Questo protocollo dimostra visivamente come istituire un sistema di coltura affidabile e a lungo termine per la tunicata pelagica marina Oikopleura dioica. Il sistema di coltura di Oikopleura fornisce le risorse di base per indagare una vasta gamma di campi biologici relativi all'ecologia, allo sviluppo, alla genomica e all'evoluzione. Questa specie ha un breve ciclo di vita, un'alta fecondità e può essere facilmente raccolta dalla riva, rendendola un eccellente organismo modello.
Sebbene questo protocollo sia ottimizzato per O.dioica, speriamo che possa essere applicato ad altri organismi planctonici. Per iniziare, inizia il cibo di alghe per sostenere la cultura di Oikopleura, a partire dall'autoclave dell'acqua di mare filtrata. Per avviare una coltura stock di Chaetoceros calcitrans, 60 mils di acqua di mare autoclavata sono stati integrati con i seguenti:30 microlitri di vitamine, 30 microlitri della soluzione A, 15 microlitri di silicato di sodio e 60 microlitri di streptomicina.
Infine, 30 microlitri di C.calcitrans di una precedente coltura stock sono stati aggiunti come inoculanti. Fare riferimento alla tabella due del manoscritto per quanto riguarda i volumi di integrazione e inoculazione per le altre specie di alghe e tipi di coltura. Dopo l'inoculazione, lo stock e le sottoculture vengono mantenuti in un incubatore a 17 gradi Celsius con illuminazione continua.
Dopo circa 10 giorni, la crescita delle alghe è confermata dal colore dei contenitori. In questo caso, spostare le colture stock in uno stoccaggio a lungo termine a quattro gradi Celsius per un massimo di un mese mantenendo la sottocultura nello stesso incubatore. Per creare una cultura di lavoro, aggiungere i supplementi necessari a 400 mils di acqua di mare autoclavata e inoculare con 100 mils della sottocultura precedente.
Sigillare il pallone con un cappuccio di gomma, inserire una pipetta monouso da un milione e spostarli in una stazione di alghe e mantenerli a temperatura ambiente con un fotoperiodo di otto ore e un'aerazione costante. Ruotare manualmente le colture di alghe due volte al giorno per evitare l'aggregazione nella parte inferiore del pallone. Una volta stabilite le colture di alghe, raccogliere campioni di campo in un sito locale.
Lanciare una rete di plancton e permettere all'estremità del merluzzo di affondare da uno a due metri sotto la superficie. Trainare la rete ad una velocità di circa 5-1 metri al secondo. Continuare a trainare avanti e indietro per due o cinque minuti.
Il tempo di traino dovrebbe essere regolato in base all'abbondanza di plancton in loco. Dopo il traino, sollevare con cura la rete e trasferire lentamente il contenuto dell'estremità del merluzzo in una bottiglia di vetro da 500 mil. Riempire la bottiglia sul bordo per evitare bolle d'aria che potrebbero causare stress agli animali durante il trasporto.
In questa fase, la presenza di Oikopleura può essere confermata visualizzando le bottiglie campione su uno sfondo scuro. Tuttavia, è necessaria un'osservazione microscopica per l'identificazione a livello di specie. Ripetere questo processo fino a quando non sono state raccolte tre bottiglie da 500 mil.
Raccogli l'acqua di mare di superficie per registrare la salinità, la temperatura e la concentrazione di clorofilla con un profiler CTD. Inoltre, raccogli da 10 a 15 litri di acqua di mare in loco per aiutare ad acclimatare gli animali alle condizioni di laboratorio. Per acclimatare gli animali, preparare un rapporto uno-a-uno di acqua di mare di superficie dal sito campione e acqua di mare filtrata mantenuta in laboratorio.
Il volume finale deve essere regolato tra i cinque e i 10 litri, a seconda della concentrazione del campione di plancton. Aggiungere con cura il campione da 500 mil al becher preparato. Utilizzando una pagaia attaccata a un motore sincrono che ruota a 15 giri/min, mantenere il plancton in sospensione durante la notte.
La mattina seguente, controlla la presenza di Oikopleura a occhio. Trasferire gli animali in una piastra di Petri e osservare sotto un microscopio a campo scuro impostato tra 20 e 40 volte per un'identificazione positiva. Gli Oikopleura sono caratterizzati come animali a forma di girino che ondulato la coda all'interno di una casa traslucida.
Per confermare O.dioica, cerca maschi completamente maturi con gonadi gialle o femmine con uova. Se gli animali sono immaturi, cercare la presenza di due cellule subcordonali nella metà distale della coda. Questi sono presenti sia negli animali maturi che in quello immaturo.
Una volta confermata la specie, trasferirli in una nuova piastra di Petri. Ripeti questo processo fino a quando 10-20 individui sono stati confermati a livello di specie. Se non viene trovata alcuna O.dioica, mantenere il becher mescolando per un giorno o due in più.
I piccoli O.dioica che inizialmente non erano osservabili continueranno a crescere e diventeranno più facili da vedere. Se dopo una settimana non viene visualizzato nessuno, scartare il campione e riprovare a campionarlo. Per stabilire una monocoltura, isolare 120 O.dioica da un campione di campo in cinque litri di acqua di mare filtrata.
