Questo metodo consentirà ai ricercatori di quantificare la dinamica precoce dell'adesione cellulare e la diffusione di cellule dipendenti dall'ancoraggio sulla fibronectina proteica della matrice extracellulare durante lo stress ossidativo. Questa tecnica è versatile e può essere adattata per esaminare la dinamica citoscheletricha in un'ampia gamma di condizioni. Inoltre, l'acquisizione e l'analisi dei dati vengono eseguite utilizzando attrezzature di laboratorio comuni e software liberamente disponibili.
Comprendere i meccanismi per il modo in cui le cellule si attaccano e si diffondono sull'ECM durante le alterazioni dello stato redox può fornire preziose informazioni sugli stati normali e delle malattie, come il cancro metastatico. Questo metodo può essere utilizzato per esaminare la diffusione e l'adesione cellulare in diverse condizioni di coltura cellulare, linee cellulari dipendenti dall'ancoraggio e / ossidanti per rispondere a un'ampia gamma di domande biologiche. Ci sono numerosi reagenti necessari per eseguire questa tecnica.
Pertanto, è essenziale che tutte le soluzioni siano fatte in anticipo prima dell'inizio. In una cappa di flusso laminare certificata BSL-II è stata impostata una piastra da 24 potarsi certificata in coltura tissutale. Posizionare una coverlip di vetro in ogni pozzo.
Etichettare la lastra in base alla figura 1B del protocollo di testo. Successivamente, pipettare 500 microlitri della soluzione di fibronectina in ogni pozzo. Pipettare la soluzione su ogni coverslip alcune volte per garantire un rivestimento uniforme e un'immersione completa.
Coprire la piastra con il coperchio. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius con anidride carbonica del 5% per un'ora. Quindi rimuovere la piastra dall'incubatore e aspirare la soluzione di fibronectina dai pozzi.
Lavare i pozzi tre volte utilizzando 500 microlitri di 1X PBS per lavaggio. Aspirare il lavaggio finale di 1X PBS e bloccare i pozzi con 500 microlitri di una soluzione BSA delipidata allo 0,5% a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per un minimo di 15 minuti. In primo luogo, pre-riscaldare le soluzioni necessarie in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius.
In una cappa di flusso laminare certificata BSL-II, iniziare con un monostrato confluente di cellule REF52 in un piatto di 10 centimetri quadrati e lavare le celle due volte con sei millilitri di PBS 1X caldo. Il siero muore di fame le cellule per almeno un'ora in sei millilitri di soluzione di BSA calda delipidata. Quindi, lavare le cellule con sei millilitri di 1X PBS riscaldato.
Aspirare il PBS e aggiungere 1,5 millilitri di soluzione calda 0,5% di tripside-EDTA. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con anidride carbonica del 5% per circa due minuti. Osservare le cellule al microscopio luminoso per assicurarsi che il distacco sia completo.
Se le cellule sono ancora aderenti dopo aver toccato la piastra sul piano del banco, restituirle all'incubatrice per altri due minuti. Pipetta 1,5 millilitri di soluzione neutralizzante di tripsidenza calda, TNS, al piatto per fermare la tripsiinizzazione e raccogliere le cellule staccate. Pipettare la soluzione su e giù sul fondo della piastra numerose volte per rimuovere tutte le restanti cellule aderenti.
Se le cellule appaiono goffi, triturare ulteriormente la sospensione cellulare tubazionando delicatamente su e giù sul retro del piatto. Quindi, contare le celle utilizzando l'esclusione blu trypan in un contatore di celle automatizzato. Rimuovere una quantità appropriata di celle per creare una sospensione cellulare con la densità cellulare compresa tra 10.000 e 30.000 celle per millilitro in BSA delipidato in un tubo conico da 15 millilitri.
Utilizzare un rotore ad angolo fisso in una centrifuga da tavolo per centrifugare le cellule a 300 volte g per cinque minuti. Aspirare il supernatante e sospendere di nuovo il pellet cellulare in sette millilitri di soluzione BSA delipidata calda. Quindi dividere uniformemente la sospensione cellulare in due tubi conici da 15 millilitri, uno per il controllo da solo del veicolo e uno per Ku55933.
Utilizzando un rotatore a tubo, ruotare i tubi per 90-120 minuti in un incubatore di coltura cellulare a 37 gradi Celsius. 30 minuti prima della placcatura, aggiungere Ku55933 e DMSO ad ogni tubo a una concentrazione finale di 10 micromolari. Restituire la sospensione cellulare al rotatore per il tempo rimanente.
Immediatamente prima di placcare le cellule, recuperare la piastra dall'incubatore e aspirare la soluzione BSA delipidata. Successivamente, rimuovere 500 microlitri della sospensione cellulare da ogni gruppo di trattamento e aggiungerli a uno dei coperchi rivestiti di fibronectina nella piastra a 24 porri. Continuare a incubare la piastra e la sospensione cellulare alle condizioni precedenti.
