Questo lavoro è stato in parte supportato da Kansas INBRE, P20GM103418 a Li e Zinovyeva e R35GM124828 a Zinovyeva. Ringraziamo Min Han per aver generosamente condiviso l'anticorpo anti-AIN-1. Alcuni dei ceppi utilizzati nel corso di questo lavoro sono stati forniti dal Caenorhabditis Genetics Center (CGC), finanziato dall'Ufficio dei programmi di infrastruttura di ricerca del NIH (P40 OD010440).

1. Raccolta di campioni di worm
<ol><li>Seme a stadio misto osincronizzato 13 vermi su piastre solide NGM alla temperatura richiesta e consentire ai vermi di crescere fino allo stadio desiderato. Per la crescita e la manutenzione di base di C. elegans, si prega divedere Stiernagle et al.</li>
	<li>Raccogliere i vermi in un tubo di centrifuga conica da 15 ml lavando le piastre del verme con tampone M9.</li>
	<li>Pelletare i vermi centrifugando a 400 x g a temperatura ambiente (RT) per 2 minuti e scartare il supernatante. NOTA: La dimensione del pellet di verme per la preparazione dell'estratto è compresa tra 100 μL e 500 μL. Un pellet da 300 μL di vermi imballati è raccomandato per esperimenti di immunoprecipitazione a valle e in genere produce ~ 4,5 mg di proteine totali, mentre un pellet da 500 μL produrrà ~ 7,5 mg di proteine totali.</li>
	<li>Eseguire ulteriori lavaggi da 3 a 5 con buffer M9 (vedere tabella 1) o fino a quando il supernatante non è più torbido.</li>
	<li>Eseguire un lavaggio finale con ddH2O.</li>
	<li>Spostare il pellet di verme sciolto su un tubo di microcentrifugo da 1,5 ml e girare verso il basso a 400 x g a RT per 2 min. Scartare il supernatante rimanente per ottenere un pellet di verme imballato e procedere all'estrazione della preparazione. NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui. I pellet di verme possono essere immediatamente congelati in azoto liquido e conservati a -80 °C o in azoto liquido. Si prega di notare che i pellet di vermi possono essere scongelati una sola volta e non possono essere refrozen.</li>
</ol>2. Estrarre la preparazione del pellet di verme
NOTA: La preparazione dell'estratto deve essere eseguita su ghiaccio o a 4 °C.
<ol><li>Se congelato, scongelare il pellet di verme sul ghiaccio. NOTA: Se la dimensione del pellet di verme imballato desiderata di 300 μL non è stata ottenuta durante la raccolta del campione, è possibile formare più pellet più piccoli fino a quando non è presente materiale sufficiente per un'ulteriore estrazione.</li>
	<li>Aggiungere un volume uguale di tampone di lisi ghiacciato 2x (60 mM HEPES, pH = 7,4, 100 mM cloruro di potassio, 0,1% Tritone X, 4 mM cloruro di magnesio, 10% glicerolo, 2 mM DTT con inibitore della RNasi, inibitore della proteasi e inibitori della fosfatasi; vedi tabella 1) e vortice o pipetta su e giù per mescolare. Ruotare il tubo o i tubi verso il basso per raccogliere la miscela nella parte inferiore del tubo.</li>
	<li>Spostare la miscela in un tubo privo di RNasi da 1,5 ml contenente perline metalliche (vedi Tabella dei materiali)e mettere il campione nell'omogeneizzatore del mulino perline (vedi Tabella dei materiali)a 4 °C. Assicurarsi che i tappi del tubo siano serrati e che i campioni siano bilanciati all'interno dell'omogeneizzatore.</li>
	<li>Omogeneizzare il campione alla massima velocità (impostando 12) per 4 minuti.</li>
	<li>Rimuovere il campione dalle perline e posizionarlo in un nuovo tubo di microcentrifugo da 1,5 ml. In alternativa, un magnete fornito con l'omogeneizzatore può essere utilizzato per rimuovere le perline dal campione.</li>
	<li>Spin verso il basso l'estratto a 19.000 x g per 20 min a 4 °C per chiarire l'estratto proteico.</li>
	<li>Trasferire il supernatante in un tubo fresco da 1,5 ml sul ghiaccio, evitando il riporto del precipitato bianco e torbido che si forma sopra il campione. Il supernatante è ora l'estratto chiarito. NOTA: Salvare 10 μL dell'estratto chiarificato per determinare la concentrazione totale di proteine.</li>
	<li>Utilizzare immediatamente l'estratto per i seguenti esperimenti o congelare l'estratto in azoto liquido e conservare a -80 °C. NOTA: il protocollo potrebbe essere messo in pausa qui. Gli estratti possono essere conservati a temperatura ultra bassa (congelatore a -80 °C o azoto liquido per ~ 6 mesi). Gli estratti congelati possono essere scongelati una volta e non possono essere refrozen.</li>
	<li>Determinare la concentrazione totale di proteine dell'estratto utilizzando un kit di dosaggio della concentrazione proteica compatibile con i detergenti (vedi Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore.</li>
</ol>3. Immunoprecipitazione
NOTA: Tutte le fasi di immunoprecipitazione per la preparazione dell'estratto devono essere eseguite sul ghiaccio o a 4 °C. Si raccomanda di utilizzare 2 mg di proteine totali per ogni immunoprecipitazione. Tuttavia, sono state eseguite immunoprecipitazioni di successo con 0,8-1 mg di proteine totali. Utilizzare sempre estratti proteici freschi o appena scongelati. Il seguente protocollo è delineato per eseguire l'immunoprecipitazione da 2 mg di proteine totali, o un singolo esperimento di immunoprecipitazione. La quantità di perline e anticorpi può essere aumentata o diminuita di conseguenza per più campioni o se viene utilizzata una diversa quantità di estratto proteico.
<ol><li>Posizionare o scongelare l'estratto proteico sul ghiaccio. Il campione può essere diluito a 10 mg/mL o a 5 mg/mL con tampone di lysis 1x ghiacciato (cfr. tabella 1).</li>
	<li>Rimospendare le perline magnetiche per inversione e trasferire 150 μL della sospensione del 50% delle perline in un tubo da 1,5 ml. Magnetizzare le perline sul ghiaccio contro un supporto magnetico per 1 minuto o fino a quando la soluzione non è chiara. Scartare il supernatante.</li>
	<li>Rimuovere il tubo dal supporto magnetico e lavare le perline in un tampone di lisi 1x utilizzando 2 volumi (cioè 300 μL) di liquami di perline. Ripetere il lavaggio 2 volte per un totale di tre lavaggi.</li>
	<li>Rimescolare le perline in 150 μL di tampone di lysis ghiacciato.</li>
	<li>Trasferire 75 μL del liquame di perline a 2 mg di estratto proteico e incubare a 4 °C per 1 h con delicata agitazione. Salvare la sospensione del tallone rimanente sul ghiaccio per un uso successivo. NOTA: Questo passaggio viene eseguito per ridurre il legame proteico non specifico alle perline durante la fase di immunoprecipitazione.</li>
	<li>Posizionare il tubo con campione sul supporto magnetico sul ghiaccio per 1 minuto o fino a quando le perline non sono completamente magnetizzate e il campione è chiaro. Trasferire il supernatante su un nuovo tubo da 1,5 ml; non disturbare le perline. Questo è il litorato proteico precleato. Risparmia il 10% del campione per l'analisi western delle macchie.</li>
	<li>Aggiungere 20 μg di anticorpo purificato di affinità al lisato precleare e incubare a 4 °C per 1 h con delicata agitazione. NOTA: La quantità di anticorpi utilizzati per l'immunoprecipitazione è specifica dell'anticorpo e della proteina e deve essere determinata empiricamente per garantire un'immunoprecipitazione efficace della proteina bersaglio.</li>
	<li>Aggiungere i restanti 75 μL della sospensione delle perline prelavate (fase 3.5) alla miscela anticorpo/lisato e incubare per 1 h a 4 °C con agitazione delicata.</li>
	<li>Posizionare il tubo nel supporto magnetico sul ghiaccio per 1 minuto o fino a quando le perline non sono completamente magnetizzate e il campione è chiaro. Salvare il supernatante per l'analisi western blot (facoltativo).</li>
