L'assorbimento del glucosio è la chiave per comprendere la salute e la malattia. Poiché il glucosio svolge un ruolo fondamentale nelle richieste metaboliche e strutturali nel corpo umano, oltre a svolgere un ruolo vitale nella regolazione. La misurazione extracellulare del glucosio consente lo sviluppo di saggi ad alto rendimento per la cinetica dell'assorbimento del glucosio in cellule, tessuti e organi di diverso background genetico in risposta a nutrienti o farmaci.
Questo test sarebbe uno strumento prezioso per la scoperta di terapie e nutrizione per il diabete, il cancro, le malattie degenerative del sistema nervoso centrale, l'obesità e tutte le malattie del glucosio e del metabolismo. Il test richiede un aggiustamento del tempo per la fame e la stimolazione che dovrebbe essere basato sulle specifiche metaboliche per diversi tessuti e colture cellulari. Coltura 3T3-L1 fibroblasti di topo placcando 10 alle 6 cellule, diluito in 20 millilitri di mezzo 1 in 296 piastre di pozzetto.
Piastra 100 microlitri di sospensione cellulare per pozzetto, assicurando di mantenere l'omogeneità di questa sospensione mediante miscelazione. Coltiva le cellule per 48 ore in un'incubatrice a 37 gradi Celsius senza cambiare terreno fino a circa il 70-80% di confluenza. Mantenere le cellule confluenti e digiunate coltivandole nello stesso mezzo per 48 ore.
Variare il tempo di incubazione da 24 a 72 ore, a seconda dello stato catabolico a digiuno desiderato. Decantare i mezzi dalle celle nelle lastre a 96 pozzetti. Assorbire il fluido rimanente utilizzando asciugamani di carta sterili.
Risciacquare la piastra a 96 pozzetti con 100 microlitri di PBS per pozzetto e assorbire il liquido rimanente con carta assorbente sterile. Aggiungere 100 microlitri di DMEM senza glucosio per pozzetto e incubare per 40 minuti. Regolare il tempo di incubazione in base agli stimoli del tipo di cellula e al livello desiderato di digiuno.
Utilizzare otto repliche per ogni condizione di simulazione. Pertanto, preparare un millilitro per ogni condizione di simulazione. Utilizzare sette condizioni di simulazione senza insulina.
Glucosio FD di 2,5 microgrammi per millilitro, 1 microgrammo per millilitro, 0,5 microgrammi per millilitro, 0,2 microgrammi per millilitro, 0,1 microgrammi per millilitro, 0,05 microgrammi per millilitro e 0 milligrammi per millilitro in 196 pozzetti. Utilizzare sette condizioni di stimolazione con insulina. Glucosio FD di 2,5 microgrammi per millilitro, 1 microgrammo per millilitro, 0,5 microgrammi per millilitro, 0,2 microgrammi per millilitro, 0,1 microgrammi per millilitro, 0,05 microgrammi per millilitro e 0 microgrammi per millilitro in un'altra piastra da 96 pozzetti.
Per preparare le condizioni di stimolazione, diluire un microlitro di cinque milligrammi per millilitro di soluzione di lavoro di glucosio FD e 999 microlitri di DMEM privo di glucosio per ottenere un millilitro di soluzione madre di lavoro. Utilizzando questa soluzione di materiale di lavoro, preparare da 1 a 2000, da 1 a 5.000, da 1 a 10.000, da 1 a 25.000, da 1 a 50.000 e da 1 a 100.000 deliri di glucosio FD per ottenere 2,5 microgrammi per millilitro, 1 microgrammo per millilitro, 0,5 microgrammi per millilitro, 0,2 microgrammi per millilitro, 0,1 microgrammi per millilitro, 0,05 microgrammi per millilitro in tubi da due millilitri immediatamente prima degli esperimenti in un armadio di biosicurezza senza luci. Aggiungere un microlitro di insulina a ciascuna di queste condizioni.
Dopo 40 minuti di incubazione, decantare il DMEM privo di glucosio da ciascun pozzetto in 96 piastre di pozzetto e assorbire il fluido rimanente con asciugamani di carta sterili. Aggiungere 100 microlitri ciascuno dalle varie condizioni di trattamento descritte in precedenza, ai pozzetti lungo una colonna. E 100 microlitri dalla stessa condizione di trattamento ai pozzetti lungo la fila in entrambe le 96 piastre a parete.
Etichettare le piastre che hanno utilizzato le condizioni, con e senza insulina. Aggiungi DMEM privo di glucosio da solo ai pozzetti di controllo. Incubare la piastra per 40 minuti nell'incubatore di coltura cellulare al buio.
Dopo che le cellule sono state stimolate per 40 minuti. Trasferire i mezzi di stimolazione da entrambe le piastre in nuove piastre da 96 pozzetti, mantenendo lo stesso layout sperimentale. Lavare le celle con PBS.
