Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health concede 2 R15 GM061539-02 (a BAS), 2 R15 NS40425-03 (a JEL), MH 66179 (il Dr. Gary Banker dell&#39;Oregon Health &amp; Science University / OHSU), e P30 NS061800 (il dottor Sue Aicher di OHSU). Ringraziamo Barbara Smoody per l&#39;ampio supporto con la cultura di neuroni dell&#39;ippocampo, e Drs. Brian lunga e James Abney per una lettura critica di questo manoscritto.

1. Preparazione del campione <ol><li> Preparare DNA codificante una chimera fotoconvertibile o photoactivatable mirato al DCVs, utilizzando tecniche di biologia molecolare standard. Nota: Una possibilità è DNA che codifica un attivatore tissutale del plasminogeno-Dendra2 chimera (tPA-Dendra2). Dendra2 è una proteina fotoconvertibile che passa dal verde al rosso emissione per esposizione a luce ultravioletta 12. </li><li> Neuroni dell&#39;ippocampo sulla cultura ad alte prestazioni # 1.5 copertura scivola per ~ 5-10 giorni, seguendo protocolli standard 13. </li><li> Trasfezione sviluppare neuroni ippocampali utilizzando un reagente lipide cationico. Nota: infezione virale-mediata è più efficace per i neuroni maturi. Questo approccio alternativo è stato descritto in dettaglio altrove 14. <ol><li> Preparare una provetta da 1,5 ml contenente ~ 1 mg di DNA e 250 pl di mezzo minimo essenziale (MEM) ed una seconda provetta da 1,5 ml contenente 4 ml di reagente lipide cationico e 250 microlitridi MEM. </li><li> Incubare le soluzioni per 5 min. </li><li> Combinare le due soluzioni e incubare la miscela risultante per altri 30 min. </li><li> Durante l&#39;incubazione, preparare un piatto contenente diversi ml di terreno di coltura riscaldata a 37 ° C. </li><li> Delicatamente trasferire vetrini contenenti neuroni al piatto contenente il mezzo di caldo e aggiungere la miscela di trasfezione. </li><li> Inclinare il piatto delicatamente e poi riporla in un incubatore a 37 ° C per 90 min. </li><li> Neuroni tornare alla loro &quot;piatto di casa&quot; e attendere ~ 12-18 ore. </li></ol></li><li> Fissare le cellule per 45 min a 4% paraformaldeide / 4% di saccarosio in tampone fosfato salino (PBS, pH 7.4) riscaldata a 37 ° C. Nota: Negli esperimenti PALM, è importante per ottenere una buona conservazione del ultrastruttura e protocolli di fissaggio formaldeide standard utilizzati per immunofluorescenza in genere non sono sufficienti 15. Una ragione importante per cattiva conservazione strutturale è insufficiente ftempo ixation perché fissazione con formaldeide comporta la formazione di addotti e proteine ​​reticolazione, e quest&#39;ultimo processo è abbastanza lento 16. A 45 min fissazione aiuta ad attenuare questo problema senza perdita overfixation indotta rilevabile di fluorescenza. </li><li> Copertura Wash scivola ~ 10x con filtrato PBS. Nota: Questo riduce i contaminanti fluorescenti. Campioni di immagini in tempi relativamente brevi dopo la fissazione. Nel frattempo, le cellule conservare a 4 ° C in PBS filtrato in un contenitore a tenuta di luce. </li><li> Vetrini Mount contenenti neuroni in una camera in filtrato PBS. Nota: Il campione deve essere montato in un mezzo acquoso, come PBS, con indice di rifrazione inferiore a quello del vetro, per attuare totale fluorescenza interna riflessione (TIRF) basata illuminazione. Illuminazione basato TIRF-è molto utile perché solo copertura fluorofori slittare-prossimale sono eccitati, e vi è una forte caduta associato a fluorescenza di fondo 17. </li></ol> 2. Image Acquisition &lt;/ P&gt; <ol><li> Accendere il sistema di imaging super-risoluzione. <ol><li> Accendere la lampada ad arco. </li><li> Capovolgere il switch &quot;componente&quot; &quot;Sistema / pc&quot; e (l&#39;interruttore di alimentazione remota) su &quot;on&quot;. </li><li> Accendere il computer (dopo il tablet / docking station controllo microscopio si accende). Nota: La docking station può essere utilizzato per controllare e monitorare molti attributi delle ottiche e il percorso della luce, in particolare la scelta dell&#39;obiettivo e messa a fuoco. </li><li> Fare doppio clic sull&#39;icona del software e scegliere l&#39;opzione &quot;sistema start&quot; nella finestra di login. </li></ol></li><li> Esaminare il campione. <ol><li> Aprire il frontale e pannelli di accesso superiore alla cappa di sicurezza laser. </li><li> Inclinare il braccio di luce trasmessa per accedere al palco e obiettivi. </li><li> Mettere olio sul piano alfa-Apochromat 100X apertura numerica / NA = 1.46 (TIRF) obiettivo. Nota: A 