Le sinapsi sono gli elementi funzionali dei neuroni e i loro difetti o perdite sono alla base di diversi disturbi neurodegenerativi e neurologici. Gli studi di imaging sono ampiamente utilizzati per indagare la loro funzione e plasticità in condizioni fisiologiche e patologiche. A causa delle loro dimensioni e struttura, gli studi di localizzazione delle proteine richiedono tecniche di imaging ad alta risoluzione.
In questo protocollo, descriviamo una procedura per studiare nei neuroni primari la co-localizzazione delle proteine bersaglio con marcatori sinaptici a livello di super-risoluzione usando la microscopia ad illuminazione strutturata. La SIM è una tecnica di illuminazione della luce a motivi geometrici che raddoppia la risoluzione spaziale della microscopia a campo largo, raggiungendo un dettaglio di circa 100 nanometri. Il protocollo indica i controlli e le impostazioni necessari per robusti studi di co-localizzazione e una panoramica dei metodi statistici per analizzare correttamente i dati di imaging.
La chiave per consentire l'analisi a livello di super-risoluzione sono, tuttavia, i reagenti utilizzati durante l'acquisizione, come le coverlip a camera e le soluzioni di montaggio compatibili con l'indice di diffrazione dell'obiettivo. Per ottenere un neurone primario ippocampale del topo, isolare gli ippocampi dai cuccioli P1 a P4. Celle a piastre a 70.000 cellule per pozzo in un volume di 200 microlitri per pozzo.
Attendere fino a quando i neuroni primari ippocampali sono completamente maturi da 12 a 14 giorni dopo la placcatura per eseguire studi di co-localizzazione. Aggiungere il 4% di paraformaldeide, PFA, nei microlitri PBS 200 per pozzo ai neuroni per risolverli rapidamente. Rimuovere la soluzione e incubare i campioni con albumina siere bovina all'1%, BSA, in PBS a 200 microlitri per pozzo per un'ora a temperatura ambiente per coprire passivamente tutte le superfici free-binding della piastra con una proteina irrilevante per l'analisi.
Un buffer di blocco basato su BSA senza Triton X-100 riduce lo sfondo dell'anticorpo in modo più efficiente rispetto allo stesso buffer con lo 0,2%Triton X-100. Aggiungere l'anticorpo primario. Come controllo negativo, non aggiungere anticorpi primari a uno dei pozzi.
Montare celle utilizzando un montante compatibile con SIM, ad esempio ProLong Glass Antifade Mountant. Coprire e proteggere le celle con un coverglass, ad esempio un coverglass rotondo con un diametro di otto millimetri.
Possono essere utilizzati anche quelli quadrati. Conservare le copertine a camera a temperatura ambiente e attendere almeno 48 ore prima di acquisire le immagini. Il vetro diamanto richiede almeno due giorni di polimerizzazione prima delle acquisizioni di super-risoluzione.
Utilizzare due strategie per garantire la specificità degli anticorpi. Il primo è l'uso di almeno due anticorpi diversi che prendono di mira lo stesso substrato. La seconda strategia è la neutralizzazione degli anticorpi mediante incubazione con il bersaglio proteico purificato, o l'usato per sollevare l'anticorpo.
Utilizziamo regolarmente un microscopio a super risoluzione N-SIM prodotto da Nikon per la nostra analisi. Le istruzioni che seguono devono essere destinate all'acquisizione di immagini SIM indipendentemente dal microscopio d'uso. È anche importante massimizzare le prestazioni del microscopio per eseguire una calibrazione accurata degli strumenti, tra cui anello di correzione, allineamento laser e messa a fuoco del blocco di griglia.
Prima dell'acquisizione delle immagini SIM, il sistema richiede una calibrazione adeguata con specifiche perline fluorescenti di dimensioni sotto-risoluzione. Un esempio sono le microsfere di TetraSpeck. Queste perline sono macchiate con diversi coloranti fluorescenti per consentire la calibrazione di diversi laser con un campione.
In un bagno d'acqua, sonicare circa 1,8 volte 10 fino all'8 ° microsfere fluorescenti per 10 minuti. Diluire le microsfere fluorescenti una su 500 in acqua distillata doppia. Sonicare una seconda volta per altri 10 minuti.
