Vorremmo ringraziare il centro di genetica di Caenorhabditis per i ceppi, le scienze naturali e ingegneria ricerca Consiglio (NSERC) e la Fondazione canadese per l'innovazione (CFI) per il finanziamento. Vorremmo ringraziare Dr. Lizhen Chen (dipartimento di sistemi cellulari e anatomia, UT Salute San Antonio) per consentire l'utilizzo illimitato del suoi attrezzature di laboratorio per tutti gli esperimenti di c. elegans , nonché Exing Dr. Wang (direttore associato, Optical Imaging Facility UT Salute San Antonio) per assistenza con la microscopia confocale. Vorremmo anche ringraziare il Dr. Myron Ignatius per fornire supporto e incoraggiamento per facilitare le riprese video.

1. coloranti e lisosomi intestinali di immagine
<ol><li>Piastre di coltura seme del nematode (NGM) con OP50
	<ol>
<li>Preparare piatti NGM secondo il protocollo raccomandato19 e lasciate asciugare per 2 giorni a temperatura ambiente le piastre chiuse.</li>
		<li>Inoculare i batteri OP50 in brodo di Luria brodo (LB) sterile e crescere in un'agitazione incubatore o bagnomaria a 37 ° C per 36 h o fino a quando il diametro esterno è compresa tra 0,2 e 0,4. Evitare l'uso di una coltura batterica con OD > 1 o OD < 0.2.</li>
		<li>Una volta piastre NGM sono asciutti, depositare una goccia (~ 30 µ l) di inoculo OP50 sul centro del piatto e quindi diffondere la goccia in una patch di circa 2 cm x 2 cm nel formato. Nota: Qualsiasi inoculo OP50 rimanente sono memorizzabili a 4 ° C per fino a un mese.</li>
		<li>Capovolgere le piastre OP50 quando l'inoculo si è asciugato (circa 10 o 15 min) e poi incubare le piastre a 37 ° C per 36 h.</li>
		<li>Dopo 36H, rimuovere le piastre dall'incubatore e conservare a 4 ° C fino all'utilizzo successivo. Nota: Le piastre dovrebbero essere buone per fino a 1 mese a 4 ° C.</li>
	</ol></li>
	<li>CDCFDA complemento per OP50
	<ol>
<li>Per integrare la cDCFDA sulle piastre OP50, preparare un brodo di lavoro di 10 mM cDCFDA in dimetilsolfossido (DMSO). Mantenere la soluzione di cDCFDA protette dalla luce e conservare a-20 ° C per un uso successivo.</li>
		<li>Posizionare delicatamente il 100 µ l di soluzione di cDCFDA di 10 mM sulla superficie del cerotto OP50 2 cm x 2 cm, tale che l'intero patch è uniformemente coperto con cDCFDA. Nota: È molto importante che l'intero patch di OP50 è coperto con cDCFDA. Se necessario, è possibile utilizzare fino a 150 µ l di cDCFDA per ogni piatto. Inoltre è indispensabile che la soluzione di cDCFDA non si estende oltre i bordi della patch OP50, poiché qualsiasi cDCFDA che scorre fuori la patch OP50 non verrà incorporata nell'alimento e si tradurrà in ridotta intensità di colorazione.</li>
		<li>Posizionare le piastre di OP50 in una casella scura sulla parte superiore del banco, fino a quando tutta la soluzione cDCFDA è assorbito nella patch batterica (solitamente circa 25-30 min).</li>
	</ol></li>
	<li>Macchiatura worm utilizzando cDCFDA
	<ol>
<li>Una volta che il cDCFDA ha completamente permeato la patch OP50, inserire non più di 20 vermi per piastra e incubare le piastre invertite a 20 ° C per un minimo di 14 h. Nota: Si consiglia di posizionare le piastre di cDCFDA in una scatola opaca per ridurre al minimo l'esposizione alla luce.</li>
		<li>Per controllare le differenze di assunzione tra esperimenti e per normalizzare i segnali cDCFDA, co-macchia con 3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato) ((consigliato) difluoro) boro (2,5 µ l di una soluzione preparata 1 mM), un colorante di ammina debole acidotropic cui fluorescenza è in gran parte non di tipo variant su tutto lo spettro di pH acido (Vedi Tabella materiali per nomi comuni dei reagenti). Nota: Non si colorano vermi per meno di 14 h, poiché questo può fornire cDCFDA insufficiente intensità di colorazione e dare una falsa interpretazione del pH lisosomiale.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparare vetrini per microscopia
	<ol>
<li>Posizionare due strisce parallele di etichettatura nastro circa 3 pollici di distanza su una superficie liscia e piana, ad esempio uno specchio (Figura 1).</li>
		<li>Rivestire la superficie dello specchio con spray idrorepellente e asciugare il liquido in eccesso.</li>
		<li>Sciogliere agarosio al 2% (disciolto in acqua distillata H2O) in un forno a microonde fino a quando completamente liquefatto, poi mettere una goccia di 50 µ l di agarosio tra le due strisce di nastro adesivo e rapidamente coprire la goccia con un vetrino da microscopio, tale che il vetrino sia perpendicolare alle strisce di nastro. Dopo l'agarosio è solidificato, formando un pad circolare sotto la diapositiva, capovolgere la diapositiva e aggiungere 10-15 µ l di 5mM sodio azide (NaN3) sul blocchetto di agarosio. Nota: NaN3 è un inibitore del citocromo C che, se usato in concentrazioni basse, reversibilmente anestetizza vermi affinché essi non si sposti durante la formazione immagine.</li>
		<li>Prendono i vermi dalla piastra OP50 completati con cDCFDA e trasferirli in un piatto pulito di NGM senza qualsiasi OP50. Consentire i vermi di muoversi per alcuni secondi per consentire la maggior parte della OP50 per essere rimosso dalla superficie dei vermi e quindi trasferire i vermi per il pad di agarosio contenente 5 mM sodio azide.</li>
