gradi Celsius, apri il software d'onda e apri un modello vuoto. Nella scheda definizioni di gruppo, definire il mezzo di dosaggio come TYH e il tipo di cella come sperma del mouse, lasciando vuote le strategie di iniezione e i pretrattamenti.
Creare gruppi diversi per ogni condizione di dosaggio e aprire la mappa delle lastre per assegnare ogni gruppo a pozzi specifici. Nella scheda protocollo, equilibrare non evidenziato, aggiungere ciascuno dei quattro diversi cicli di misurazione, selezionare la rispettiva porta e modificare i dettagli di misurazione in modo che la misura dopo l'iniezione sia evidenziata, quindi salvare il modello di saggio, compilare il riepilogo del progetto e salvare i risultati. Prima di raccogliere lo sperma, prewarm 50 millilitri di tampone TYH a 37 gradi Celsius.
Dopo aver raccolto caudas da topi maschi adulti, posizionare ogni cauda in 500 microlitri del tampone TYH pre-riscaldato in singoli pozzi di una piastra da 24 porri. Usa le forcelle per immobilizzare ogni cauda individualmente nella parte inferiore di ogni pozzo e fare rapidamente da cinque a sette piccole incisioni in ogni tessuto usando forbici di piume. Quando tutte le caudas sono state incise, posizionare immediatamente la piastra nell'incubatrice di anidride carbonica per consentire allo sperma di disperdersi per 15 minuti.
Per caricare la cartuccia del sensore, rimuovere il coperchio dalla cartuccia del sensore e allineare la lettera della rispettiva guida di caricamento della porta con l'angolo superiore sinistro della cartuccia. Tenendo in posizione la guida di caricamento della porta, inserire le punte delle pipette verticalmente nei fori guida di caricamento della porta A e iniettare 20 microlitri di buffer TYH in ogni colonna. Per la porta B, iniettare 22 microlitri di tampone TYH nelle colonne da uno a quattro, 22 microlitri da 500 millimolare 2-deossiglucosio nelle colonne da cinque a otto e 25 microlitri di cinque micromolare antimicina A rotenone in colonne da nove a 12.
Per la porta C, iniettare 25 microlitri di buffer TYH in ogni colonna con numeri dispari e 25 microlitri di 10 millimolare di dibutiril-ciclico AMP 500 micromolare IBMX in ogni colonna con numeri pari, quindi posizionare la cartuccia del sensore con una piastra di calibrazione nell'analizzatore di flusso extracellulare e avviare il test. La calibrazione richiederà dai 10 ai 15 minuti. Per preparare le piastre spermatiche, aggiungere tre millilitri di tre milligrammi per albumina di siero bovino millilitro nel tampone TYH a ciascuno dei tre cinque tubi di centrifuga millilitro.
Successivamente, mettere in comune due pozzetti di sperma in ciascuno dei tre tubi di centrifuga da 1,5 millilitri. Dopo il conteggio, diluire lo sperma a due volte 10 al sette spermatozoi per millilitro concentrazione per campione in TYH fresco integrato con albumina di siero bovino. Sedimentare lo sperma per centrifugazione e rimosogliere il pellet di sperma in un millilitro di tampone TYH.
Centrifugare di nuovo lo sperma e rimuovere i supernatanti facendo attenzione a non disturbare i pellet. Trasferire ogni sospensione dello sperma in uno dei cinque tubi di centrifuga a cinque millilitri preparati e aggiungere 180 microlitri di tampone TYH in ogni pozzo d'angolo di una piastra rivestita con ConA. Aggiungere 180 microlitri di spermatozoi in ogni pozzo vuoto della piastra rivestita con ConA e centrifugare la piastra due volte ruotando la piastra di 180 gradi tra le centrifugazioni, quindi posizionare la piastra di calibrazione con la piastra spermatica e continuare il test.
In questo esperimento rappresentativo, lo sperma è stato condensato in presenza di glucosio come unico substrato energetico e 2-deossiglucosio e antimicina e rotenone come modulatori farmacologici. La freccia indica l'induzione della capacità. In presenza di glucosio, la capacità è stata accompagnata da un aumento di sette volte del tasso di acidificazione extracellulare che è inibito bloccando la glicolisi con 2-deossiglucosio.
Lo sperma condensato ha dimostrato un aumento di 20 volte del tasso di consumo di ossigeno rispetto allo sperma non condensato dimostrando che lo sperma del topo migliora sia la glicolisi che la fosforilazione ossidativa per sostenere la crescente domanda di energia durante la capacità. L'aumento del tasso di acidificazione extracellulare durante la capacità dello sperma non è influenzato dagli inibitori ossidativi della fosforilazione antimicina A e rotenone che indicano che la variazione di questo tasso è principalmente determinata dal rilascio di idrogeno dalla glicolisi. L'aumento del tasso di consumo di ossigeno, tuttavia, è bloccato dall'antimicina A e dal rotenone, nonché dal 2-deossiglucosio che rivela che l'aumento di OXPHOS durante la capacità dello sperma dipende dall'attività glicolitica.
La fonte di energia e gli attivatori e gli inibitori farmacologici possono essere variati a seconda dell'obiettivo dell'esperimento e possono essere misurate fino a 12 condizioni diverse in parallelo. Il protocollo può essere facilmente adattato ad altre specie come l'uomo o il bovino in cui i cambiamenti nel metabolismo energetico durante la capacità sono ugualmente enigmatici.