Pipetta 15 microlitri delle perline diluite in un pozzo di un coperchio a camera. Lasciare asciugare la soluzione per cinque minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 10 microlitri della soluzione di montaggio, ad esempio
ProLong Glass e posizionare un coverslip di otto millimetri sopra. Attendere almeno 48 ore per consentire una corretta polimerizzazione. Accendi il microscopio e i laser.
Lasciare riscaldare il sistema per raggiungere l'equilibrio termico di tutti i componenti del microscopio e il sistema di microscopio sim a super risoluzione richiede almeno tre ore. Selezionare l'obiettivo 100X. Avviare la calibrazione allineando i laser al centro del blocco di retiatura di diffrazione.
Nel sistema N-SIM, una manopola del micrometro e una telecamera dedicata consentono di centrare i fasci di luce al bersaglio. Inserire la coverslip a camera del microscopio per la visualizzazione. Impostate il sistema allo spessore del coperchio camerato regolando il coperchio di correzione obiettivo.
NIS Software, il software proprietario dotato di sistemi al microscopio a super risoluzione N-SIM, ha una funzione automatica per regolare la correzione dei colori. Regola la messa a fuoco del blocco di griglia per ogni canale per garantire un'illuminazione strutturata focalizzata del modello sul campione. Il software fornisce una funzione automatica per questa attività.
Acquisisci immagini SIM 3D grezze delle microsfere multicolore. Calcola per ogni lunghezza d'onda separata la trasformata di Fourier dell'immagine super risolta. Se l'immagine trasformata non riesce a ottenere un modello corretto simile a un fiore, riavviare la calibrazione poiché la super-risoluzione non è stata raggiunta.
Nell'immagine super-risolta, selezionare una singola microsfera e calcolarne il profilo di intensità per ogni canale per misurare la risoluzione raggiunta. Ora dovrebbe essere vicino a 100 nanometri lateralmente. Eseguire la registrazione del canale sovrapponendo un'acquisizione multicanale delle microsfere.
L'obiettivo è quello di collimare tutti i segnali del canale lateralmente e assialmente. Ciò eliminerà le aberrazioni cromatiche dovute al disallineamento dei diversi canali e aiuterà l'analisi di co-localizzazione. Conferma la qualità della calibrazione utilizzando il passo della fase di illuminazione delle funzioni e la messa a fuoco modellata dell'illuminazione di SIMcheck, una suite di plugin per l'applicazione open source ImageJ.
Inizia ad analizzare il campione usando un obiettivo 40X in modalità confocale o widefield. Ciò consente la navigazione del campione, mantenendo buoni dettagli e un ampio campo visivo. Utilizzare il segnale anticorpale MAP2 per rilevare un'area che rappresenta i processi neuronali.
Acquisire immagini del campione in modalità confocale per determinare la qualità della colorazione. Passare all'obiettivo 100X. Applicare l'olio all'obiettivo 100X.
Acquisire un'immagine widefield o confocal che verrà utilizzata in seguito per valutare la qualità dell'immagine super risolta. Passare alla modalità SIM 3D. Utilizzando le finestre di dialogo per impostare i parametri per l'acquisizione, selezionare l'impostazione di profondità di bit più alta disponibile per massimizzare le informazioni sul colore.
In genere, 16 bit è la scelta standard. Inoltre, per migliorare il rapporto segnale-rumore, selezionare un valore a bassa frequenza per l'acquisizione, ad esempio un megahertz. Utilizzando le finestre dell'istogramma, impostare la potenza laser per ottenere una risposta lineare del segnale per evitare la perdita di informazioni, limitare i pixel saturi nelle immagini.
Il sistema N-SIM utilizza una telecamera Andor iXon3. Quando si lavora a 16 bit, scegliere un'intensità target di 16.000 per garantire la risposta lineare della fotocamera. In alternativa, scegli un intervallo compreso tra 30.000 e 45.000 per massimizzare la gamma dinamica delle acquisizioni.
Impostare la potenza del laser tra lo 0,1% e il 50% durante l'imaging dei campioni e i tempi di esposizione tra 50 millisecondi e due secondi. Potenze laser superiori al 50% possono causare un rapido fotobleaching dei fluorofori in uso. Inizia ad acquisire le immagini in modalità SIM 3D.