		<li>Coprire immediatamente il pad di agarosio con un vetrino coprioggetto. Assicurarsi di posizionare delicatamente il vetrino coprioggetto senza esercitare troppa pressione, poiché questo può provocare vermi scoppiando. Nota: I batteri OP50 completati con cDCFDA reagiscono in quando visualizzate da microscopia, quindi è importante pulire i vermi come miglior possibile prima della loro immissione sul pad di agarosio contenente sodio azide. Se durante la preparazione più di 6 ceppi di c. elegans (tra cui N2, controllo di tipo selvaggio), si consiglia di preparare i campioni in lotti di 6, in modo da garantire che i vermi non asciugarsi sul pad di agarosio. In alcuni ceppi, vulva inizia a rompersi dopo lunghi periodi di tempo a causa della pressione dal vetrino coprioggetto, quindi è importante pianificare di conseguenza.</li>
	</ol></li>
	<li>Microscopia confocale Nota: Alcuni microscopi hanno una funzionalità incorporata che aumenta automaticamente l'intensità di fluorescenza per compensare i livelli variabili di fluorescenza. Tali microscopi non potrebbero funzionare bene per vermi macchiati con cDCFDA, in quanto intrinsecamente aumentano l'intensità della fluorescenza di campioni di imaging.<ol>
<li>Eseguire imaging su un microscopio confocale standard utilizzando lunghezze d'onda di eccitazione/emissione impostata su 488/530 nm per cDCFDA. Prendere le immagini su un unico piano (non Z-stack) dei lisosomi intestinali e utilizzare solo i lisosomi che sono a fuoco (intensità di segnale massima) per la quantificazione di intensità. Nota: Forse a causa delle differenze nella disponibilità di tintura, i lisosomi delle cellule intestinali direttamente posteriore alla faringe mantengono cDCFDA intensità indipendentemente dal genotipo o età di colorazione, quindi cura deve essere preso per evitare i lisosomi in queste cellule di imaging.</li>
		<li>La diapositiva contenente 2 giorno vecchio selvaggio tipo che N2 worm prima della battuta. Mentre così facendo, regolare i parametri di imaging confocale come potenza laser, pinhole e aperture per garantire che l'intensità di colorazione di cDCFDA non è troppo saturi. Nota: Una volta impostate, queste impostazioni non modificarle per tutta la durata dell'imaging per quel giorno.</li>
		<li>Catturare immagini a 1024 x 1024 pixel di un unico piano dell'intestino (3 o 4 immagini al verme) utilizzando una lente di ingrandimento di 60x. Nota: Lo spettro di emissione di cDCFDA a worms produrrà un singolo picco prominente a 520 nm in coincidenza con i suoi segnalati fluorescenza spettro20, fornendo una lettura segnale specifico che è distinta da autofluorescence intestinale (Figura 3).</li>
		<li>Esportare immagini confocal raw (file .lsm) come file TIFF per ogni canale.</li>
		<li>Quindi, aprire ImageJ e fare clic sul File | Aprire per aprire il file di immagine da quantificare. Una volta che l'immagine viene caricata, è possibile utilizzare lo strumento di selezione di forma ovale in ImageJ per selezionare una regione di interesse (ROI).</li>
		<li>Successivamente, fare clic su Analyze | Misura per quantificare l'intensità di fluorescenza per quel ROI. Selezionare 4 – 5 diversi lisosomi di messa a fuoco per ogni immagine e calcolare l'intensità di fluorescenza relativa media di ogni area di interesse (ROI).</li>
		<li>Per ogni immagine, misurare l'intensità di fluorescenza di fondo in una regione dell'intestino tra i lisosomi. Sottrarre i valori di intensità di fluorescenza di fondo dai valori di intensità di fluorescenza lisosomiale.</li>
		<li>In totale, raccogliere circa 30 a 50 singoli valori normalizzati per cDCFDA intensità (6-10 animali) per ogni sforzo in fase di test. Utilizzare questi valori per tracciare una casella e Baffo trama utilizzando qualsiasi software statistico appropriato. Nota: Colorazione può variare notevolmente a seconda di fattori come temperatura, tempo di incubazione e la salute/età complessiva degli animali tale che sono rilevanti all'interno del processo di campioni nello stesso esperimento colorazione solo i confronti di intensità di fluorescenza. Pertanto è importante elaborare controlli in ogni esperimento di colorazione. Calcolare le differenze statistiche (t-test) utilizzando qualsiasi software statistico appropriato.</li>
		<li>Immagine tutti i ceppi dallo stesso esperimento (macchiato lo stesso giorno) in sequenza, facendo attenzione a non per modificare i parametri di imaging.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Erjavec, N., Larsson, L., Grantham, J., Nystrom, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+aging+and+failure+to+segregate+damaged+proteins+in+Sir2+mutants.">Accelerated aging and failure to segregate damaged proteins in Sir2 mutants.</a> Genes Dev. 21 (19), 2410-2421 (2007).</li><li>Madeo, F., Eisenberg, T., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+for+the+avoidance+of+neurodegeneration.">Autophagy for the avoidance of neurodegeneration.</a> Genes Dev. 23 (19), 2253-2259 (2009).</li><li>Rubinsztein, D. 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Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Una varietà di eventi cellulari e molecolari contribuiscono all'invecchiamento, influenzato da tratti di storia di vita e fattori genetici. Nostro recente studio22 suggerisce che il ciclo riproduttivo svolge un ruolo importante nel controllare l'idoneità del soma attraverso la regolazione della dinamica di pH lisosomiale. Abbiamo mostrato che proteolisi lisosomiale-mediata sono promosso mentre gli animali si riproducono attivamente dal upregulation della trascrizione del v-atpasi, che a sua volt...