	<li>Lavare le perline contenenti l'immunoprecipitato 3x in 450 μL di tampone di lavaggio (30 mM HEPES, pH = 7,4, 100 mM cloruro di potassio, 0,1% Tritone X, 2 mM di cloruro di magnesio, 10% di glicerolo, 1 mM DTT; cfr. tabella 1) sul ghiaccio. NOTA: Ulteriori lavaggi possono essere eseguiti se si preferisce condizioni di lavaggio più rigorose.</li>
	<li>Rimossare il pellet di perline in 20 μL di tampone di carico del gel proteico SDS/BME (vedi Tabella dei materiali)e denaturare bollendo a 95 °C per 5 minuti prima di caricarlo su un gel SDS-PAGE. In alternativa, i campioni denaturati possono essere conservati a -20 °C per diversi mesi. NOTA: Una porzione dell'immunoprecipitato di perline può essere salvata per l'isolamento dell'RNA a valle, se lo si desidera.</li>
</ol>4. Rilevamento western di macchie di campioni IP
<ol><li>Caricare gli esempi IP nel gel SDS-PAGE (vedere Tabella dei materiali). Evitare di trasferire le perline posizionando i tubi IP sul supporto magnetico per 1 minuto prima dell'aspirazione del campione.</li>
	<li>Eseguire l'assorbimentooccidentale 15,16 e la colorazione deglianticorpi 16 con le seguenti modifiche: diluire l'anticorpo ALG-117 1:500 nel 5% di latte secco non grasso (NFDM); diluire l'anticorpoHRPK-1 2 1:1,000 nel 5% NFDM; e diluire l'anticorpoAIN-1 18 1:10.000 nel 5% di NFDM. Gli anticorpi secondari (vedi Tabella dei materiali)sono stati utilizzati secondo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Rilevare le bande con chemiluminescenza basata su HRP (vedere Tabella dei materiali).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+AP-MS-+and+BioID-compatible+MAC-tag+enables+comprehensive+mapping+of+protein+interactions+and+subcellular+localizations.">An AP-MS- and BioID-compatible MAC-tag enables comprehensive mapping of protein interactions and subcellular localizations.</a> Nature Communications. 9 (1), 1188-1216 (2018).</li><li>Li, L., Veksler-Lublinsky, I., Zinovyeva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HRPK-1,+a+conserved+KH-domain+protein,+modulates+microRNA+activity+during+Caenorhabditis+elegans+development.">HRPK-1, a conserved KH-domain protein, modulates microRNA activity during Caenorhabditis elegans development.</a> PLoS Genetics. 15 (10), 1008067 (2019).</li><li>Zinovyeva, A. Y., Veksler-Lublinsky, I., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Ambros, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+ALG-1+antimorphic+mutations+uncover+functions+for+Argonaute+in+microRNA+guide+strand+selection+and+passenger+strand+disposal.">Caenorhabditis elegans ALG-1 antimorphic mutations uncover functions for Argonaute in microRNA guide strand selection and passenger strand disposal.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5271-5280 (2015).</li><li>Hammell, C. M., Lubin, I., Boag, P. R., Blackwell, T. K., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nhl-2+Modulates+microRNA+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">nhl-2 Modulates microRNA activity in Caenorhabditis elegans.</a> Cell. 136 (5), 926-938 (2009).</li><li>Zou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+decline+in+neuronal+regeneration+by+the+progressive+change+of+two+intrinsic+timers.">Developmental decline in neuronal regeneration by the progressive change of two intrinsic timers.</a> Science. 340 (6130), 372-376 (2013).</li><li>Zanin, E., Dumont, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+purification+of+protein+complexes+in+C.+elegans.">Affinity purification of protein complexes in C. elegans.</a> Methods in Cell Biology. 106, 289-322 (2011).</li><li>Bhaskaran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+Caenorhabditis+elegans+the+easy+way+using+the+Balch+homogenizer:+an+old+tool+for+a+new+application.">Breaking Caenorhabditis elegans the easy way using the Balch homogenizer: an old tool for a new application.</a> Analytical Biochemistry. 413 (2), 123-132 (2011).</li><li>Kohl, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plate-based+Large-scale+Cultivation+of+Caenorhabditis+elegans:+Sample+Preparation+for+the+Study+of+Metabolic+Alterations+in+Diabetes.">Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58117 (2018).</li><li>Larance, M., Bailly, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable-isotope+labeling+with+amino+acids+in+nematodes.">Stable-isotope labeling with amino acids in nematodes.</a> Nature Methods. 8 (10), 849-851 (2011).</li><li>Ding, L., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GW182+family+proteins+are+crucial+for+microRNA-mediated+gene+silencing.">GW182 family proteins are crucial for microRNA-mediated gene silencing.</a> Trends in Cell Biology. 17 (8), 411-416 (2007).</li><li>Ding, L., Spencer, A., Morita, K., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Developmental+Timing+Regulator+AIN-1+Interacts+with+miRISCs+and+May+Target+the+Argonaute+Protein+ALG-1+to+Cytoplasmic+P+Bodies+in+C.+elegans.">The Developmental Timing Regulator AIN-1 Interacts with miRISCs and May Target the Argonaute Protein ALG-1 to Cytoplasmic P Bodies in C. elegans.</a> Molecular Cell. 19 (4), 437-447 (2005).</li><li>Jannot, G., Vasquez-Rifo, A., Simard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Argonaute+Pull-Down+and+RISC+Analysis+Using+2&#8217;-O-Methylated+Oligonucleotides+Affinity+Matrices.">Argonaute Pull-Down and RISC Analysis Using 2&#8217;-O-Methylated Oligonucleotides Affinity Matrices.</a> Methods in Molecular Biology. 725, 233-249 (2011).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li><li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoblot+analysis.">Immunoblot analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (16), e759 (2008).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting:+sample+preparation+to+detection.">Western blotting: sample preparation to detection.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).</li><li>Zinovyeva, A. Y., Bouasker, S., Simard, M. J., Hammell, C. M., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+conserved+residues+of+the+C.+elegans+microRNA+Argonaute+ALG-1+identify+separable+functions+in+ALG-1+miRISC+loading+and+target+repression.">Mutations in conserved residues of the C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 identify separable functions in ALG-1 miRISC loading and target repression.</a> PLoS Genetics. 10 (4), 1004286 (2014).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Identification+of+C.+miRISC+Proteins,+miRNAs,+and+mRNA+Targets+by+Their+Interactions+with+GW182+Proteins+AIN-1+and+AIN-2.">Systematic Identification of C. miRISC Proteins, miRNAs, and mRNA Targets by Their Interactions with GW182 Proteins AIN-1 and AIN-2.</a> Molecular Cell. 28 (4), 598-613 (2007).</li><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+Window+into+Biology:+A+Primer+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li><li>Farboud, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Genome+Editing+with+Cas9+Ribonucleoprotein+in+Diverse+Cells+and+Organisms.">Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), e57350 (2018).</li><li>Dickinson, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Based+Methods+for+Caenorhabditis+elegans+Genome+Engineering.">CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering.</a> Genetics. 202 (3), 885-901 (2016).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

