Name: assessing lysosomal alkalinization in the intestine of live caenorhabditis elegans
Uploaded: 2018-04-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Vorremmo ringraziare il centro di genetica di Caenorhabditis per i ceppi, le scienze naturali e ingegneria ricerca Consiglio (NSERC) e la Fondazione canadese per l'innovazione (CFI) per il finanziamento. Vorremmo ringraziare Dr. Lizhen Chen (dipartimento di sistemi cellulari e anatomia, UT Salute San Antonio) per consentire l'utilizzo illimitato del suoi attrezzature di laboratorio per tutti gli esperimenti di c. elegans , nonché Exing Dr. Wang (direttore associato, Optical Imaging Facility UT Salute San Antonio) per assistenza con la microscopia confocale. Vorremmo anche ringraziare il Dr. Myron Ignatius per fornire supporto e incoraggiamento per facilitare le riprese video.

1. coloranti e lisosomi intestinali di immagine
<ol><li>Piastre di coltura seme del nematode (NGM) con OP50
	<ol>
<li>Preparare piatti NGM secondo il protocollo raccomandato19 e lasciate asciugare per 2 giorni a temperatura ambiente le piastre chiuse.</li>
		<li>Inoculare i batteri OP50 in brodo di Luria brodo (LB) sterile e crescere in un'agitazione incubatore o bagnomaria a 37 ° C per 36 h o fino a quando il diametro esterno è compresa tra 0,2 e 0,4. Evitare l'uso di una coltura batterica con OD > 1 o OD < 0.2.</li>
		<li>Una volta piastre NGM sono asciutti, depositare una goccia (~ 30 µ l) di inoculo OP50 sul centro del piatto e quindi diffondere la goccia in una patch di circa 2 cm x 2 cm nel formato. Nota: Qualsiasi inoculo OP50 rimanente sono memorizzabili a 4 ° C per fino a un mese.</li>
		<li>Capovolgere le piastre OP50 quando l'inoculo si è asciugato (circa 10 o 15 min) e poi incubare le piastre a 37 ° C per 36 h.</li>
		<li>Dopo 36H, rimuovere le piastre dall'incubatore e conservare a 4 ° C fino all'utilizzo successivo. Nota: Le piastre dovrebbero essere buone per fino a 1 mese a 4 ° C.</li>
	</ol></li>
	<li>CDCFDA complemento per OP50
	<ol>
<li>Per integrare la cDCFDA sulle piastre OP50, preparare un brodo di lavoro di 10 mM cDCFDA in dimetilsolfossido (DMSO). Mantenere la soluzione di cDCFDA protette dalla luce e conservare a-20 ° C per un uso successivo.</li>
		<li>Posizionare delicatamente il 100 µ l di soluzione di cDCFDA di 10 mM sulla superficie del cerotto OP50 2 cm x 2 cm, tale che l'intero patch è uniformemente coperto con cDCFDA. Nota: È molto importante che l'intero patch di OP50 è coperto con cDCFDA. Se necessario, è possibile utilizzare fino a 150 µ l di cDCFDA per ogni piatto. Inoltre è indispensabile che la soluzione di cDCFDA non si estende oltre i bordi della patch OP50, poiché qualsiasi cDCFDA che scorre fuori la patch OP50 non verrà incorporata nell'alimento e si tradurrà in ridotta intensità di colorazione.</li>
		<li>Posizionare le piastre di OP50 in una casella scura sulla parte superiore del banco, fino a quando tutta la soluzione cDCFDA è assorbito nella patch batterica (solitamente circa 25-30 min).</li>
	</ol></li>
	<li>Macchiatura worm utilizzando cDCFDA
	<ol>
<li>Una volta che il cDCFDA ha completamente permeato la patch OP50, inserire non più di 20 vermi per piastra e incubare le piastre invertite a 20 ° C per un minimo di 14 h. Nota: Si consiglia di posizionare le piastre di cDCFDA in una scatola opaca per ridurre al minimo l'esposizione alla luce.</li>