L'aspetto di aggregati proteici ampiamente è accettato per essere un marchio di garanzia di invecchiamento in cellule eucariotiche1,2,3e la formazione di cui è pensato per essere tra i piloti di principio di senescenza cellulare4 , 5 , 6 , 7. sta coltivando la prova che come cellule età, catabolismo proteico è alterato, portando ad un aumento di aggregazione proteica. Il crollo di proteolisi in cellule di invecchiamento comporta un danno dell'autofagia8 , così come di degradazione proteasome-mediata della proteina9. Infine, ossidazione irreversibile della proteina è aumentata in cellule vecchie, compromettendo ulteriormente proteina catabolismo10.
L'autofagia è stato inizialmente pensato per essere un processo non-selettivi per la degradazione della massa di proteine danneggiate, ma recenti studi hanno indicato che l'autofagia è altamente selettivo per il catabolismo di aggregati di proteine e organelli disfunzionali che non sono suscettibili di degradazione tramite altri meccanismi di clearance proteina11. Durante il processo di autofagia, proteine danneggiate e aggregate sono sequestrate in una vescicola di doppia membrana chiamata autofagosoma. Quindi questo autofagosoma si fonde con gli acidi organelli chiamati lisosomi, che porta alla degradazione dell'autofagosoma carico12. I lisosomi rappresentano il punto finale del pathway autofagico e partecipano a diversi processi cellulari come la riparazione della membrana, controllo trascrizionale e rilevamento dei nutrienti; evidenziando il loro ruolo centralizzato nell'omeostasi cellulare (rivisto in rif. 13). Parecchi studi hanno indicato un'associazione tra una diminuzione età-dipendente nella funzione lisosomiale e vari disordini di neurodegenerative13. Coerentemente, ristabilimento della funzione lysosomal in cellule anziani può ritardare l'insorgenza di relazione con l'invecchiamento fenotipi14,15. Gli studi della composizione del milieu mancata suggeriscono che il collasso della funzione lysosomal in cellule anziani non è a causa di una riduzione della produzione di proteasi lisosomiali16. In alternativa, è stato proposto che perdita di acidità intralysosomal, un requisito fondamentale della sua attività enzimatica, può essere alla base il calo di proteolisi lisosoma-mediata17. Per essere in grado di esplorare questa ipotesi, è essenziale sviluppare reagenti e protocolli per sondare i cambiamenti dinamici nel pH lisosomiale in cellule vive in maniera coerenza e replicabile.
L'intestino di c. elegans è il tessuto metabolico principale in viti senza fine ed è un regolatore critico dell'omeostasi sistemica e durata della vita. Abbiamo sviluppato saggi per valutare i cambiamenti dell'acidità del lume intestinali lisosomi di vermi per determinare come lisosoma-mediata proteolisi contribuisce all'invecchiamento. Anche se fluorofori pH sensibili sono stati usati precedentemente in c. elegans per contrassegnare i lisosomi intestinali, ci non è stato ancora uno sforzo per stabilire un protocollo di successo in grado di rilevare piccoli aumenti in pH lisosomiale in vivo18. Qui, forniamo un protocollo che può essere utilizzato per rilevare la perdita di acidità lisosomiale nelle cellule intestinali di c. elegans utilizzando un protocollo di alimentazione semplice e conveniente che incorpora un fluoroforo pH sensibili (cDCFDA) in OP50 cibo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1166">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:475px;">OP50 (E. coli)</td>
			<td style="width:188px;">Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:385px;">Order online at https://cgc.umn.edu/strain/OP50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">5(6)-carboxy-2&#8217;,7&#8217;-dichlorofluorescein diacetate&#160;</td>
			<td style="width:188px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">C369</td>
			<td>Commonly known as cDCFDA</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:475px;">9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1&#39;H-2,2&#39;-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron</td>
			<td style="width:188px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">L7528</td>
			<td>Commonly known as Lysotracker Red</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Confocal microscope (e.g. Zeiss LSM 510)</td>
			<td style="width:188px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">ImageJ</td>
			<td style="width:188px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Download for free from https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">LB Broth powder</td>
			<td style="width:188px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">22700041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Bacto Agar</td>
			<td style="width:188px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A5306-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">NaCl</td>
			<td style="width:188px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Bacto Peptone</td>
			<td style="width:188px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S71604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Cholesterol powder</td>
			<td style="width:188px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C3045&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">CaCl2</td>
			<td style="width:188px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">449709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">MgSO4</td>
			<td style="width:188px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">K3PO4</td>
			<td style="width:188px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P5629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Sodium Azide</td>
			<td style="width:188px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">DMSO</td>
			<td style="width:188px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Microscope Slides</td>
			<td style="width:188px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Cover Slips</td>
			<td style="width:188px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">3406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Agarose</td>
			<td style="width:188px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Incubator</td>
			<td style="width:188px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Mirror or other smooth flat surface</td>
			<td style="width:188px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing lysosomal alkalinization in the intestine of live caenorhabditis elegans