C. elegans è un ottimo modello per lo studio delle questioni fondamentali in biologia cellulare, molecolare e dello sviluppo19. Oltre al suo potere come sistema di modelli genetici, C. elegans è suscettibile di approcci biochimici, tra cui, a titolo considerato, immunoprecipitazione e co-immunoprecipitazione proteica. Un potenziale ostacolo quando si conducono esperimenti di immunoprecipitazione è la mancanza di anticorpi specifici per le proteine di interesse. Se non è disponibile alcun anticorpo, è possibile generare anticorpi policlonali o monoclonali personalizzati. Tuttavia, le recenti innovazioni nella tecnologia di editing del genoma hanno permesso ai ricercatori di introdurre rapidamente mutazioni o taggare geni endogeni C. elegans 20,21, facilitando studi che svelano le interazioni genetiche, funzionali e fisiche tra i geni e le proteine codificate. In particolare, l'etichettatura mediata da CRISPR/Cas9 dei geni C. elegans nei loci endogeni ha ridotto la dipendenza degli esperimenti di immunoprecipitazione dalla disponibilità di anticorpi, rendendo gli esperimenti di co-immunoprecipitazione molto più fattibili. I geni C. elegans possono essere taggati con una varietà di tag che vanno da tag fluorescenti come GFP o mCherry a piccoli tag come FLAG e HA. Gli anticorpi che riconoscono questi tag sono prontamente disponibili commercialmente, facilitando gli studi sulle interazioni proteina-proteina attraverso approcci di immunoprecipitazione.
Il protocollo presentato, descritto nella figura 1, può essere eseguito per un numero limitato di campioni o scalato, consentendo fino a 24 preparati campione alla volta. Mentre le caratterizzazioni iniziali delle interazioni proteina-proteina attraverso l'immunoprecipitazione sono tipicamente fatte in background di tipo selvatico in normali condizioni di crescita, gli studi di follow-up richiedono spesso di testare le interazioni proteina-proteina in una varietà di background genetici o in diverse condizioni di crescita. La capacità di preparare contemporaneamente più estrazioni consente di risparmiare tempo e, cosa importante, garantisce la coerenza della preparazione dell'estrazione tra i diversi campioni. È sempre necessario un controllo negativo, con il controllo ideale che è una mutazione nulla nella codifica genica per la proteina di interesse immunoprecipitata (vedi figura 3 e figura 4 per esempi).
Questo protocollo di estrazione consente una rapida preparazione dell'estratto proteico da campioni di C. elegans ed è paragonabile all'omogeneizzazione a base di perline di zirconio8. L'omogeneizzazione delle perline in generale può essere scalata fino a più preparati simultanei di campioni utilizzando una varietà di omogeneizzatori di mulini perline o apparecchiature simili. Tuttavia, alcuni omogeneizzatori più economici per mulini perline possono ridurre il numero di campioni che possono essere lavorati contemporaneamente. In alternativa, il protocollo di estrazione presentato è compatibile con la preparazione dell'estratto a base di dounce, che rappresenta un'alternativa economica. Mentre diversi omogeneizzatori di mulini di perline non sono stati testati, la maggior parte è probabile che sia compatibile con questo protocollo di estrazione proteica, purché si ottiene una completa interruzione dei campioni di C. elegans.
Come presentato, questo protocollo di preparazione dell'estratto è compatibile con più esperimenti a valle, tra cui l'immunoprecipitazioneproteica 2 e il pull-down di microRNA12 e consente la raccolta a valle di componenti di proteine e RNA. Estrae inoltre in modo efficiente proteine nucleari e citoplasmatiche (Figura 2, Figura 3e Figura 4). Allo stesso modo, il protocollo di immunoprecipitazione presentato consente l'isolamento dell'RNA dagli immunopreciti associati alle proteine. Mentre il protocollo di immunoprecipitazione è stato originariamente sviluppato per identificare gli interattori proteici ALG-1, il metodo può essere adattato per testare le interazioni tra qualsiasi proteina di interesse. Infatti, le condizioni di immunoprecipitazione utilizzate hanno funzionato altrettanto bene per l'immunoprecipitazione di ALG-1 (Figura 3) e HRPK-1(Figura 4). Questo protocollo è un ottimo punto di partenza per l'immunopurificazione delle proteine leganti l'RNA. Va notato, tuttavia, che alcuni cambiamenti nella composizione tampone possono essere necessari per altre proteine di interesse. I cambiamenti possono dipendere dalle proprietà fisiche e biochimiche della proteina di interesse e devono essere attuati caso per caso.
Una volta che la proteina bersaglio (qui, ALG-1 o HRPK-1) è immunoprecipitata, l'blotting occidentale può essere utilizzato per testare il co-immunoprecipitato per specifici interattori proteici.
In alternativa, l'immunoprecipitato copurato può essere sottoposto ad analisi di spettrometria di massa per identificare tutte le proteine putative interagenti. Le interazioni co-immunoprecipitazione confermate possono quindi essere esaminate in una varietà di background genetici o condizioni per identificare la potenziale regolazione dell'interazione specifica. Ad esempio, per determinare se hrpk-1 svolge un ruolo nell'assemblaggio miRISC ALG-1/AIN-1, la coprecipitazione ALG-1-AIN-1 è stata valutata sia in uno sfondo di tipo selvaggio che in assenza di HRPK-1 (Figura 3). hrpk-1 è stato trovato dispensabile per l'interazione ALG-1/AIN-12 (Figura 3). Inoltre, la tecnologia di editing del genoma CRISPR/Cas9 può essere utilizzata per generare mutazioni del singolo punto o del dominio nelle proteine di interesse. Ritestare la capacità dei mutanti generati di coprecipitate con i loro interattori proteici può rivelare quali domini o residui mediano l'interazione fisica. Tali studi futuri possono fornire informazioni preziose sul meccanismo della funzione e della regolazione delle proteine. Questi approcci, combinati con il potere della genetica C. elegans, possono fornire importanti intuizioni sui processi molecolari fondamentali che governano lo sviluppo animale e la funzione cellulare.