		<li>Per controllare le differenze di assunzione tra esperimenti e per normalizzare i segnali cDCFDA, co-macchia con 3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato) ((consigliato) difluoro) boro (2,5 µ l di una soluzione preparata 1 mM), un colorante di ammina debole acidotropic cui fluorescenza è in gran parte non di tipo variant su tutto lo spettro di pH acido (Vedi Tabella materiali per nomi comuni dei reagenti). Nota: Non si colorano vermi per meno di 14 h, poiché questo può fornire cDCFDA insufficiente intensità di colorazione e dare una falsa interpretazione del pH lisosomiale.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparare vetrini per microscopia
	<ol>
<li>Posizionare due strisce parallele di etichettatura nastro circa 3 pollici di distanza su una superficie liscia e piana, ad esempio uno specchio (Figura 1).</li>
		<li>Rivestire la superficie dello specchio con spray idrorepellente e asciugare il liquido in eccesso.</li>
		<li>Sciogliere agarosio al 2% (disciolto in acqua distillata H2O) in un forno a microonde fino a quando completamente liquefatto, poi mettere una goccia di 50 µ l di agarosio tra le due strisce di nastro adesivo e rapidamente coprire la goccia con un vetrino da microscopio, tale che il vetrino sia perpendicolare alle strisce di nastro. Dopo l'agarosio è solidificato, formando un pad circolare sotto la diapositiva, capovolgere la diapositiva e aggiungere 10-15 µ l di 5mM sodio azide (NaN3) sul blocchetto di agarosio. Nota: NaN3 è un inibitore del citocromo C che, se usato in concentrazioni basse, reversibilmente anestetizza vermi affinché essi non si sposti durante la formazione immagine.</li>
		<li>Prendono i vermi dalla piastra OP50 completati con cDCFDA e trasferirli in un piatto pulito di NGM senza qualsiasi OP50. Consentire i vermi di muoversi per alcuni secondi per consentire la maggior parte della OP50 per essere rimosso dalla superficie dei vermi e quindi trasferire i vermi per il pad di agarosio contenente 5 mM sodio azide.</li>
		<li>Coprire immediatamente il pad di agarosio con un vetrino coprioggetto. Assicurarsi di posizionare delicatamente il vetrino coprioggetto senza esercitare troppa pressione, poiché questo può provocare vermi scoppiando. Nota: I batteri OP50 completati con cDCFDA reagiscono in quando visualizzate da microscopia, quindi è importante pulire i vermi come miglior possibile prima della loro immissione sul pad di agarosio contenente sodio azide. Se durante la preparazione più di 6 ceppi di c. elegans (tra cui N2, controllo di tipo selvaggio), si consiglia di preparare i campioni in lotti di 6, in modo da garantire che i vermi non asciugarsi sul pad di agarosio. In alcuni ceppi, vulva inizia a rompersi dopo lunghi periodi di tempo a causa della pressione dal vetrino coprioggetto, quindi è importante pianificare di conseguenza.</li>
	</ol></li>
	<li>Microscopia confocale Nota: Alcuni microscopi hanno una funzionalità incorporata che aumenta automaticamente l'intensità di fluorescenza per compensare i livelli variabili di fluorescenza. Tali microscopi non potrebbero funzionare bene per vermi macchiati con cDCFDA, in quanto intrinsecamente aumentano l'intensità della fluorescenza di campioni di imaging.<ol>
<li>Eseguire imaging su un microscopio confocale standard utilizzando lunghezze d'onda di eccitazione/emissione impostata su 488/530 nm per cDCFDA. Prendere le immagini su un unico piano (non Z-stack) dei lisosomi intestinali e utilizzare solo i lisosomi che sono a fuoco (intensità di segnale massima) per la quantificazione di intensità. Nota: Forse a causa delle differenze nella disponibilità di tintura, i lisosomi delle cellule intestinali direttamente posteriore alla faringe mantengono cDCFDA intensità indipendentemente dal genotipo o età di colorazione, quindi cura deve essere preso per evitare i lisosomi in queste cellule di imaging.</li>
