Questo metodo fornisce uno strumento per gli scienziati per studiare i fattori genetici ambientali che influenzano la migrazione e il comportamento degli spermatozoi nei loro ambienti nativi all'interno del tratto riproduttivo femminile. Il principale vantaggio di questa tecnica deriva dall'epidermide trasparente dei C.elegans, che consente agli sperimentatori di visualizzare e registrare facilmente il movimento dello sperma negli animali vivi. Per iniziare, utilizzare un piccone di verme fatto da una pipetta Pasteur e filo di platino appiattito su un'estremità per raccogliere ermafroditi da 20 a 30 L4 e posizionarli delicatamente su una piastra NGM semisetta di sei centimetri.
Incubare gli ermafroditi a 20 gradi Celsius per 28-30 ore. Quindi, fai un piatto di colorazione maschile. Utilizzare l'estremità di un'asta di agitazione del vetro per raschiare E.coli dal prato batterica di una piastra seminata e depositarla al centro di una piastra NGM non sedotta, facendo un punto alimentare di diametro da cinque a sette millimetri.
Mescolare due microlitri di mito-colorante millimolare in DMSO e 10 microlitri di tampone M9 in un tubo di microcentrifugo. Pipettare tutta la soluzione mito-colorante sul punto alimentare sul piatto di colorazione maschile. Posizionare la piastra al buio per asciugare per 30 minuti.
Al microscopio, su un piatto contenente C.elegans adulti di uno o tre giorni, identifica i maschi con la loro coda a forma di ventaglio. Scegli circa 100 maschi per il punto alimentare macchiato di mito-colorante sul piatto di colorazione maschile. Avvolgere la piastra in un foglio di alluminio e incubare durante la notte a 16 gradi Celsius.
Il secondo giorno, trasferisci i maschi macchiati su una nuova piastra NGM seminata per pulire i batteri macchiati di mito-colorante in eccesso. Tenere il piatto al buio fino all'accoppiamento. Per realizzare una piastra di accoppiamento, su una piastra NGM non semiseed, gocciolare due microlitri di miscela E.coli spessa.
Attendere circa 10-15 minuti affinché i batteri spessi si asciughino per formare un punto di accoppiamento. In attesa che la piastra di accoppiamento si asciughi, mescolare 300 microlitri di peso dell'1% in tricaina di volume, 300 microlitri dello 0,1% di peso in volume tetramisolo e 900 microlitri di M9. Trasferire 600 microlitri della soluzione tetramisolo/tricaina in un vetro da orologio. Trasferire da 12 a 15 ermafroditi raccolti il primo giorno nella soluzione di tetramisolo / tricaina sul vetro dell'orologio.
Posizionare la metà inferiore di una piastra di Petri sopra il vetro dell'orologio per tenerlo coperto dall'evaporazione e incubare per 30 minuti per immobilizzare gli ermafroditi. Quindi, recupera la piastra NGM seminata che contiene i maschi macchiati dal buio e raccogli da 50 a 60 maschi macchiati sul punto di accoppiamento essiccato sulla piastra di accoppiamento. Conservare il piatto al buio.
Dopo che gli ermafroditi sono stati immobilizzati, usa una pipetta Pasteur in vetro per raccogliere gli ermafroditi immobilizzati dal vetro dell'orologio. Evitare di succhiare gli ermafroditi oltre la parte stretta della pipetta. Trasferire gli ermafroditi su una piastra NGM non sedotta.
Rimuovere il più liquido possibile e lasciare asciugare il liquido in eccesso. Non appena tutto il liquido visibile è evaporato, trasferire gli ermafroditi anestetizzati sul punto di accoppiamento con i maschi macchiati. Incubare al buio per 30 minuti per consentire l'accoppiamento.
Se si desidera una valutazione della distribuzione dello sperma, trasferire gli ermafroditi accoppiati su una piastra NGM seminata e consentire loro di riposare per un'ora prima del montaggio per la visualizzazione. Per montare i vermi per la visualizzazione, prima gocciolare da 10 a 15 microlitri della soluzione di tetramisolo/tricaina sul pad 2%agarosio preparato e trasferire gli ermafroditi accoppiati nella soluzione sul pad. Posizionare un coverslip sopra i vermi.
Montare lo scivolo su un microscopio verticale dotato di epifluorescenza e posizionare il verme in modo che sia la vulva che uno spermatheca siano in vista. Focalizzare l'immagine concentrandosi sul centro della spermatheca. Controllare l'esposizione sia per i canali DIC che TRITC.
In DIC, le strutture interne dei vermi sono chiaramente visibili. In TRITC, i singoli spermatozoi sono visibili come puncta distinti. Acquisire immagini DIC e fluorescenza per ogni utero.
Per catturare video time-lapse, individua prima gli ermafroditi che contengono sperma etichettato all'interno dell'utero. Nel pannello Acquisizione, regolate gli intervalli di acquisizione dell'immagine da 15 a 30 secondi e la durata a 10-20 minuti per utero. Quindi, fare clic su Esegui per acquisire immagini time-lapse nei canali DIC e TRITC.