Identificare le interazioni macromolecolari di una proteina di interesse può essere la chiave per saperne di più sulla sua funzione. Gli esperimenti di immunoprecipitazione e co-immunoprecipitazione possono essere utilizzati per identificare l'intero interamome di una proteina attraverso approcci proteomici sularga scala 1 o per testare specificamente la capacità di una proteina di coprecipitate con un interagente ipotizzato. In C. elegans, entrambi i metodi sono stati utilizzati con successo per saperne di più sull'attività di una varietà di proteine, comprese quelle che funzionano strettamente con i microRNA perregolare l'espressione genica 2,3,4. Gli esperimenti di co-immunoprecipitazione hanno il vantaggio di testare le interazioni proteina-proteina nel loro ambiente cellulare nativo, ma la preparazione degli estratti può essere impegnativa e dispendiosa in termini di tempo. È necessaria un'analisi efficiente del campione, ma bisogna fare attenzione a ridurre al minimo l'interruzione delle interazioni proteina-proteina. Metodi come il douncing5, la sonicazione6,l'omogeneizzazione balch7e l'omogeneizzazione delle perline di zirconia8,9 sono stati utilizzati per preparare con successo gli estratti proteici totali di C. elegans. Questi metodi, ad eccezione dell'omogeneizzazione delle perline di zirconia, hanno limitazioni in termini di numero di campioni che possono essere elaborati contemporaneamente. Presentato è un metodo alternativo che può essere facilmente scalato per consentire una preparazione rapida ad alto contenuto di produzione e estratto proteico da campioni di C. elegans seguita da co-immunoprecipitazione. In particolare, il metodo può preparare fino a 24 campioni alla volta, riducendo notevolmente il tempo necessario per la preparazione dell'estratto. Al contrario, ad esempio, il douncing in genere consente una sola preparazione del campione alla volta. Questo metodo di estrazione può essere utilizzato per preparare estratti da qualsiasi stadio di sviluppo di C. elegans.
Descritto è una procedura dettagliata per la raccolta di campioni animali, la preparazione degli estratti, l'immunoprecipitazione e la presentazione dei dati western di soffiatura per confermare il successo del pulldown proteico e il rilevamento della proteina co-immunoprecipitante di interesse. Per dimostrare l'efficacia del protocollo, sono stati eseguiti due esperimenti di co-immunoprecipitazione tra 1) microRNA Argonaute ALG-1 e AIN-1, un omologo GW182; e 2) ALG-1 e HRPK-1, un interagente ALG-1 appena identificato2. ALG-1 e AIN-1 sono proteine fondamentali che comprendono il complesso silenziatore indotto da microRNA (miRISC) e l'interazione tra queste due proteine èben consolidata 10,11. Il protocollo di preparazione dell'estratto è stato efficace nell'esperimento di co-immunoprecipitazione ALG-1-AIN-1. Questo protocollo ha anche confermato con successo l'interazione tra ALG-1 e il suo interagentore appena identificato, HRPK-12.
In sintesi, il manoscritto descrive un protocollo di preparazione dell'estrazione di C. elegans che può essere scalato fino a elaborare simultaneamente 24 campioni insieme a un protocollo di co-immunoprecipitazione che può essere utilizzato per identificare nuove o confermare interazioni ipotizzate tra proteine. Il protocollo di preparazione dell'estratto è compatibile con una serie di esperimenti a valle, tra cui l'immunoprecipitazioneproteica 2 e i pulldown di microRNA12. Inoltre, il protocollo di immunoprecipitazione può essere adattato per testare le interazioni tra due o più proteine endogene, taggate endogenamente o C. elegans sovraespresse in una varietà di background genetici.