Il nematode Caenorhabditis elegans (c. elegans) è un sistema di modello che è ampiamente usato per studiare la longevità e le vie dello sviluppo. Tali studi sono facilitati dalla trasparenza dell'animale, la capacità di avanti e indietro le analisi genetiche, la relativa facilità di generare proteine fluorescente contrassegnati e l'uso di coloranti fluorescenti che possono sia essere microiniettati in anticipo embrione o incorporati in suo cibo (e. coli ceppo OP50) per etichettare gli organelli cellulari (ad es. 9-diethylamino-5h-benzo (a) phenoxazine-5-one e (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1)) methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN} - N - [2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Qui, presentiamo l'uso di un colorante fluorescente pH sensibili che macchie intestinali lisosomi, fornendo una lettura visiva dei cambiamenti dinamici, fisiologici acidità lisosomiale in vermi vivi. Questo protocollo non misurare pH lisosomiale, ma piuttosto mira a stabilire un metodo affidabile di valutazione fisiologiche varianti pertinenti lysosomal acidità. cDCFDA è un cellulare-permeante composto che viene convertito il fluoroforo fluorescente 5-(and-6)-carboxy-2',7'-dichlorofluorescein (cDCF) su idrolisi dalle esterasi intracellulari. Protonazione all'interno dei lisosomi trappole cDCF in questi organelli, dove si accumula. A causa del suo basso pKa di 4.8, questo colorante è stato utilizzato come un sensore di pH in lievito. Qui descriviamo l'uso di cDCFDA come integratore alimentare per valutare l'acidità dei lisosomi intestinali in elegans del c. Questa tecnica consente il rilevamento dei lisosomi alcalinizzante in animali vivi, e ha una vasta gamma di applicazioni sperimentali tra cui studi sull'invecchiamento, autophagy e biogenesi lisosomiale.

