Questo protocollo consente di valutare potenziali alterazioni morfologiche nei neuroni e nelle spine dendritiche che possono sottolineare anomalie neurochimiche e comportamentali. È unico e utile per visualizzare i neuroni in diverse regioni cerebrali nei ratti, che in combinazione con sofisticato software di ricostruzione consente ai ricercatori di chiarire i possibili meccanismi alla base della disfunzione neurocognitiva. Inizia preparando la soluzione PVP secondo le indicazioni manoscritte.
Riempire il tubo con PVP e lasciarlo per 20 minuti. Ed espellerlo attraverso l'altra estremità con una siringa da 10 millilitri. Unire 170 milligrammi di perline microcarriere di tungsteno con 250 microlitri di cloruro di metilene.
Quindi vortice a fondo la sospensione. Aggiungere quindi 6 milligrammi di colorante lipofilo DilC18(3)a 300 microlitri di cloruro di metilene e vortice. Pipet 250 microlitri della sospensione del tallone di tungsteno su uno scivolo di vetro.
Attendere che le sospensioni si asciughino ad aria e aggiungere 300 microlitri della soluzione colorante. Una volta asciugato, utilizzare un rasoio per dividere la miscela in due tubi di centrifuga da 1,5 millilitri e riempire i tubi con acqua. Sonicare la miscela in un bagno d'acqua fino a quando omogeneo.
Assicurarsi che la punta del sonicatore si trovi direttamente sui tubi. Unire le due miscele in un tubo conico da 15 millilitri. E sonicare per altri tre minuti, assicurandosi che non rimangano grandi ciuffi di perline rivestite di colorante.
Dopo la sonicazione, disegnare la miscela nel tubo rivestito PVP con una siringa da 10 millilitri. E dai da mangiare ai tubi nella stazione di preparazione. Ruotare il tubo per un minuto.
Rimuovere con cura tutta l'acqua usando una siringa. Accendere il gas azoto e regolare il flusso di azoto a circa 0,5 litri al minuto. Ruotare il tubo nella stazione di preparazione e asciugarlo con azoto per 30 minuti.
Rimuovere il tubo dalla stazione e tagliarlo in segmenti di 13 millimetri con una fresa per tubi. Assicurarsi che il ratto non sia reattivo agli stimoli e ai riflessi noxious sono assenti. Quindi fissarlo in posizione supina.
Fai un'incisione lungo la linea mediana toracica. Separare il diaframma e aprire il petto con le forbici. Quindi inserire un ago da 20 calibro da 25 millimetri nel ventricolo sinistro.
Tagliare immediatamente l'atrio destro con forbici e perfondire 15 millilitri di PBS da 100 millimolare con una portata di 5 millimetri al minuto. Quindi perfondere 100 millilitri di 4%PFA tamponati in PBS. Dopo la perfusione, rimuovere l'intero cervello del topo.
E postfissarlo con 4%PFA per 10 minuti. Utilizzare una matrice cerebrale del ratto per tagliare una sezione coronale spessa 500 micrometri. Fai un pugno tagliato e tieni la lama in posizione.
Quindi fare un secondo taglio con una seconda lama e rimuovere verticalmente la prima lama, mantenendo il tessuto sulla superficie della lama. Posizionare le fette cerebrali nella piastra da 24 pozzi con 1 millilitro di PBS in ogni pozzo. E ripetere il processo fino a quando tutte le fette sono state tagliate.
Rimuovere PBS da ogni pozzo di destinazione. Caricare la cartilagine con un pezzo di tubo di dil/tungsteno e posizionarla nell'applicatore. Metti un pezzo di carta da filtro tra i due schermi a rete.
E collegare l'applicatore al tubo dell'elio. Quindi regolare la pressione di uscita dell'elio a 90 libbre per pollice quadrato. Posizionare l'applicatore verticalmente al centro del pozzo di destinazione di 1,5 centimetri tra il campione e lo schermo a rete.
Quindi licenziare il tubo di dil/tungsteno. Caricare la cartilagine con i tubi successivi e sparare continuamente le perline dai tubi sulle fette rimanenti. Riempire la piastra da 24 punti con PBS da 100 millimolare.
E lavare le fette tre volte con 500 microlitri di PBS fresco. Assicurarsi che le fette non si capovolgeno durante il lavaggio. Al termine, aggiungere 500 microlitri di PBS fresco alle fette.
E incubarli per tre ore a quattro gradi Celsius al buio. Dopo l'incubazione, utilizzare un pennello fine per trasferire le fette cerebrali su vetrini. E aggiungere immediatamente un millilitro di mezzo di montaggio antifade ad ogni sezione.
Posizionare un coverslip di 22 per 15 millimetri sulle sezioni e asciugare gli scivoli al buio. Accendere il sistema di microscopio confocale e passare a un obiettivo 60X. Regolare le impostazioni di imaging in base alle indicazioni manoscritte.
E ottenere immagini Z-stack per il tipo di neurone mirato in base ai confini della regione cerebrale e alle caratteristiche morfologiche dei neuroni. Isolare il neurone corticale primario dai ratti F344 /N al primo giorno postnatale e coltarli in un piatto inferiore di vetro da 35 millimetri per una settimana. Rinfrescante metà del mezzo il terzo giorno dopo l'isolamento.
Lavare il piatto due volte con 1 millilitro di 100 millimolare PBS. E fissare le celle con 4%PFA per 15 minuti a temperatura ambiente. Etichettare balisticamente le cellule come descritto in precedenza.
E lavarli altre tre volte con 1 millilitro di PBS. Aggiungere 500 microlitri di PBS alle cellule e incubarli per tre ore a quattro gradi Celsius al buio. Quindi aggiungere 200 microlitri di mezzo di montaggio antifade.
E ottenere immagini Z-stack per ogni neurone mirato. I tipici neuroni piramidali nella regione ippocampale nelle sezioni cerebrali del ratto sono stati identificati con la tecnologia di etichettatura balistica caratterizzata da una grande dendrite apicale e diversi dendriti basali più piccoli intorno al soma. Il software di analisi quantitativa per la ricostruzione neuronale è stato utilizzato per tracciare i rami dendritici e rilevare le spine.
Successivamente, il software è stato utilizzato per valutare la complessità della ramificazione dendritica e la complessità del pergolato neuronale. I cambiamenti morfologici nelle spine dendritiche sono stati valutati utilizzando lunghezza, volume e diametro della testa. Quindi le spine sono state classificate in spine sottili, tozza e funghi.
E la frequenza relativa del numero di spine tra ogni raggio è stata esaminata. Inoltre, la tecnica di etichettatura balistica è stata convalidata su un neurone piramidale primario nella coltura cellulare. I neuroni piramidali sono stati identificati in base alla forma triangolare del soma e alla grande dendrite apicale.
Quindi è stato utilizzato un software di ricostruzione neuronale per analizzare la distribuzione di spine dendritiche sottili e lunghezza dendritica della colonna vertebrale. Quando si tenta questo protocollo, è importante evitare grandi ciuffi o ammassi di perline di tungsteno rivestite di colorante balistico che iniziano la preparazione. I grumi non permetterebbero di distinguere i singoli neuroni.
Combinato con il software di ricostruzione neuronale, questo metodo ci consente di esaminare la morfologia neuronale e dendritica della colonna vertebrale nei neuroni piramidali ippocampali. Il software di ricostruzione neuronale utilizza un algoritmo per offrire la classificazione automatica assistita delle spine dendritiche. La quantificazione di più parametri neuronali offre l'opportunità di comprendere meglio il meccanismo alla base della disfunzione cognitiva neuronale.
