In questo protocollo dimostriamo come utilizzare un metodo di vita libera c. elegans per chiarire la patogenicità causata dal perossido di idrogeno prodotto tramite gli streptococchi del Gruppo Mitis. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo studiare la patogenicità e l'attivazione delle risposte allo stress nel verme utilizzando una fonte biologica sostenibile di specie reattive dell'ossigeno rispetto alle fonti chimiche Per un litro di media aggiungere 30g di polvere di Todd Hewitt, 2 g di estratto di lievito e 20g di ager a un pallone Erlin Myer da 2 litri.
Aggiungere 970 ml di acqua deionizzata al contenuto del pallone e mettere in una barra di agitazione. Utilizzare un foglio di alluminio per coprire l'apertura. Autoclave del supporto nel pallone a una temperatura di 121 gradi Celsius e pressione di 15 libbre per pollice quadrato per 30 minuti.
Successivamente impostare il pallone su una piastra di agitazione per raffreddare con delicata agitazione. Sotto un cappuccio laminare, versare il supporto in piastre di Petri sterili di dimensioni appropriata. Lasciare asciugare il supporto per 2 ore.
Successivamente conservare le piastre a 4 gradi Celsius per un massimo di 1 mese. Prima della preparazione degli streptococchi del Gruppo Mitis, riscaldare le piastre di agar THY in un'incubatrice a 37 gradi Celsius. Dopo di che utilizzare un ciclo sterile per strisciare i ceppi desiderati di strepticocci sui luoghi.
Quindi mettere i piatti in un barattolo di candele e incubare il barattolo a 37 gradi Celsius durante la notte per circa 18 ore per fornire un ambiente microerofilo. Il giorno dopo, rimuovere i piatti dal barattolo delle candele e utilizzare un anello sterile per raccogliere colonie isolate. Inoculare 15 ml di tubi conici sterili contenenti 2 ml di brodo THY.
Chiudere i tappi stretti e incubare i tubi a 37 gradi Celsius in condizioni statiche. Le piastre THY pre-calde in un'incubatrice a 37 gradi Celsius aggiungono 50 microlitri di soluzione contenenti 1000 unità di catalasi sulla piastra THY. Utilizzare uno spargitore sterile per stendere la soluzione di catalasi e lasciare asciugare le piastre sulla cappa di flusso laminare per 30 minuti.
Per seminare le piastre con i ceppi di streptococco, utilizzare una pipetta per aggiungere 80 microlitri di colture coltivate durante la notte al piatto e utilizzare uno spargitore sterile per diffondere completamente i batteri sulla superficie dell'agar. Incubare i piatti a 37 gradi Celsius in un barattolo di candele durante la notte. Come controllo, su due piastre NGM, aggiungere 80 microlitri di colture coltivate durante la notte di E.coli OP-50 per la semina.
Incubare le piastre a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, rimuovere le piastre dal barattolo delle candele e lasciare raffreddare le piastre a temperatura ambiente. Utilizzando un piccone di vermi sterile, trasferire 30 larve L4 dalle piastre di alimentazione NGM alle piastre THY sementi di streptococco.
Incubare le piastre a 25 gradi Celsius. Al microscopio sezionato, contare il numero di larve L4 vive e morte su ogni piatto in diversi punti di tempo. Utilizzare il piccone del verme sterile per pungere delicatamente i vermi e determinare se sono morti o vivi.
Inizialmente, segna i vermi come morti o vivi ogni 30 minuti. Quando i vermi iniziano rapidamente a morire, segnali a intervalli di 15 minuti. Il test richiederà da 5 a 6 ore per essere completato.
Dopodi tempo, ripeti l'esperimento altre due volte. Per preparare il tampone di agarosio, attaccare il labtape longitudinalmente lungo due scivoli di vetro. Questo determinerà lo spessore dei cuscinetti di agarosio.
Posizionare uno scivolo di vetro pulito tra le due diapositive nastrate. Sciogliere l'agarosio in acqua deionizzata per fare il 2 per cento del volume di peso e riscaldare la soluzione in un forno a microonde. Utilizzare una pipetta per posizionare 100 microlitri di agarosio fuso al centro dello scivolo pulito.
Posizionare immediatamente un altro scivolo di vetro pulito sopra l'agarosio fuso e premere delicatamente verso il basso per fare un tampone. Lasciare solidificare l'agarosio e successivamente rimuovere la diapositiva superiore. Il tampone di agarosio è pronto per l'uso.