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	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">15 mL tube</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">89039-664</td>
			<td style="width:213px;">STEP 1.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>BioRed</td>
			<td>1610737</td>
			<td>STEP 3.11</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#8211;20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels</td>
			<td>BioRed</td>
			<td>4561096</td>
			<td>STEP 4.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">anti-AIN-1 monoclonal antibody</td>
			<td style="width:195px;">custom generated</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>STEP 4.2, see ref. Zhang et al. 2007</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">anti-ALG-1 monoclonal antibody</td>
			<td style="width:195px;">custom generated by PRF&#38;L</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>STEP 4.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">anti-HRPK-1 monoclonal antibody</td>
			<td style="width:195px;">custom generated by PRF&#38;L</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>STEP 4.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bullet Blender Storm Homogenizer</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>BBY24M</td>
			<td>STEP 2.3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D9779-5G</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10002D</td>
			<td>STEP 3.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12321D</td>
			<td>STEP 3.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA-free protease inhibitors</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">GFP antibody (FL)</td>
			<td style="width:195px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-8334</td>
			<td>Figure 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Glycerol</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">G33-500</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Goat Anti-Rabbit Secondary Antibody, HRP</td>
			<td style="width:195px;">BioRed</td>
			<td style="width:119px;">1662408</td>
			<td>STEP 4.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">31470</td>
			<td>STEP 4.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">HEPES</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H4034-500G</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LICOR WesternSure PREMIUM Chemiluminescent Substrate, 100 mL Kit</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>926-95000</td>
			<td>STEP 4.3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:463px;">Magnesium chloride hexahydrate ACS</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">VWRV0288-500G</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Magnesium Sulfate Anhydrous</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">M65-500</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">20170-333</td>
			<td>STEP 1.6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N2 wild type</td>
			<td>CGC</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Navy RINO RNA Lysis Kit 50 pack (1.5 mL)</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>NAVYR1-RNA</td>
			<td>STEP 2.3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphatase inhibitor cocktail 2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5726-1ML</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphatase inhibitor cocktail 3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0044-1ML</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">P217-500</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">P285-3</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RC DC Protein Assay Kit I</td>
			<td>BioRed</td>
			<td>5000121</td>
			<td>STEP 2.9</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10777019</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S271-500</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S374-500</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">TritionX-100</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">X100-500ML</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UY38 hrpk-1(zen17)</td>
			<td>available upon request</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">VT1367 col-19::gfp(maIS105)</td>
			<td>available upon request</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VT3841 alg-1(tm492)</td>
			<td>available upon request</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein extract preparation and co-immunoprecipitation from caenorhabditis elegans

I metodi di co-immunoprecipitazione sono spesso usati per studiare le interazioni proteina-proteina. La conferma delle interazioni proteina-proteina ipotizzate o l'identificazione di nuove possono fornire informazioni inestimabili sulla funzione di una proteina di interesse. Alcuni dei metodi tradizionali per la preparazione degli estratti richiedono spesso tecniche ad alta intensità di manodopera e dispendiose in termini di tempo. Qui, un protocollo di preparazione degli estratti modificato che utilizza un omogeneizzatore per mulini perline e perline metalliche è descritto come una rapida alternativa ai metodi tradizionali di preparazione delle proteine. Questo metodo di preparazione dell'estratto è compatibile con studi di co-immunoprecipitazione a valle. Ad esempio, il metodo è stato utilizzato per co-immunoprecipitato con successo C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 e due interattori ALG-1 noti: AIN-1 e HRPK-1. Questo protocollo include descrizioni della raccolta dei campioni animali, della preparazione degli estratti, della chiarificazione dell'estratto e dell'immunoprecipitazione proteica. Il protocollo descritto può essere adattato per testare le interazioni tra due o più proteine endogene, taggate endogenamente o sovraespresse di C. elegans in una varietà di background genetici.