		<li>La diapositiva contenente 2 giorno vecchio selvaggio tipo che N2 worm prima della battuta. Mentre così facendo, regolare i parametri di imaging confocale come potenza laser, pinhole e aperture per garantire che l'intensità di colorazione di cDCFDA non è troppo saturi. Nota: Una volta impostate, queste impostazioni non modificarle per tutta la durata dell'imaging per quel giorno.</li>
		<li>Catturare immagini a 1024 x 1024 pixel di un unico piano dell'intestino (3 o 4 immagini al verme) utilizzando una lente di ingrandimento di 60x. Nota: Lo spettro di emissione di cDCFDA a worms produrrà un singolo picco prominente a 520 nm in coincidenza con i suoi segnalati fluorescenza spettro20, fornendo una lettura segnale specifico che è distinta da autofluorescence intestinale (Figura 3).</li>
		<li>Esportare immagini confocal raw (file .lsm) come file TIFF per ogni canale.</li>
		<li>Quindi, aprire ImageJ e fare clic sul File | Aprire per aprire il file di immagine da quantificare. Una volta che l'immagine viene caricata, è possibile utilizzare lo strumento di selezione di forma ovale in ImageJ per selezionare una regione di interesse (ROI).</li>
		<li>Successivamente, fare clic su Analyze | Misura per quantificare l'intensità di fluorescenza per quel ROI. Selezionare 4 – 5 diversi lisosomi di messa a fuoco per ogni immagine e calcolare l'intensità di fluorescenza relativa media di ogni area di interesse (ROI).</li>
		<li>Per ogni immagine, misurare l'intensità di fluorescenza di fondo in una regione dell'intestino tra i lisosomi. Sottrarre i valori di intensità di fluorescenza di fondo dai valori di intensità di fluorescenza lisosomiale.</li>
		<li>In totale, raccogliere circa 30 a 50 singoli valori normalizzati per cDCFDA intensità (6-10 animali) per ogni sforzo in fase di test. Utilizzare questi valori per tracciare una casella e Baffo trama utilizzando qualsiasi software statistico appropriato. Nota: Colorazione può variare notevolmente a seconda di fattori come temperatura, tempo di incubazione e la salute/età complessiva degli animali tale che sono rilevanti all'interno del processo di campioni nello stesso esperimento colorazione solo i confronti di intensità di fluorescenza. Pertanto è importante elaborare controlli in ogni esperimento di colorazione. Calcolare le differenze statistiche (t-test) utilizzando qualsiasi software statistico appropriato.</li>
		<li>Immagine tutti i ceppi dallo stesso esperimento (macchiato lo stesso giorno) in sequenza, facendo attenzione a non per modificare i parametri di imaging.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Erjavec, N., Larsson, L., Grantham, J., Nystrom, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+aging+and+failure+to+segregate+damaged+proteins+in+Sir2+mutants.">Accelerated aging and failure to segregate damaged proteins in Sir2 mutants.</a> Genes Dev. 21 (19), 2410-2421 (2007).</li><li>Madeo, F., Eisenberg, T., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+for+the+avoidance+of+neurodegeneration.">Autophagy for the avoidance of neurodegeneration.</a> Genes Dev. 23 (19), 2253-2259 (2009).</li><li>Rubinsztein, D. 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Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Una varietà di eventi cellulari e molecolari contribuiscono all'invecchiamento, influenzato da tratti di storia di vita e fattori genetici. Nostro recente studio22 suggerisce che il ciclo riproduttivo svolge un ruolo importante nel controllare l'idoneità del soma attraverso la regolazione della dinamica di pH lisosomiale. Abbiamo mostrato che proteolisi lisosomiale-mediata sono promosso mentre gli animali si riproducono attivamente dal upregulation della trascrizione del v-atpasi, che a sua volt...