Pre-riscaldare i tuoi piatti a 37 gradi Celsius. Seminare le piastre con ceppi di streptococco come fatto in precedenza nei test di sopravvivenza. Seme 3 piastre NGM con E-coli OP-50 come controllo e incubare a 37 gradi Celsius durante la notte.
Il giorno dopo, raffreddare i piatti a temperatura ambiente. Utilizzare il tampone M9W per lavare le larve L4 dalle piastre di alimentazione NGM o NGM RNAi in tubi conici da 15 ml. Ruotare i tubi a 450 volte g, per un minuto in una centrifuga.
Decantare il supernatante e aggiungere 10 ml di M9W ad ogni tubo. Ripetere il passo centrifugo altre tre volte. Sospendere di nuovo i vermi in 250 microlitri di M9W e posizionare tre gocce da 5 microlitri della sospensione del verme su un coperchio della piastra di Petri pulito.
Al microscopio sezionato, stimare il numero di vermi per microlitro. Utilizzando una pipetta, aggiungere circa 100 larve L4 ad ogni piastre sementi di STREPTOCOCCUS THY e piastre sementi NGM E.coli. Utilizzare tre piastre per ceppo di batteri.
Incubare le piastre per 2-3 ore a 25 gradi Celsius. Successivamente, rimuovere le piastre dall'incubatore. Lavarli con M9W e raccogliere i vermi in tubi conici da 15 ml.
Lavare i vermi tre volte come fatto in precedenza nella fase centrifuga. Rimuovere la maggior parte dell'M9W per aspirazione. E aggiungere 500 microlitri di M9W contenenti 2 azide di sodio millimolare o cloridrato di tetramisolo al pellet di verme per l'anestesia.
Incubare il tubo con pellet di verme a temperatura ambiente per 15 minuti. Quindi, lascia cadere 15 microlitri della sospensione del verme su un tampone di agorose preparato. Al microscopio fluorescente, visualizza la localizzazione dello skn-1 utilizzando filtri Fitzy e Dappy.
Vermi immagine a 10 volte e 20 volte gli ingrandimenti. Segnare i vermi in base a tre livelli di localizzazione;bassa localizzazione, dove non si osserva localizzazione nucleare, localizzazione media, con SKN 1 BCGFP nella parte anteriore o posteriore del verme e elevata localizzazione, dove si osserva la localizzazione nucleare di SKN-1 BCGFP in tutte le cellule intestinali. In questo esperimento, i membri del Gruppo Mitis uccisero rapidamente i vermi, al contrario di S.mutans, S.salivarius e E.coli OP-50 non patogeno.
Quando la catalasi fu integrata al THY ager, l'uccisione dei vermi fu abolita. La morte dei vermi non è stata osservata sul ceppo mutante delta spxB rispetto ai ceppi di wild-type e complimenti. Questi dati suggeriscono che il perossido di idrogeno prodotto dal Gruppo Mitis media l'uccisione dei vermi.
Una significativa diminuzione della sopravvivenza dei vermi knockdown skn-1 è stata osservata rispetto ai vermi trattati con controllo vettoriale. Un fenotipo di uccisione simile è stato osservato con il ceppo mutante skn-1 e i vermi di tipo selvatico N2. Ciò dimostra che lo skn-1 influenza la sopravvivenza dei vermi sul gruppo Mitis.
La localizzazione dello skn-1 BCGFP è stata osservata nei vermi esposti ai ceppi di N-complimento di tipo selvatico e non in risposta al ceppo mutante Delta spxB delle cordone S. Dopo che i componenti della via della chinasi cartografica P38 sono stati abbattuti, è stata osservata una ridotta localizzazione di SKN-1 BCGFP e vermi trattati con abbattimento, rispetto ai vermi trattati con controllo vettoriale. Utilizzando gli streptococchi c.
sistema elegans, gli effetti del perossido di idrogeno sullo stress verticolare endoplasmatico, sui danni mitocondriali, sulla mitofogia e sulla tophogy possono essere ulteriormente studiati. Inoltre, possono essere identificati meccanismi attraverso i quali il perossido di idrogeno agisce come fattore di virilescenza per suscitare risposte immunitarie interrompendo i processi core della cellula.