Questo protocollo (schematizzato nella figura 1) è stato utilizzato con successo per ottenere estratti proteici totali di C. elegans (Figura 2) per l'immunoprecipitazione a valle didiverse proteine 2 (figura 3 e figura 4). Il protocollo di omogeneizzatore del mulino perline presentato era paragonabile, nell'estrazione totale delle proteine, ai metodi a base di dounce(figura 2)ed estratti in modo efficiente nucleare (COL-19::GFP(NLS)(figura 2)e proteine citoplasmatiche(figura 3 e figura 4). Più campioni di varie dimensioni sono stati estratti simultaneamente (Figura 2). Le proteine argonaute interagiscono con i membri della famiglia delle proteine GW182, formando i miRISC che si legano agli RRNA messaggero bersaglio e reprimeno la loroespressione 10. La figura 3 mostra una co-immunoprecipitazione riuscita dei componenti miRISC centrali ALG-1 e AIN-1, coerente con le precedentirelazioni 11,17. Più recentemente, sono stati compiuti sforzi per identificare ulteriori interattori proteici di Argonaute ALG-1 3 al fine disaperne di più su come la biogenesi e l'attività del microRNA potrebbero essere regolate da fattori ausiliari. La proteina hrpk-1 legante l'RNA è stata identificata negli immunoprecitiALG-1 3. Questa interazione è stata recentemente confermata in un esperimento di immunoprecipitazione HRPK-1reciproco 2. I protocolli di estrazione e immunoprecipitazione presentati hanno recuperato con successo ALG-1 in co-immunopreciti specifici di HRPK-1 (Figura 4). Inoltre, l'interazione ALG-1-AIN-1 è stata testata in una varietà di background genetici e HRPK-1 si è dimostrato non necessario per l'assemblaggio miRISC ALG-1/AIN-12 (Figura 3). Sono forniti dati supplementari per mostrare l'intera membrana sonanale(Figura supplementare 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig1.jpg"> Figura 1: Schema del flusso di lavoro per C. elegans estrarre la preparazione e l'immunoprecipitazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig2.jpg"> Figura 2: Confronto western di una FPG localizzata nucleare, COL-19::GFP(NLS), livelli in campioni preparati a dounce e omogeneizzati da 250 μL e 100 μL di pellet di verme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig3.jpg"> Figura 3: Gw182 omologa AIN-1 co-immunopreciti con ALG-1. Western blotting per proteine ALG-1 e AIN-1 negli immunopreciti ALG-1. La co-immunoprecipitazione ALG-1/AIN-1 non è stata influenzata dall'assenza di hrpk-1. Ingresso = 10% di IP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig4.jpg"> Figura 4: Co-immunopreciti ALG-1 con HRPK-1. Viene mostrato l'gonfiore occidentale per HRPK-1 e ALG-1 negli immunopreciti HRPK-1. Ingresso = 10% di IP. * indica la catena pesante degli anticorpi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">M9 buffer (1 L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>KH2PO4
</td>
			<td>3 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Na2HPO4
</td>
			<td>6 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgSO4
</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>fino a 1 L</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">2x Tampone di lysis (5 mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES (pH 7.4)</td>
			<td>200 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 M KCl</td>
			<td>250 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% TritonX</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgCl2
</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glicerolo al 100%</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>fino a 5 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Aggiungi fresco:</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M DTT</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Inibitore della proteasi senza EDTA</td>
			<td>1 compressa</td>
		</tr>
<tr>
<td>cocktail inibitore della fosfatasi 2</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>cocktail inibitore della fosfatasi 3</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">1x Buffer di lysis</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Diluire il buffer di lysis 2x con un volume uguale di ddH20.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">1x Tampone di lavaggio 10 mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES (pH 7.4)</td>
			<td>300 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 M KCl</td>
			<td>500 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% TritonX</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgCl2
</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glicerolo al 100%</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>fino a 10 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M DTT</td>
			<td>20 μL (aggiungere fresco)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Ricette
Figura supplementare 1. Vengono mostrate le membrane western blot a sondare completo utilizzate per generare figure 2-4. (A) Membrana sondata per la figura 2. Si noti che la membrana è stata tagliata per consentire il sondaggio simultaneo per GFP e Tubulina, riducendo le dimensioni complessive della macchia. (B) Membrana sondata per la figura 3. (C) Membrana sondata per la figura 3. *denota la catena pesante degli anticorpi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/Supplemental_Figure_1.pdf" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans

Questo metodo descrive un protocollo per la preparazione di estratti proteici ad alta produttività da campioni di caenorhabditis elegans e successiva co-immunoprecipitazione.

Preparazione dell'estratto proteico e co-immunoprecipitazione da Caenorhabditis elegans

Co-immunoprecipitation methods are frequently used to study protein-protein interactions. Confirmation of hypothesized protein-protein interactions or ...

protein-extract-preparation-co-immunoprecipitation-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans

8.6K Views.  Kansas State University. Questo metodo descrive un protocollo per la preparazione di estratti proteici ad alta produttività da campioni di caenorhabditis elegans e successiva co-immunoprecipitazione.

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Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the field of environmental health. This is due in part to the paucity of model systems that can (1) accurately recapitulate keys features of reproductive processes and (2) do so in a medium- to high-throughput fashion, without the need for a high number of vertebrate animals.
We describe here an assay in the nematode C. elegans that allows the rapid identification of germline toxicants by monitoring the induction of aneuploid embryos. By making use of a GFP reporter line, errors in chromosome segregation resulting from germline disruption are easily visualized and quantified by automated fluorescence microscopy. Thus the screening of a particular set of compounds for its toxicity can be performed in a 96- to 384-well plate format in a matter of days. Secondary analysis of positive hits can be performed to determine whether the chromosome abnormalities originated from meiotic disruption or from early embryonic chromosome segregation errors. Altogether, this assay represents a fast first-pass strategy for the rapid assessment of germline dysfunction following chemical exposure.