L'aspetto di aggregati proteici ampiamente è accettato per essere un marchio di garanzia di invecchiamento in cellule eucariotiche1,2,3e la formazione di cui è pensato per essere tra i piloti di principio di senescenza cellulare4 , 5 , 6 , 7. sta coltivando la prova che come cellule età, catabolismo proteico è alterato, portando ad un aumento di aggregazione proteica. Il crollo di proteolisi in cellule di invecchiamento comporta un danno dell'autofagia8 , così come di degradazione proteasome-mediata della proteina9. Infine, ossidazione irreversibile della proteina è aumentata in cellule vecchie, compromettendo ulteriormente proteina catabolismo10.
L'autofagia è stato inizialmente pensato per essere un processo non-selettivi per la degradazione della massa di proteine danneggiate, ma recenti studi hanno indicato che l'autofagia è altamente selettivo per il catabolismo di aggregati di proteine e organelli disfunzionali che non sono suscettibili di degradazione tramite altri meccanismi di clearance proteina11. Durante il processo di autofagia, proteine danneggiate e aggregate sono sequestrate in una vescicola di doppia membrana chiamata autofagosoma. Quindi questo autofagosoma si fonde con gli acidi organelli chiamati lisosomi, che porta alla degradazione dell'autofagosoma carico12. I lisosomi rappresentano il punto finale del pathway autofagico e partecipano a diversi processi cellulari come la riparazione della membrana, controllo trascrizionale e rilevamento dei nutrienti; evidenziando il loro ruolo centralizzato nell'omeostasi cellulare (rivisto in rif. 13). Parecchi studi hanno indicato un'associazione tra una diminuzione età-dipendente nella funzione lisosomiale e vari disordini di neurodegenerative13. Coerentemente, ristabilimento della funzione lysosomal in cellule anziani può ritardare l'insorgenza di relazione con l'invecchiamento fenotipi14,15. Gli studi della composizione del milieu mancata suggeriscono che il collasso della funzione lysosomal in cellule anziani non è a causa di una riduzione della produzione di proteasi lisosomiali16. In alternativa, è stato proposto che perdita di acidità intralysosomal, un requisito fondamentale della sua attività enzimatica, può essere alla base il calo di proteolisi lisosoma-mediata17. Per essere in grado di esplorare questa ipotesi, è essenziale sviluppare reagenti e protocolli per sondare i cambiamenti dinamici nel pH lisosomiale in cellule vive in maniera coerenza e replicabile.
L'intestino di c. elegans è il tessuto metabolico principale in viti senza fine ed è un regolatore critico dell'omeostasi sistemica e durata della vita. Abbiamo sviluppato saggi per valutare i cambiamenti dell'acidità del lume intestinali lisosomi di vermi per determinare come lisosoma-mediata proteolisi contribuisce all'invecchiamento. Anche se fluorofori pH sensibili sono stati usati precedentemente in c. elegans per contrassegnare i lisosomi intestinali, ci non è stato ancora uno sforzo per stabilire un protocollo di successo in grado di rilevare piccoli aumenti in pH lisosomiale in vivo18. Qui, forniamo un protocollo che può essere utilizzato per rilevare la perdita di acidità lisosomiale nelle cellule intestinali di c. elegans utilizzando un protocollo di alimentazione semplice e conveniente che incorpora un fluoroforo pH sensibili (cDCFDA) in OP50 cibo.