La mattina seguente, cerca i maschi completamente maturi identificati dalle gonadi gialle e le femmine con uova che appaiono come sfere luccicanti e dorate. Preparare un becher di deposizione delle uova trasferendo delicatamente 15 maschi e 30 femmine con una pipetta da cinque mil e smussata su un becher contenente 2,5 litri di acqua di mare filtrata. Per ridurre al minimo lo stress fisico durante il trasferimento manuale, rilasciare lentamente gli animali sotto la superficie della nuova acqua di mare.
Consentire agli adulti isolati di deporre le uova in modo naturale. Dopo la deposizione delle uova, la fecondazione riuscita può essere confermata estraendo da cinque a 10 mils di acqua di mare dal fondo del becher di deposizione delle uova e identificando le uova con scollatura al microscopio. La prima mattina dopo la deposizione delle uova, primo giorno, una nuova generazione di giovani animali con case gonfiate dovrebbe apparire nel becher.
Utilizzare un becher portatile da 500 mil per trasferire delicatamente gli animali in un nuovo bicchiere contenente 7,5 litri di acqua di mare fresca e filtrata. Versare lentamente il contenuto in superficie per ridurre al minimo le turbolenze e le forze di taglio. La seconda mattina dopo la deposizione delle uova, secondo giorno, trasferire manualmente 150 animali su un nuovo becher contenente cinque litri di acqua di mare fresca e filtrata.
Il terzo giorno dopo la deposizione delle uova, terzo giorno, trasferire manualmente 120 animali in un nuovo becher con cinque litri di acqua di mare fresca e filtrata. Entro il quarto giorno, gli animali adulti sessualmente maturi dovrebbero essere presenti. Raccogli 15 maschi e 30 femmine per un nuovo becher di deposizione delle uova con 2,5 litri di acqua di mare filtrata per iniziare la prossima generazione.
Questo processo viene ripetuto e mantenuto per la vita della cultura. Al fine di mantenere una monocoltura di O.dioica, il cibo di alghe viene preparato quotidianamente dalle culture lavorative. Gli animali vengono nutriti tre volte al giorno.
Preparare il cibo quotidiano misurando l'assorbanza della coltura di lavoro utilizzando uno spettrofotometro fissato a 660 nanometri. I valori di assorbanza, i volumi di coltura O.dioica target e la maturità animale sono inseriti in un foglio di calcolo preparato basato su una curva di crescita delle alghe precedentemente determinata per calcolare il volume esatto di alghe richiesto per l'alimentazione del giorno. Pipettare i volumi calcolati in tubi da 50 mil e centrifugare a 5.000 g per cinque minuti a temperatura ambiente.
Versare lentamente il supernatante e pipettare con cura su e giù per rimescolare le alghe pellettate. Riempire i tubi al loro volume originale con acqua di mare fresca e filtrata. In base al grafico giornaliero di alimentazione delle alghe dal foglio di calcolo, alimentare la quantità specificata per ogni becher alle 9 .m.
12 p.m. e 17 p.m. Una pompa di dosing automatizzata può essere impostata per nutrire gli animali a 5 p.m.
nei fine settimana senza la presenza di personale di ristrutturazione. Dopo ogni alimentazione, mantenere il cibo di alghe preparato a quattro gradi Celsius fino a quando non è pronto per essere utilizzato per il mangime successivo. O.dioica può essere raccolta da un porto con il delicato traino di una rete di plancton modificata dotata di rete da 100 micron e di un sacco non filtrante.
Il campionamento tra il 2015 e il 19 ha mostrato variazioni stagionali nella presenza di O.dioica nei porti di Okinawa. La temperatura superficiale dell'acqua di mare sembrava influenzare la presenza degli animali. O.dioica dominava quando la temperatura superficiale dell'acqua di mare era di 28 gradi o superiore.
O.dioica coesiste con Oikopleura longicauda a temperature comprese tra 24 e 27 gradi. Tuttavia, O.longicauda dominò a temperature inferiori ai 23 gradi. I cambiamenti di salinità non erano correlati con l'abbondanza di O.dioica.
I tre fattori più importanti per stabilire sistemi stabili di coltura O.dioica sono il mantenimento di un'elevata qualità dell'acqua con un sistema di filtrazione in più step, identificando un regime di alimentazione ottimale, preferibilmente creando curve standard di alghe e la preparazione di becher di deposizione delle uova con un numero sufficiente di maschi e femmine. Seguendo il protocollo fornito, il ciclo di vita di O.dioica è di quattro giorni a 23 gradi. Abbiamo stabilito in modo affidabile sei popolazioni indipendenti di O.dioica, tutte durate più di 20 generazioni.
In conclusione, stabilire una cultura stabile dell'O.dioica può essere fatto in modo rapido ed economico. Con una configurazione corretta, una cultura stabile può essere raggiunta entro una settimana. In combinazione con il suo piccolo genoma e il rapido ciclo di vita, questo rende O.dioica una potente specie modello cordata.
O.dioica può essere mantenuto sia in acqua di mare artificiale che naturale. Lo stoccaggio a lungo termine di cibo algale è possibile utilizzando coltura solida e crioconservazione. Inoltre, lo sperma O.dioica può anche essere crioconservato e rimanere vitale per più di un anno.
O.dioica continua a fornire potenti intuizioni su vari campi biologici. La comprensione della stagionalità locale, un meticoloso sistema culturale e alcuni individui dedicati consentono di stabilire una cultura efficace con poco sforzo.