cDCFDA macchie lysosomes in maniera dipendente dal pH, e il suo basso pKa e pronto assorbimento lisosomi rende un sensore di pH ideale21. cDCFDA intensità di colorazione è inversamente proporzionale al pH lisosomiale (cioè colorazione intensità aumenta con il diminuire del pH)18,22. cDCFDA segnali sono costantemente deboli nei lisosomi di animali trattati con clorochina, un inibitore dell'acidi...

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Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Una guida dettagliata per sondare la perdita di acidità lysosomal nell'intestino di c. elegans usando il colorante vitale sensibili al pH 6 - carboxy - 2', 7'-diclorofluoresceina diacetato (cDCFDA)

Valutazione Lysosomal alcalinizzazione l' intestino di Live Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

5.9K Views.  University of Saskatchewan. Una guida dettagliata per sondare la perdita di acidità lysosomal nell'intestino di c. elegans usando il colorante vitale sensibili al pH 6 - carboxy - 2', 7'-diclorofluoresceina diacetato (cDCFDA)

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Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the field of environmental health. This is due in part to the paucity of model systems that can (1) accurately recapitulate keys features of reproductive processes and (2) do so in a medium- to high-throughput fashion, without the need for a high number of vertebrate animals.
We describe here an assay in the nematode C. elegans that allows the rapid identification of germline toxicants by monitoring the induction of aneuploid embryos. By making use of a GFP reporter line, errors in chromosome segregation resulting from germline disruption are easily visualized and quantified by automated fluorescence microscopy. Thus the screening of a particular set of compounds for its toxicity can be performed in a 96- to 384-well plate format in a matter of days. Secondary analysis of positive hits can be performed to determine whether the chromosome abnormalities originated from meiotic disruption or from early embryonic chromosome segregation errors. Altogether, this assay represents a fast first-pass strategy for the rapid assessment of germline dysfunction following chemical exposure.

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

Valutazione completa della linea germinale Chemical Tossicità Utilizzando il nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a population of rapidly cycling intestinal stem cells (ISCs) characterized by their expression of the Lgr5 gene. These are supported by a quiescent stem cell population, marked by Bmi-1 expression, capable of replacing them in the event of injury. Investigating the interactions between these populations is crucial to understanding their roles in disease and cancer. The ISCs exist within crypts on the intestinal surface, these niches support the ISC in replenishing the epithelia. The interaction between active and quiescent ISCs likely involves other differentiated cells within the niche, as it has previously been demonstrated that the &#8216;&#8216;stemness&#8217;&#8217; of the Lgr5 ISC is closely tied to the presence of their neighboring Paneth cells. Using conditional cre-lox mouse models we tested the effect of deleting the majority of active ISCs in the presence or absence of the Paneth cells. Here we describe the techniques and analysis undertaken to characterize the intestine and demonstrate that the Paneth cells play a crucial role within the ISC niche in aiding recovery following substantial insult.