<table><tbody><tr><td>OP50 (&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td>Order online at https://cgc.umn.edu/strain/OP50</td></tr><tr><td>5(6)-carboxy-2&amp;rsquo;,7&amp;rsquo;-dichlorofluorescein diacetate&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>C369</td><td>Commonly known as cDCFDA</td></tr><tr><td>9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1&#039;H-2,2&#039;-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron</td><td>ThermoFisher</td><td>L7528</td><td>Commonly known as Lysotracker Red</td></tr><tr><td>Confocal microscope (e.g. Zeiss LSM 510)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Download for free from https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>LB Broth powder</td><td>ThermoFisher</td><td>22700041</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Sigma</td><td>A5306-1KG</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>S71604</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol powder</td><td>Sigma</td><td>C3045&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>449709</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>K3PO4</td><td>Sigma</td><td>P5629</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Cover Slips</td><td>ThermoFisher</td><td>3406</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A6013</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mirror or other smooth flat surface</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

assessing lysosomal alkalinization in the intestine of live caenorhabditis elegans

Il nematode Caenorhabditis elegans (c. elegans) è un sistema di modello che è ampiamente usato per studiare la longevità e le vie dello sviluppo. Tali studi sono facilitati dalla trasparenza dell'animale, la capacità di avanti e indietro le analisi genetiche, la relativa facilità di generare proteine fluorescente contrassegnati e l'uso di coloranti fluorescenti che possono sia essere microiniettati in anticipo embrione o incorporati in suo cibo (e. coli ceppo OP50) per etichettare gli organelli cellulari (ad es. 9-diethylamino-5h-benzo (a) phenoxazine-5-one e (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1)) methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN} - N - [2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Qui, presentiamo l'uso di un colorante fluorescente pH sensibili che macchie intestinali lisosomi, fornendo una lettura visiva dei cambiamenti dinamici, fisiologici acidità lisosomiale in vermi vivi. Questo protocollo non misurare pH lisosomiale, ma piuttosto mira a stabilire un metodo affidabile di valutazione fisiologiche varianti pertinenti lysosomal acidità. cDCFDA è un cellulare-permeante composto che viene convertito il fluoroforo fluorescente 5-(and-6)-carboxy-2',7'-dichlorofluorescein (cDCF) su idrolisi dalle esterasi intracellulari. Protonazione all'interno dei lisosomi trappole cDCF in questi organelli, dove si accumula. A causa del suo basso pKa di 4.8, questo colorante è stato utilizzato come un sensore di pH in lievito. Qui descriviamo l'uso di cDCFDA come integratore alimentare per valutare l'acidità dei lisosomi intestinali in elegans del c. Questa tecnica consente il rilevamento dei lisosomi alcalinizzante in animali vivi, e ha una vasta gamma di applicazioni sperimentali tra cui studi sull'invecchiamento, autophagy e biogenesi lisosomiale.

cDCFDA macchie lysosomes in maniera dipendente dal pH, e il suo basso pKa e pronto assorbimento lisosomi rende un sensore di pH ideale21. cDCFDA intensità di colorazione è inversamente proporzionale al pH lisosomiale (cioè colorazione intensità aumenta con il diminuire del pH)18,22. cDCFDA segnali sono costantemente deboli nei lisosomi di animali trattati con clorochina, un inibitore dell'acidi...

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Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Una guida dettagliata per sondare la perdita di acidità lysosomal nell'intestino di c. elegans usando il colorante vitale sensibili al pH 6 - carboxy - 2', 7'-diclorofluoresceina diacetato (cDCFDA)

Valutazione Lysosomal alcalinizzazione l' intestino di Live Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

5.9K Views.  University of Saskatchewan. Una guida dettagliata per sondare la perdita di acidità lysosomal nell'intestino di c. elegans usando il colorante vitale sensibili al pH 6 - carboxy - 2', 7'-diclorofluoresceina diacetato (cDCFDA)

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Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine whether there is an imbalance in age-related energy metabolism between mitochondrial oxidative phosphorylation and aerobic glycolysis. Here, we show the utilization of commercial colorimetric assay kits for lactate and pyruvate in the model organism C. elegans. Recently, the sensitivity and accuracy of the colorimetric/fluorimetric assay kits have been improved greatly by the research and development conducted by reagent manufacturers. The improved reagents have enabled the use of small-scale assays with a 96-well plate in C. elegans. In general, a fluorimetric assay is superior in sensitivity to a colorimetric assay; however, the colorimetric approach is more suitable for the use in common laboratories. Another important issue in these assays for quantitative determination is protein precipitation of homogenized C. elegans samples. In our protein precipitation method, common precipitants (e.g., trichloroacetic acid, perchloric acid and metaphosphoric acid) are used for sample preparation. A protein-free assay sample is prepared by directly adding cold precipitant (final concentration of 5%) during homogenization.

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe a modified small-scale extraction and colorimetric assays of lactate and pyruvate in the nematode C. elegans. When utilizing commercial assay kits, the technical development of their sensitivity and accuracy is important. Protein precipitation in extraction is the most critical step for the quantitative determination of intracellular metabolites.