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

Valutazione completa della linea germinale Chemical Tossicità Utilizzando il nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting occurs. Loss of muscle mass and function is associated with muscle fiber type atrophy, fiber type switching, defective muscle regeneration associated with dysfunction of satellite cells, muscle stem cells, and other pathophysiological processes. These changes are associated with changes in intracellular as well as local and systemic niches. In addition to most commonly used rodent models of muscle ageing, there is a need to study muscle homeostasis and wasting using human models, which due to ethical implications, consist predominantly of in vitro cultures. Despite the wide use of human Myogenic Progenitor Cells (MPCs) and primary myoblasts in myogenesis, there is limited data on using human primary myoblast and myotube cultures to study molecular mechanisms regulating different aspects of age-associated muscle wasting, aiding in the validation of mechanisms of ageing proposed in rodent muscle. The use of human MPCs, primary myoblasts and myotubes isolated from adult and aged people, provides a physiologically relevant model of molecular mechanisms of processes associated with muscle growth, atrophy and regeneration. Here we describe in detail a robust, inexpensive, reproducible and efficient protocol for the isolation and maintenance of human MPCs&#160;and their progeny&#160;&#8212; myoblasts and myotubes from human muscle samples using enzymatic digestion. Furthermore, we have determined the passage number at which primary myoblasts from adult and aged people undergo senescence in an in vitro culture. Finally, we show the ability to transfect these myoblasts and the ability to characterize their proliferative and differentiation capacity and propose their suitability for performing functional studies of molecular mechanisms of myogenesis and muscle wasting in vitro.

This protocol describes a robust, reproducible and simple method of isolation and culture of myoblast progenitor cells from the skeletal muscle of adult and aged people. The muscles used here include foot and leg muscles. This approach enables the isolation of an enriched population of primary myoblasts for functional studies.

Preparazione e la cultura di cellule miogeniche Precursore / mioblasti primari dal muscolo scheletrico di adulti e esseri umani invecchiati

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been described, termed &#34;na&#239;ve&#34; and &#34;primed&#34; pluripotency. The mechanisms that control na&#239;ve-primed transition are poorly understood. In particular, we remain poorly informed about protein kinases that specify na&#239;ve and primed pluripotent states, despite increasing availability of high-quality tool compounds to probe kinase function. Here, we describe a scalable platform to perform targeted small molecule screens for kinase regulators of the na&#239;ve-primed pluripotent transition in mouse ESCs. This approach utilizes simple cell culture conditions and standard reagents, materials and equipment to uncover and validate kinase inhibitors with hitherto unappreciated effects on pluripotency. We discuss potential applications for this technology, including screening of other small molecule collections such as increasingly sophisticated kinase inhibitors and emerging libraries of epigenetic tool compounds.

Here, we present a quantitative and scalable protocol to perform targeted small molecule screens for kinase regulators of the na&#239;ve-primed pluripotent transition.

Un metodo semplice per identificare le cinasi che regolano la pluripotenza delle cellule staminali embrionali mediante screening di inibitori ad alta percentuale

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein are molecular motors that regulate anterograde and retrograde transport, respectively. These motors use microtubule networks as rails. Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful model organism to study axonal transport and IFT in vivo. Here, I describe a protocol to observe axonal transport and IFT in living C. elegans. Transported cargo can be visualized by tagging cargo proteins using fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP). C. elegans is transparent and GFP-tagged cargo proteins can be expressed in specific cells under cell-specific promoters. Living worms can be fixed by microbeads on 10% agarose gel without killing or anesthetizing the worms. Under these conditions, cargo movement can be directly observed in the axons and cilia of living C. elegans without dissection. This method can be applied to the observation of any cargo molecule in any cells by modifying the target proteins and/or the cells they are expressed in. Most basic proteins such as molecular motors and adaptor proteins that are involved in axonal transport and IFT are conserved in C. elegans. Compared to other model organisms, mutants can be obtained and maintained more easily in C. elegans. Combining this method with various C. elegans mutants can clarify the molecular mechanisms of axonal transport and IFT.

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a good model to study axonal and intracellular transport. Here, I describe a protocol for in vivo recording and analysis of axonal and intraflagellar transport in C. elegans.

Immobilizzazione del Caenorhabditis elegans per analizzare il trasporto intracellulare nei neuroni

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are facilitated by the transparency of the animal, the ability to do forward and reverse genetic assays, the relative ease of generating fluorescently labeled proteins, and the use of fluorescent dyes that can either be microinjected into the early embryo or incorporated into its food (E. coli strain OP50) to label cellular organelles (e.g. 9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1&#39;H-2,2&#39;-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Here, we present the use of a fluorescent pH-sensitive dye that stains intestinal lysosomes, providing a visual readout of dynamic, physiological changes in lysosomal acidity in live worms. This protocol does not measure lysosomal pH, but rather aims to establish a reliable method of assessing physiological relevant variations in lysosomal acidity. cDCFDA is a cell-permeant compound that is converted to the fluorescent fluorophore 5-(and-6)-carboxy-2&#39;,7&#39;-dichlorofluorescein (cDCF) upon hydrolysis by intracellular esterases. Protonation inside lysosomes traps cDCF in these organelles, where it accumulates. Due to its low pKa of 4.8, this dye has been used as a pH sensor in yeast. Here we describe the use of cDCFDA as a food supplement to assess the acidity of intestinal lysosomes in C. elegans. This technique allows for the detection of alkalinizing lysosomes in live animals, and has a broad range of experimental applications including studies on aging, autophagy, and lysosomal biogenesis.