Rimuovere PBS e decantare qualsiasi soluzione residua su carta assorbente sterile. Aggiungere un inibitore della proteasi al tampone di dosaggio di radioimmunoprecipitazione per proteggere le proteine. Posizionare le piastre contenenti il saggio di radioimmunoprecipitazione in uno shaker per 30 minuti.
Utilizzando un lettore di micropiastre, misurare la fluorescenza a lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione rispettivamente a 485 e 535 nanometri. Prima nel mezzo contenente glucosio FD extracellulare e poi nella piastra con cellule lizzate con saggio di radioimmunoprecipitazione alla fine di 30 minuti di incubazione. Eseguire il test della proteina BCA secondo le istruzioni del produttore.
Quantificare le concentrazioni proteiche in ciascun pozzetto contenente cellule analizzate con radioimmunoprecipitazione. Utilizzare 10 microlitri di omogenato di test di radioimmunoprecipitazione, misurare le concentrazioni proteiche e triplicare per aumentare l'accuratezza delle misurazioni in 96 piastre di pozzetto. Quantificare le proteine in base agli standard proteici analizzati insieme ai campioni su ogni piastra a 96 pozzetti.
Incubare i tessuti o gli organi raccolti in una piastra a sei pozzetti contenente PBS per un minuto. Maneggiare ogni tessuto o organo in un pozzetto separato. Dopo un minuto, posizionare ogni fazzoletto su un tovagliolo di carta sterile per assorbire PBS.
Trasferire tessuti o organi in una piastra separata a sei pareti contenente 4.000 microlitri di DMEM privo di glucosio e incubare per due minuti. Dopo due minuti, rimuovere e trasferire i tessuti in pozzetti di una piastra a sei pozzetti contenente 0,29 millimolari di soluzione di lavoro di glucosio FD. Incubare le sei piastre del pozzetto contenenti tessuti in soluzione di lavoro di glucosio FD a 37 gradi Celsius.
Raccogliere 100 microlitri di soluzione di lavoro di glucosio FD da ciascun pozzetto dopo 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 e 120 minuti di incubazione e trasferire 100 microlitri raccolti di soluzione di lavoro di glucosio FD in 96 piastre di pozzetto per analizzare la cinetica della deplezione extracellulare del glucosio FD. Agitare prima e dopo la raccolta. Misurare la fluorescenza all'eccitazione nelle lunghezze d'onda di emissione rispettivamente a 485 e 535 nanometri utilizzando un lettore di micropiastre.
La dipendenza dalla dose nell'assorbimento intracellulare del glucosio FD è risultata significativamente aumentata in presenza di insulina. La stimolazione insulinica ha portato a una significativa diminuzione dei livelli di glucosio FD extracellulare rispetto ai campioni senza stimolazione insulinica. L'esaurimento extracellulare del glucosio FD può misurare un cambiamento nell'assorbimento del glucosio con un'accuratezza comparabile all'assorbimento intracellulare del glucosio FD.
Il glucosio FD extracellulare non è stato impoverito nel grasso viscerale di controllo non stimolato durante 120 minuti di incubazione. Al contrario, il pretrattamento dei topi con insulina o AAC2 prima della dissezione, ha portato a un significativo esaurimento del glucosio FD extracellulare entro un intervallo di tempo rispettivamente di 30 minuti e 60 minuti. Il glucosio FD extracellulare non è stato esaurito negli espianti di fegato stimolati dall'insulina, rispetto agli espianti di fegato non stimolati.
Il glucosio FD extracellulare è diminuito significativamente in modo dipendente dal tempo e gli espianti di fegato pretrattati con AAC 2,22% di deplezione di glucosio sono stati osservati nel mezzo extracellulare contenente il cervello non trattato dopo 60 minuti di incubazione. Il terreno incubato con cervelli di topi trattati con insulina ha mostrato una diminuzione lineare del 5% del glucosio FD. I cervelli stimolati da AAC2 hanno portato a una profonda e rapida diminuzione al 67,4% del glucosio FD extracellulare durante i primi 20 minuti.
Le sostanze che comportano il lavaggio sono particolarmente importanti per rimuovere tracce di glucosio, sangue o siero all'interno del mezzo e/o degli organi, in quanto possono interferire con la lettura della fluorescenza di questi mezzi. Dopo l'identificazione ad alto rendimento di composti di metaboliti in geni con proprietà glicemiche, nonché le condizioni ottimali per la loro azione in esperimenti in vivo, potrebbero essere convalidati con glucosio FD marcato e scansione PET per confermare l'accumulo di glucosio in organi specifici. Questa tecnica per la scoperta dell'azione glicemica è utile nella delezione di numerosi metaboliti, terapie o loro combinazioni, ed evidenzia le loro azioni in diversi organi.