Su piccola scala saggi colorimetrici di intracellulare lattato e piruvato nel Nematode Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Ricerca

Biochimica

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the lumen and basolateral membranes contacting each other and/or the extracellular matrix. How this distinctive membrane asymmetry is established and maintained during organ morphogenesis is still an unresolved question of cell biology. This protocol describes the C. elegans intestine as a&#160;model for the analysis of polarized membrane biogenesis during tube morphogenesis, with emphasis on apical membrane and lumen biogenesis. The C. elegans twenty-cell single-layered intestinal epithelium is arranged into a simple bilaterally symmetrical tube, permitting analysis on a single-cell level. Membrane polarization occurs concomitantly with polarized cell division and migration during early embryogenesis, but de novo polarized membrane biogenesis continues throughout larval growth, when cells no longer proliferate and move. The latter setting allows one to separate subcellular changes that simultaneously mediate these different polarizing processes, difficult to distinguish in most polarity models. Apical-, basolateral membrane-, junctional-, cytoskeletal- and endomembrane components can be labeled and tracked throughout development by GFP fusion proteins, or assessed by in situ antibody staining. Together with the organism&#39;s genetic versatility, the C. elegans intestine thus provides a unique in vivo model for the visual, developmental, and molecular genetic analysis of polarized membrane and tube biogenesis. The specific methods (all standard) described here include how to: label intestinal subcellular components by antibody staining; analyze genes involved in polarized membrane biogenesis by loss-of-function studies adapted to the typically essential tubulogenesis genes; assess polarity defects during different developmental stages; interpret phenotypes by epifluorescence, differential interference contrast (DIC) and confocal microscopy; quantify visual defects. This protocol can be adapted to analyze any of the often highly conserved molecules involved in epithelial polarity, membrane biogenesis, tube and lumen morphogenesis.

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analy

The transparent C. elegans intestine can serve as an "in vivo tissue chamber" for studying apicobasal membrane and lumen biogenesis at the single-cell and subcellular level during multicellular tubulogenesis. This protocol describes how to combine standard labeling, loss-of-function genetic/RNAi and microscopic approaches to dissect these processes on a molecular level.

Il c. elegans intestino come un modello per intercellulare Lumen morfogenesi e biogenesi di membrana polarizzata In Vivo a livello di singola cellula: etichettatura da macchiatura dell'anticorpo, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the ...

Biologia dello sviluppo

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

Biochimica e High Throughput valutazione microscopica di massa grassa in<em&gt; Caenorhabditis Elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

Biologia

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans

In living organisms, intestinal hyperpermeability is a serious symptom that leads to many inflammatory bowel diseases (IBDs). Caenorhabditis elegans is a nonmammalian animal model that is widely used as an assay system due to its short lifespan, transparency, cost-effectiveness, and lack of animal ethics issues. In this study, a method was developed to investigate the effects of different bacteria and 3,3'-diindolylmethane (DIM) on the intestinal permeability of C. elegans with a high-throughput image analysis system. The worms were infected with different gut bacteria or cotreated with DIM for 48 h and fed with fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran overnight. Then, the intestinal permeability was examined by comparing the fluorescence images and the fluorescence intensity inside the worm bodies. This method may also have the potential to identify probiotic and pathogenic intestinal bacteria that affect intestinal permeability in the animal model and is effective for examining the effects of harmful or health-promoting chemicals on intestinal permeability and intestinal health. However, this protocol also has some considerable limitations at the genetic level, especially for determining which genes are altered to control illness, because this method is mostly used for phenotypic determination. In addition, this method is limited to determining exactly which pathogenic substrates cause inflammation or increase the permeability of the worms' intestines during infection. Therefore, further in-depth studies, including investigation of the molecular genetic mechanism using mutant bacteria and nematodes as well as chemical component analysis of bacteria, are required to fully evaluate the function of bacteria and chemicals in determining intestinal permeability.

Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans

This protocol describes how to measure intestinal permeability of Caenorhabditis elegans. This method is helpful for basic biological research on intestinal health related to the interaction between intestinal bacteria and their host and for screening to identify probiotic and chemical agents to cure leaky gut syndrome and inflammatory bowel diseases.