Quindi consentire alle celle di aderire al coverslip per il periodo di tempo desiderato. Dopo che il tempo desiderato per l'adesione è passato, aspirare la soluzione cellulare da ogni coverlip nella piastra. Erogare delicatamente 500 microlitri di soluzione di paraformaldeide al 3,7% su ogni coverlip pipettando lungo i lati dei pozzi e attendere da 10 a 15 minuti.
Successivamente, rimuovere la soluzione di paraformaldeide e lavare ogni coverlip due volte con 1X PBS utilizzando 500 microlitri di PBS per lavaggio. Aspirare il PBS e le celle permeabili su ogni coverlip con 500 microlitri dello 0,2%Triton X-100 e 1X PBS per 10-15 minuti a temperatura ambiente. Quindi lavare ogni coverlip tre volte con 1X PBS utilizzando 500 microlitri di PBS per lavaggio.
Bloccare le cellule su ogni coverlip con 500 microlitri di buffer di blocco dell'immunofluorescenza per 30-60 minuti. Diluire l'anticorpo anti-paxillina primario nel tampone di blocco con un rapporto tra uno e 250. Mescolare bene e aggiungere 200 microlitri della soluzione anticorpale ad ogni coverlip.
Incubare a temperatura ambiente per almeno un'ora. Successivamente, aspirare la soluzione anticorpale e lavare ogni coverlip con 500 microlitri di 1X PBS per 10 minuti. Proteggere i campioni dalla luce da questo punto in avanti.
Diluire la sonda F-actina della falloidina coniugata al colorante rosso fluorescente Alexa 594 e all'anticorpo secondario fluorescente 488 della capra anti-topo nella stessa soluzione tampone di blocco. Mescolare bene e aggiungere 200 microlitri della soluzione anticorpale ad ogni coverlip per 30 minuti. Aspirare la soluzione anticorpale e lavare ogni coverlip con 500 microlitri di 1X PBS per 10 minuti.
Aspirare il PBS e sciacquare il coperchio scivola una volta con 500 microlitri di acqua deionizzata. Quindi fissare il coperchio scivola su vetrini al microscopio utilizzando un supporto di montaggio anti dissolvenza contenente DAPI. Dopo la fissazione e la colorazione con un anticorpo anti-paxillina, vengono acquisite immagini fluorescenti in scala di grigi a 8 bit delle cellule REF52.
Al termine di tutte le fasi di elaborazione delle immagini, le singole aderenze focali dovrebbero essere prominenti, a fuoco e facilmente distinguibili l'una dall'altra. Le immagini a fluorescenza in scala di grigi delle cellule macchiate della sonda F-actina anti-paxillina e falloidina vengono quindi prese dopo essere state placcate sulla fibronectina. Le aderenze focali prominenti e le fibre di stress dovrebbero essere facilmente visibili nelle cellule REF52 dopo essere state autorizzate ad aderire alla fibronectina per 20-30 minuti.
Le volant arricchite con F-actin sul bordo anteriore delle membrane cellulari sono indicate con una freccia. Immagini fluorescenti simili della sonda F-actina della falloidina e della colorazione anti-paxillina vengono analizzate per la percentuale di fibre di stress nella diffusione cellulare. In particolare, il trattamento ossidante provoca un aumento significativo della formazione di fibre da stress in tutti i punti di tempo di adesione esaminati e una diminuzione della diffusione cellulare dopo 15 minuti di adesione cellulare alla fibronectina.
La placcatura a densità cellulari più elevate porta all'affollamento cellulare che proibisce alle cellule di diffondersi completamente a causa della sovraconfluenza. Si noti che i bordi delle celle sono indistinguibili dalle celle adiacenti. Di conseguenza, la quantificazione delle singole cellule è esclusa e la circonferenza di diffusione non può essere determinata con precisione.
Una linea cellulare separata di fibroblasti embrionali di topo viene tenuta in sospensione e quindi placcata sulla fibronectina per 30 minuti. Le cellule sono state quindi fissate e macchiate con un anticorpo anti-paxillina. Si notano le celle fuori fuoco.
Inoltre, la reattività incrociata dell'anticorpo anti-paxillina con detriti cellulari altererà la soglia durante l'analisi quantitativa dell'immagine e non dovrebbe essere inclusa nell'analisi. Durante l'elaborazione delle immagini, usa lo strumento di ricerca nelle Fiji per esaminare l'istogramma dell'immagine regolando la luminosità / contrasto per evitare insidie legate alla saturazione del segnale. I cambiamenti nell'adesione e nella diffusione possono influenzare la migrazione cellulare.
I metodi per tenere traccia della migrazione a singola cellula, della guarigione delle ferite o dei test di invasione della chemiotassi possono determinare se si verificano alterazioni nella migrazione. Le GTPasi della famiglia Rho regolano le dinamiche di adesione cellulare attraverso la loro specifica attivazione temporale spaziale. I cambiamenti fenotipici nell'adesione e nella diffusione durante lo stress ossidativo possono essere indicativi dei ruoli regolatori a valle per queste proteine.
Questo metodo richiede l'uso di linee cellulari BSL-II e reagenti chimici pericolosi. I ricercatori richiedono una formazione sulla sicurezza chimica e biologica, come stabilito dall'ufficio per la salute e la sicurezza ambientale del loro istituto.