Utilizza SIMcheck, una suite di plugin gratuiti per ImageJ, per valutare la qualità delle acquisizioni delle immagini grezze. Se SIMcheck non rileva artefatti o problemi di qualità, acquisire almeno 10 immagini da repliche tecniche complete per consentire l'analisi statistica. Le immagini acquisite sono dati grezzi che devono essere elaborati per ottenere immagini SIM ricostruite che verranno utilizzate per ulteriori analisi.
Nel protocollo, suggeriamo di utilizzare synaptophysin e PSD-95 come marcatori pre e post sinaptici. È tuttavia possibile utilizzare marcatori aggiuntivi. Un enorme corpus di letteratura supporta l'uso di altre proteine, come la drebrina e il fagotto come marcatori sinaptici.
Le immagini acquisite dalla SIM 3D sono immagini grezze che devono essere elaborate per ottenere immagini super risolte ricostruite. Una ricostruzione errata delle immagini non elaborati può portare a artefatti che influenzerebbero l'analisi dei campioni. Occorre pertanto prestare grande attenzione alla corretta scelta dei parametri di ricostruzione.
Elaborare le immagini non elaborati utilizzando il software di analisi della ricostruzione al microscopio per ottenere un'immagine super risolta. In alternativa, utilizza un fairSIM del plugin ImageJ liberamente disponibile per ricostruire le immagini grezze. Calcola la trasformata di Fourier delle immagini super risolte utilizzando il software di ricostruzione del microscopio o il plug-in ImageJ SIMcheck.
Una buona immagine ricostruita dovrebbe restituire, per ogni canale, un'immagine simile a un fiore. Se le immagini ricostruite non riescono a ricreare una forma simile a un fiore, riavviare dalle immagini non elaborati e ricostruirle modificando i parametri di ricostruzione, ad esempio il filtraggio lineare, l'apodizzazione e la soppressione dell'ordine zero. Nel software NIS che utilizza l'anteprima per monitorare in che modo la modifica dei parametri influisce sull'immagine risolta finale, modificare il contrasto di modulazione dell'illuminazione del parametro, la soppressione del rumore ad alta risoluzione e la soppressione della messa a fuoco.
Analizza l'immagine ricostruita per rilevare in modo imparziale gli artefatti utilizzando NanoJ-SQUIRREL, un plugin basato su ImageJ, per valutare la qualità delle immagini super risolte. Nella nostra analisi della co-localizzazione, abbiamo usato due approcci. Il primo è un approccio visivo basato sull'analisi del profilo che mostra singoli eventi di co-localizzazione e che identifica il contributo di ogni canale.
Come primo passo per studiare la co-localizzazione tra marcatori sinaptici e una proteina di interesse, prendi un'immagine super risolta e analizza un singolo locus per determinare la sovrapposizione del segnale. Identifica un singolo locus sull'immagine super risolta. Ottenere i profili di intensità dei segnali fluorescenti al luogo di interesse.
Se l'analisi del profilo ha suggerito la co-localizzazione del singolo locus, un'analisi più generale dell'intera immagine può essere effettuata calcolando i coefficienti di Pearson e Mander. Usa JACoP, un plugin ImageJ, per determinare due parametri di co-localizzazione, Pearson's e Mander's. Dopo aver calibrato il sistema e valutato la qualità delle immagini ricostruite, abbiamo iniziato ad analizzare le colture neuronali primarie macchiate con un anticorpo contro MAP2, un marcatore neuronale, PSD-95, un marcatore postinaptico e la nostra proteina bersaglio SUMO1.
Per prima cosa abbiamo analizzato il campione eseguendo la microscopia confocale a quattro canali con un obiettivo 40X. Dopo aver selezionato un'area che rappresenta i processi neuronali, siamo passati a un obiettivo 100X. Abbiamo acquisito immagini sia confocali che SIM della stessa area per valutare la qualità della ricostruzione con NanoJ-SQUIRREL ed eseguire analisi di co-localizzazione.
Chiarire la struttura e la composizione della sinapsi è fondamentale per la comprensione dei processi fisiologici e patologici che regolano la memoria e la cognizione. Mentre in stato normale le sinapsi sono gli elementi costitutivi della memoria, sono anche alla base di complessi disturbi neurologici, come una delle forme più comuni di demenza morbo di Alzheimer. Il protocollo qui descritto consente lo studio della composizione proteica delle sinapsi con una tecnica di microscopia a super risoluzione chiamata microscopia ad illuminazione strutturata.