Misurazione degli effetti di batteri e sostanze chimiche sulla permeabilità intestinale della caenorhabditis elegans

In living organisms, intestinal hyperpermeability is a serious symptom that leads to many inflammatory bowel diseases (IBDs). Caenorhabditis elegans is a ...

Medicina

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed orientation. Here we describe methods to label, image, and analyze the microtubule dynamics and growth during the development and regeneration of touch neurons in C. elegans. Using genetically encoded fluorescent reporters of microtubule tips, we imaged the axonal microtubules. The local changes in microtubule behavior that initiates axon regeneration following axotomy can be quantified using this protocol. This assay is adaptable to other neurons and genetic backgrounds to investigate the regulation of microtubule dynamics in various cellular processes.

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

A protocol for imaging the dynamic microtubules in vivo using fluorescently labeled End binding protein has been presented. We described the methods to label, image, and analyze the dynamic microtubules in the Posterior lateral microtubule (PLM) neuron of C. elegans.

In vivo Valutazione della dinamica e dell'orientamento dei microtubuli nei neuroni della caenorhabditis elegans

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed ...

Neuroscienze

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age are significant public health burdens. We currently understand little about the genetic regulation of muscle health with disease or age. The nematode C. elegans is an established model for understanding the genomic regulation of biological processes of interest. This worm&#8217;s body wall muscles display a large degree of homology with the muscles of higher metazoan species. Since C. elegans is a transparent organism, the localization of GFP to mitochondria and sarcomeres allows visualization of these structures in vivo. Similarly, feeding animals cationic dyes, which accumulate based on the existence of a mitochondrial membrane potential, allows the assessment of mitochondrial function in vivo. These methods, as well as assessment of muscle protein homeostasis, are combined with assessment of whole animal muscle function, in the form of movement assays, to allow correlation of sub-cellular defects with functional measures of muscle performance. Thus, C. elegans provides a powerful platform with which to assess the impact of mutations, gene knockdown, and/or chemical compounds upon muscle structure and function. Lastly, as GFP, cationic dyes, and movement assays are assessed non-invasively, prospective studies of muscle structure and function can be conducted across the whole life course and this at present cannot be easily investigated in vivo in any other organism.

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Skeletal muscle is essential for locomotion and is the bodies&#8217; main protein store. Muscle health measurements within C. elegans are described. Prospective changes to muscle structure and function are assessed using localized GFP and cationic dyes.

Metodi di valutazione subcellulari Compartimenti di muscoli in<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved in humans and are associated with metabolic syndrome or other diseases. Examination of lipid accumulation in this organism can be carried out by fixative dyes or label-free methods. Fixative stains like Nile red and oil red O are inexpensive, reliable ways to quantitatively measure lipid levels and to qualitatively observe lipid distribution across tissues, respectively. Moreover, these stains allow for high-throughput screening of various lipid metabolism genes and pathways. Additionally, their hydrophobic nature facilitates lipid solubility, reduces interaction with surrounding tissues, and prevents dissociation into the solvent. Though these methods are effective at examining general lipid content, they do not provide detailed information about the chemical composition and diversity of lipid deposits. For these purposes, label-free methods such as GC-MS and CARS microscopy are better suited, their costs notwithstanding.

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Nile red staining of fixed Caenorhabditis elegans is a method for quantitative measurement of neutral lipid deposits, while oil red O staining facilitates qualitative assessment of lipid distribution among tissues.