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

Intestinal epithelial stem cells (ISCs) are intermingled with Paneth cells. These cells are differentiated progeny of the ISC, which support the ISCs and provide antibacterial protection. Here we demonstrate how we used transgenic conditional mouse models to establish that Paneth cells play a crucial role in maintaining the intestinal epithelia.

Protocolli per l&#39;analisi del ruolo delle cellule Paneth in Rigenerazione della murino Intestino con condizionale<em&gt; Cre-lox</em&gt; Modelli mouse

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple cellular and developmental processes principally via activation of ERK, the terminal kinase of the pathway. Tight regulation of ERK activity is essential for normal development and homeostasis; overly active ERK results in excessive cellular proliferation, while underactive ERK causes cell death. C. elegans is a powerful model system that has helped characterize the function and regulation of RTK-RAS-ERK signaling pathway during development. In particular, the RTK-RAS-ERK pathway is essential for C. elegans germline development, which is the focus of this method. Using antibodies specific to the active, diphosphorylated form of ERK (dpERK), the stereotypical localization pattern can be visualized within the germline. Because this pattern is both spatially and temporally controlled, the ability to reproducibly assay dpERK is useful to identify regulators of the pathway that affect dpERK signal duration and amplitude and thus germline development. Here we demonstrate how to successfully dissect, stain, and image dpERK within the C. elegans gonad. This method can be adapted for spatial localization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided an antibody compatible with immunofluorescence is available.

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

We present an immunofluorescence&#160;imaging-based method for spatial and temporal localization of active ERK in the dissected C. elegans gonad. The protocol described here can be adapted for visualization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided a suitable antibody reagent is available.

Spaziale e temporale Analisi di attiva ERK nel<em&gt; C. elegans</em&gt; Linea germinale

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

In Vitro Coltivazione dell'ovulo per Live cell Imaging di zigote polarizzazione e Patterning di embrione in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Imaging Live di Mouse Seconda Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the lumen and basolateral membranes contacting each other and/or the extracellular matrix. How this distinctive membrane asymmetry is established and maintained during organ morphogenesis is still an unresolved question of cell biology. This protocol describes the C. elegans intestine as a&#160;model for the analysis of polarized membrane biogenesis during tube morphogenesis, with emphasis on apical membrane and lumen biogenesis. The C. elegans twenty-cell single-layered intestinal epithelium is arranged into a simple bilaterally symmetrical tube, permitting analysis on a single-cell level. Membrane polarization occurs concomitantly with polarized cell division and migration during early embryogenesis, but de novo polarized membrane biogenesis continues throughout larval growth, when cells no longer proliferate and move. The latter setting allows one to separate subcellular changes that simultaneously mediate these different polarizing processes, difficult to distinguish in most polarity models. Apical-, basolateral membrane-, junctional-, cytoskeletal- and endomembrane components can be labeled and tracked throughout development by GFP fusion proteins, or assessed by in situ antibody staining. Together with the organism&#39;s genetic versatility, the C. elegans intestine thus provides a unique in vivo model for the visual, developmental, and molecular genetic analysis of polarized membrane and tube biogenesis. The specific methods (all standard) described here include how to: label intestinal subcellular components by antibody staining; analyze genes involved in polarized membrane biogenesis by loss-of-function studies adapted to the typically essential tubulogenesis genes; assess polarity defects during different developmental stages; interpret phenotypes by epifluorescence, differential interference contrast (DIC) and confocal microscopy; quantify visual defects. This protocol can be adapted to analyze any of the often highly conserved molecules involved in epithelial polarity, membrane biogenesis, tube and lumen morphogenesis.

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analy

The transparent C. elegans intestine can serve as an "in vivo tissue chamber" for studying apicobasal membrane and lumen biogenesis at the single-cell and subcellular level during multicellular tubulogenesis. This protocol describes how to combine standard labeling, loss-of-function genetic/RNAi and microscopic approaches to dissect these processes on a molecular level.