A partire dalla vulva da un lato e dalla spermateca dall'altro, dividere l'utero in tre zone, con zona contenente la vulva e la zona tre contenente la spermatheca. Contare manualmente il numero di spermatozoi all'interno di ogni terzo dell'utero e segnalare il numero in ogni zona come percentuale dello sperma totale nell'intero utero. Se necessario, utilizzare la tabella di ricerca per regolare l'intensità del segnale delle immagini del canale TRITC in modo che ogni sperma possa essere visibile e quantificato.
Per tenere traccia dello sperma nelle immagini time-lapse, utilizzare il software Fiji per l'analisi. Utilizzare la funzione Importazione biosi formati per importare le immagini da una serie time-lapse come un unico hyperstack. Quindi, fare clic su Plugin, Tracciamento e quindi Tracciamento manuale.
Nella finestra di dialogo aperta, selezionate lo strumento TrackMate sulla barra degli strumenti Fiji. Fai doppio clic sullo sperma che verrà monitorato. Fare clic all'interno del cerchio verde apparso con linee tratteggiate e trascinare nella posizione desiderata.
Clicca di nuovo sul cerchio. La linea verde tratteggiata si trasforma in una solida linea verde. Premi contemporaneamente i tasti Shift e L per attivare la modalità di tracciamento.
Passare al fotogramma successivo della serie time-lapse. Per impostare la nuova posizione dello sperma tracciato nel nuovo fotogramma, posizionare il mouse sul nuovo punto e premere il tasto A. Il tracker viene visualizzato nella nuova posizione e viene visualizzata una linea, che collega la posizione in cui il tracker è stato posizionato nel fotogramma precedente.
Ripetere la stessa procedura per il resto dei fotogrammi. Una volta completate le tracce, fate clic su Analizza (Analyze) nella finestra di dialogo TrackMate per generare i dati necessari. Per calcolare la velocità, dividere la lunghezza totale del percorso dello sperma per il tempo trascorso.
Per calcolare la velocità vettoriale, tracciare una linea attraverso l'utero partendo dalla vulva, indicando verso la spermatheca. Utilizzare lo strumento Linea per misurare la distanza di migrazione dello sperma lungo questa linea dall'inizio alla fine della traccia. Dividere questa distanza per il tempo trascorso.
I valori negativi indicano che lo sperma è migrato lontano dalla spermatheca. Per registrare la frequenza di inversione, contare il numero di volte durante le quali la traccia dello sperma ha generato un angolo inferiore a 90 gradi durante tre fotogrammi consecutivi time-lapse. In questo protocollo, i vermi maschi fog-2 q71 erano macchiati di mito-colorante e accoppiati a ermafroditi N2 di tipo selvaggio.
Il tratto riproduttivo dell'ermafrodita adulta ha due braccia che sono immagini speculari l'una dell'altra. Dopo l'accoppiamento, lo sperma etichettato viene depositato nell'utero di ermafrodite attraverso la vulva. Lo sperma si muove intorno agli embrioni in via di sviluppo all'interno dell'utero, verso la spermateca, dove vengono conservati fino alla fecondazione.
L'utero dell'ermafrodite è stato diviso in tre zone per quantificare la distribuzione e la migrazione degli spermatozoi. Per valutare la velocità dello sperma e la frequenza di inversione, solo lo sperma nella seconda zona è stato monitorato attraverso immagini time-lapse. Lo sperma nella prima zona, a partire dalla vulva, e la zona tre, compresa la spermateca, tendono a muoversi in un modello circolare.
Lo sperma segnato dai punti rossi e blu aveva la velocità dello sperma e la frequenza di inversione quantificate. Quando si quantifica la distribuzione dello sperma nell'utero, una corretta guida dello sperma utilizzando ermafroditi N2 di tipo selvatico e maschi di nebbia-2 q71 ha portato circa il 90% dello sperma etichettato a raggiungere la spermatheca. I dati non devono essere conteggiati se l'accoppiamento provoca troppo poco sperma nell'utero o troppi spermatozoi nell'utero, riempiendo ogni fessura.
È importante che gli animali siano maneggiati delicatamente durante ogni fase di trasferimento, che gli ermafroditi siano completamente immobilizzati e che le placche e i vermi contenenti il mio-colorante siano schermati dalla luce. Questo metodo può essere combinato con esperimenti gene knockdown o knockout, esperimenti di esposizione ambientale o chimica o altre manipolazioni per identificare fattori che possono regolare la migrazione degli spermatozoi. Questa tecnica ci ha permesso di identificare prostaglandine specifiche che sono importanti per guidare lo sperma verso l'ovocita.
Queste prostaglandine sono sintetizzati attraverso un meccanismo non convenzionale che può essere conservato nei mammiferi superiori. Tetramisole, tricaina, DMSO sono irritanti per la pelle e gli occhi e possono avere effetti tossici a dosi elevate. È importante indossare l'attrezzatura protettiva appropriata quando si maneggiano sostanze chimiche.