Quantificazione dell'abbondanza del lipido e valutazione della distribuzione del lipido in Caenorhabditis elegans Nilo rosso e macchie di olio rosso O

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits obesity and many associated diseases including cardiovascular disorders, type II diabetes, and cancer. To advance the current understanding of lipid metabolic regulation, quantitative methods to precisely measure in vivo lipid storage levels in time and space have become increasingly important and useful. Traditional approaches to analyze lipid storage are semi-quantitative for microscopic assessment or lacking spatio-temporal information for biochemical measurement. Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology that enables rapid and quantitative detection of lipids in live cells with a subcellular resolution. As the contrast is exploited from intrinsic molecular vibrations, SRS microscopy also permits four-dimensional tracking of lipids in live animals. In the last decade, SRS microscopy has been widely used for small molecule imaging in biomedical research and overcome the major limitations of conventional fluorescent staining and lipid extraction methods. In the laboratory, we have combined SRS microscopy with the genetic and biochemical tools available to the powerful model organism, Caenorhabditis elegans, to investigate the distribution and heterogeneity of lipid droplets across different cells and tissues and ultimately to discover novel conserved signaling pathways that modulate lipid metabolism. Here, we present the working principles and the detailed setup of the SRS microscope and provide methods for its use in quantifying lipid storage at distinct developmental timepoints of wild-type and insulin signaling deficient mutant C. elegans.

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows selective, label-free imaging of specific chemical moieties and it has been effectively employed to image lipid molecules in vivo. Here, we provide a brief introduction to the principle of SRS microscopy and describe methods for its use in imaging lipid storage in Caenorhabditis elegans.

Imaging privo di etichette delle dinamiche di conservazione lipidica negli elegani di caenorhabditis utilizzando la microscopia a dispersione Raman stimolata

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits ...

<meta charset="utf8"></head><body>Valutazione del metabolismo e del modello di invecchiamento in Caenorhabditis elegans

Using Low-Cost Dyes to Visualize Glycogen Accumulation and Gut Integrity in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a transparent, non-parasitic nematode with a simple biology, which makes it a great tool for biological sciences teaching through the staining of the cells or their molecular content. Lugol dye (iodine-potassium iodide solution) has been widely used in biochemistry to stain glycogen stores. In this context, it is possible to observe differences between fed and starved animals, besides the effects of different conditions, such as different diets and oxygen levels. Erioglaucine is a blue dye that indicates the loss of the intestinal barrier. When the intestinal barrier is intact, the blue dye stains inside the lumen; however, when this integrity is disrupted, the dye leaks into the body cavity. Using a stereomicroscope or a microscope, teachers can demonstrate physiological and biochemical alterations, or they can instigate students to ask a scientific question and hypothesize and test their hypothesis using these assays. The present protocol describes two staining techniques in C. elegans that can be easily carried out by students.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Esplorazione dei processi metabolici e di invecchiamento in C. elegans utilizzando saggi a basso costo e ad alto impatto

Teaching biological sciences can be made more stimulating for students through the use of experimentation. This manuscript presents two different yet complementary protocols that can be utilized in the classroom to encourage students to formulate and test hypotheses related to high-calorie diets, starvation, and aging.

Utilizzo di coloranti a basso costo per visualizzare l'accumulo di glicogeno e l'integrità intestinale in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a transparent, non-parasitic nematode with a simple biology, which makes it a great tool for biological sciences ...

Valutazione Lysosomal alcalinizzazione l' intestino di Live Caenorhabditis elegans

Riepilogo

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Su piccola scala saggi colorimetrici di intracellulare lattato e piruvato nel Nematode Caenorhabditis elegans

Il c. elegans intestino come un modello per intercellulare Lumen morfogenesi e biogenesi di membrana polarizzata In Vivo a livello di singola cellula: etichettatura da macchiatura dell'anticorpo, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging

Biochimica e High Throughput valutazione microscopica di massa grassa in

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Misurazione degli effetti di batteri e sostanze chimiche sulla permeabilità intestinale della caenorhabditis elegans

In vivo Valutazione della dinamica e dell'orientamento dei microtubuli nei neuroni della caenorhabditis elegans

Metodi di valutazione subcellulari Compartimenti di muscoli in

Quantificazione dell'abbondanza del lipido e valutazione della distribuzione del lipido in Caenorhabditis elegans Nilo rosso e macchie di olio rosso O

Imaging privo di etichette delle dinamiche di conservazione lipidica negli elegani di caenorhabditis utilizzando la microscopia a dispersione Raman stimolata

Utilizzo di coloranti a basso costo per visualizzare l'accumulo di glicogeno e l'integrità intestinale in Caenorhabditis elegans