Il c. elegans intestino come un modello per intercellulare Lumen morfogenesi e biogenesi di membrana polarizzata In Vivo a livello di singola cellula: etichettatura da macchiatura dell'anticorpo, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein are molecular motors that regulate anterograde and retrograde transport, respectively. These motors use microtubule networks as rails. Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful model organism to study axonal transport and IFT in vivo. Here, I describe a protocol to observe axonal transport and IFT in living C. elegans. Transported cargo can be visualized by tagging cargo proteins using fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP). C. elegans is transparent and GFP-tagged cargo proteins can be expressed in specific cells under cell-specific promoters. Living worms can be fixed by microbeads on 10% agarose gel without killing or anesthetizing the worms. Under these conditions, cargo movement can be directly observed in the axons and cilia of living C. elegans without dissection. This method can be applied to the observation of any cargo molecule in any cells by modifying the target proteins and/or the cells they are expressed in. Most basic proteins such as molecular motors and adaptor proteins that are involved in axonal transport and IFT are conserved in C. elegans. Compared to other model organisms, mutants can be obtained and maintained more easily in C. elegans. Combining this method with various C. elegans mutants can clarify the molecular mechanisms of axonal transport and IFT.

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a good model to study axonal and intracellular transport. Here, I describe a protocol for in vivo recording and analysis of axonal and intraflagellar transport in C. elegans.

Immobilizzazione del Caenorhabditis elegans per analizzare il trasporto intracellulare nei neuroni

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain and protect cellular identities. The conversion of germ cells into specific neurons in the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful tool for performing genetic screens in order to dissect regulatory pathways that safeguard established cell identities. Reprogramming of germ cells to a specific type of neurons termed ASE requires transgenic animals that allow broad over-expression of the Zn-finger transcription factor (TF) CHE-1. Endogenous CHE-1 is expressed exclusively in two head neurons and is required to specify the glutamatergic ASE neurons fate, which can easily be visualized by the gcy-5prom::gfp reporter. A trans gene containing the heat-shock promoter-driven che-1 gene expression construct allows broad mis-expression of CHE-1 in the entire animal upon heat-shock treatment. The combination of RNAi against the chromatin-regulating factor LIN-53 and heat-shock-induced che-1 over-expression leads to reprogramming of germ cell into ASE neuron-like cells. We describe here the specific RNAi procedure and appropriate conditions for heat-shock treatment of transgenic animals in order to successfully induce germ cell to neuron conversion.

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

This protocol describes how to study cellular processes during cell fate conversion in Caenorhabditis elegans in vivo. Using transgenic animals, allowing heat-shock promoter-driven overexpression of the neuron fate-inducing transcription factor CHE-1 and RNAi-mediated depletion of the chromatin-regulating factor LIN-53 germ cell to neuron reprogramming can be observed in vivo.

Applicazione di RNAi ed espressione di fattore di trascrizione indotta da calore-shock per riprogrammare le cellule germinali ai neuroni in c. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

Analisi computazionale della linea germinale Caenorhabditis elegans di studiare la distribuzione dei Nuclei, le proteine ed il citoscheletro

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented protocol uses this model to determine the pathogenicity caused by the mitis group streptococci via the production of H2O2. The mitis group streptococci are an emerging threat that cause many human diseases such as bacteremia, endocarditis, and orbital cellulitis. Described here is a protocol to determine the survival of these worms in response to H2O2 produced by this group of pathogens. Using the gene skn-1 encoding for an oxidative stress response transcription factor, it is shown that this model is important for identifying host genes that are essential against streptococcal infection. Furthermore, it is shown that activation of the oxidative stress response can be monitored in the presence of these pathogens using a transgenic reporter worm strain, in which SKN-1 is fused to green fluorescent protein (GFP). These assays provide the opportunity to study the oxidative stress response to H2O2 derived by a biological source as opposed to exogenously added reactive oxygen species (ROS) sources.

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is an excellent model to dissect host-pathogen interactions. Described here is a protocol to infect the worm with members of the mitis group streptococci and determine activation of the oxidative stress response against H2O2 produced by this group of organisms.

Valutazione Lysosomal alcalinizzazione l' intestino di Live Caenorhabditis elegans

Riepilogo

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Valutazione completa della linea germinale Chemical Tossicità Utilizzando il nematode

Protocolli per l'analisi del ruolo delle cellule Paneth in Rigenerazione della murino Intestino con condizionale

Spaziale e temporale Analisi di attiva ERK nel