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

A step-by-step guide to probe loss of lysosomal acidity in the intestine of C. elegans using the pH-sensitive vital dye 5(6)-carboxy-2&#39;,7&#39;-dichlorofluorescein diacetate (cDCFDA)

Valutazione Lysosomal alcalinizzazione l' intestino di Live Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

Analisi computazionale della linea germinale Caenorhabditis elegans di studiare la distribuzione dei Nuclei, le proteine ed il citoscheletro

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented protocol uses this model to determine the pathogenicity caused by the mitis group streptococci via the production of H2O2. The mitis group streptococci are an emerging threat that cause many human diseases such as bacteremia, endocarditis, and orbital cellulitis. Described here is a protocol to determine the survival of these worms in response to H2O2 produced by this group of pathogens. Using the gene skn-1 encoding for an oxidative stress response transcription factor, it is shown that this model is important for identifying host genes that are essential against streptococcal infection. Furthermore, it is shown that activation of the oxidative stress response can be monitored in the presence of these pathogens using a transgenic reporter worm strain, in which SKN-1 is fused to green fluorescent protein (GFP). These assays provide the opportunity to study the oxidative stress response to H2O2 derived by a biological source as opposed to exogenously added reactive oxygen species (ROS) sources.

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is an excellent model to dissect host-pathogen interactions. Described here is a protocol to infect the worm with members of the mitis group streptococci and determine activation of the oxidative stress response against H2O2 produced by this group of organisms.

Studiando lo Stress ossidativo causato dagli streptococchi di gruppo Mitis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous system can be observed, with single cell resolution, in vivo. Here, we present an integrated protocol for the examination of neurodevelopment in C. elegans embryos. Our protocol combines imaging, lineaging and neuroanatomical tracing of single cells in developing embryos. We achieve long-term, four-dimensional (4D) imaging of living C. elegans&#160;embryos with nearly isotropic spatial resolution through the use of Dual-view Inverted Selective Plane Illumination Microscopy (diSPIM). Nuclei and neuronal structures in the nematode embryos are imaged and isotropically fused to yield images with resolution of ~330 nm in all three dimensions. These minute-by-minute high-resolution 4D data sets are then analyzed to correlate definitive cell-lineage identities with gene expression and morphological dynamics at single-cell and subcellular levels of detail. Our protocol is structured to enable modular implementation of each of the described steps and enhance studies on embryogenesis, gene expression, or neurodevelopment.

Here, we present a combinatorial approach using high-resolution microscopy, computational tools, and single-cell labeling in living C. elegans embryos to understand single cell dynamics during neurodevelopment.

Microscopia isotropica leggera e analisi di lignaggio cellulare automatizzate al catalogo Caenorhabditis elegans embriogenesi con risoluzione subcellulare

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female reproductive tract. While in vitro studies suggest that sperm of internally fertilizing animals can respond to various cues from their surroundings, the inability to visualize their behavior inside the female reproductive tract creates a challenge for understanding sperm migration and mobility in its native environment. Here, we describe a method using C. elegans that overcomes this limitation and takes advantage of their transparent epidermis. C. elegans males stained with a mitochondrial&#160; dye are mated with adult hermaphrodites, which act as modified females, and deposit fluorescently labeled sperm into the hermaphrodite uterus. The migration and motility of the labeled sperm can then be directly tracked using an epi-fluorescence microscope in a live hermaphrodite. In wild-type animals, approximately 90% of the labeled sperm crawl through the uterus and reach the fertilization site, or spermatheca. Images of the uterus can be taken 1 h after mating to assess the distribution of the sperm within the uterus and the percentage of sperm that have reached the spermatheca. Alternatively, time-lapse images can be taken immediately after mating to assess sperm speed, directional velocity and reversal frequency. This method can be combined with other genetic and molecular tools available for the C.elegans to identify novel genetic and molecular mechanisms that are important in regulating sperm guidance and motility within the female reproductive tract.

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Sperm must successfully navigate through the oviduct to fertilize an oocyte. Here, we describe an assay for measuring sperm migration within the C. elegans hermaphrodite uterus. This assay can provide quantitative data on sperm distribution within the uterus after mating, as well as on speed, directional velocity, and reversal frequency.

Misurare la guida dello sperma e la motilità all'interno del tratto riproduttivo ermafrodita di Caenorhabditis elegans

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological conditions. Post-mitotic neurons represent a major cell type affected by aging. Although multiple mammalian models of neuronal aging exist, they are challenging and expensive to establish. The roundworm Caenorhabditis elegans is a powerful model to study neuronal aging, as these animals have short lifespan, an available robust genetic toolbox, and well-cataloged nervous system. The method presented herein allows for seamless isolation of specific cells based on the expression of a transgenic green fluorescent protein (GFP). Transgenic animal lines expressing GFP under distinct, cell type-specific promoters are digested to remove the outer cuticle and gently mechanically disrupted to produce slurry containing various cell types. The cells of interest are then separated from non-target cells through fluorescence-activated cell sorting, or by anti-GFP-coupled magnetic beads. The isolated cells can then be cultured for a limited time or immediately used for cell-specific ex vivo analyses such as transcriptional analysis by real time quantitative PCR. Thus, this protocol allows for rapid and robust analysis of cell-specific responses within different neuronal populations in C. elegans.

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for simple isolation of specific groups of live neuronal cells expressing green fluorescent protein from transgenic Caenorhabditis elegans lines. This method enables a variety of ex vivo studies focused on specific neurons and has the capacity to isolate cells for further short-term culturing.

Isolamento di popolazioni di neuroni specifici da nematode Caenorhabditis elegans

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...