63X obiettivo high-NA può essere utilizzato al posto del 100X. </li><li> Montare il campione sul palco, e sollevare °e obiettivo verso il campione. </li><li> Monitorare la posizione dell&#39;obiettivo utilizzando la funzione XYZ della docking station. Fermarsi quando la lente è nel campo da baseball di messa a fuoco (ad esempio, z ~ 2,50 millimetri). </li><li> Chiudere completamente i pannelli di accesso. Nota: Per attivare la sicurezza laser. </li><li> Ottimizzare la messa a fuoco utilizzando gli oculari ei pulsanti nella scheda localizzare. Nota: La scheda localizzare fornisce l&#39;accesso ai pulsanti che producono arco di illuminazione basato su lampade e facilita l&#39;osservazione diretta del campione con gli oculari. Allo stesso modo, la scheda di acquisizione fornisce l&#39;accesso a strumenti che producono un&#39;illuminazione a base di laser e facilita la cattura delle immagini dalla fotocamera. <ol><li> Vai alla scheda di individuare, scegliere &quot;Trans On&quot;. </li><li> Fare clic sul simbolo di espansione oculare. Nota: Questo porta una schematica del percorso della luce. Attributi del percorso della luce può essere alterato da sinistra cliccando su apposite icone nello schema o utilizzando il touch screen sulla docking station. Ad esempio, un filtroappropriato per la visualizzazione di emissione da Dendra2 può essere scelto utilizzando l&#39;icona del riflettore revolver. </li><li> Guardare negli oculari, e portare le cellule a fuoco utilizza la docking station come guida. Nota: Il campione sarà molto scarsamente popolata con cellule fluorescenti perché i neuroni dell&#39;ippocampo sono difficili da trasfezione, e quindi può essere un po &#39;difficile mettere a fuoco con un&#39;illuminazione riflessa. Se questo è il caso, utilizzare illuminazione trasmessa e la lettura z della docking station come guida. </li><li> Alterna la luce &quot;Off&quot; dopo la focalizzazione. </li></ol></li></ol></li><li> Identificare una cella che è abbastanza brillante, esibisce puntiformi fluorescenza, e ha una morfologia classico che è indicativo di una buona salute. <ol><li> Scegliere luce riflessa e l&#39;appropriato filtro per la visualizzazione le emissioni verde da Dendra2. </li><li> Eseguire la scansione del vetrino di cellule esprimenti chimere Dendra2 usando la luce a bassa intensità di eccitazione. </li></ol></li><li> Passare alla acqscheda uisition. <ol><li> Utilizzare il &quot;manager esperimento&quot; per caricare una configurazione di acquisizione PALM che è opportunamente progettato o modificato facilmente. Nota: Se nessun esperimento del genere esiste, creare una configurazione di partenza sperimentale utilizzando le seguenti impostazioni come guida: cursori di potenza del laser: 405 nm (~ 0,01% per un laser 50 mW); 488 nm (~ 3% per un laser mW 100); 561 nm (~ 40% per un laser mW 100); Tempo di esposizione: ~ 50 msec; Guadagno della telecamera: ~ 200; Acquisizione multidimensionali: serie temporale (cicli = 30.000, interval = 0); Tracks: 488 nm con epi-illuminazione, e 561 nm con illuminazione a base di TIRF (vedi passo 2.5.1); Obiettivo: 100X (NA = 1.46); Cursore Angolo TIRF: angolo di incidenza ~ 67-72 °; Dimensione dei pixel: 100 nm; Campo di vista: TIRF (le scelte alternative producono intensità del laser più elevati e vengono utilizzati per fluorofori che sono più difficili da candeggina). </li><li> Fare clic su &quot;sì&quot; quando appare un menu pop-up con una query su accensione laser. </li></ol></li><li> Portare l&#39;immaginedella cella a fuoco sul piano fotocamera. <ol><li> Scegliere la traccia laser epi-illuminazione di 488 nm. Nota: le canzoni sono configurazioni raggio utilizzato durante l&#39;imaging. Qui, i nomi delle tracce sono determinati dalla lunghezza d&#39;onda di eccitazione che produce l&#39;emissione che viene passato alla fotocamera. Ad esempio, la traccia 561 nm utilizza sia il 405 e 561 linee laser nm, ma il cubo filtro passa unica emissione da photoconverted Dendra2 eccitato da 561 nm luce alla telecamera. </li><li> Mettere a fuoco l&#39;immagine della cella della fotocamera utilizzando il tasto di acquisizione &quot;continua&quot;. </li></ol></li><li> Raccogliere un&#39;immagine widefield convenzionale. <ol><li> Usare il tasto &quot;Snap&quot;. </li><li> Salvare l&#39;immagine andando nel menu &quot;File&quot; e scegliendo &quot;Salva / Salva come.&quot; </li></ol></li><li> Impostare l&#39;illuminazione basata TIRF. <ol><li> Scegliere la pista 488 e passare a &quot;TIRF&quot; utilizzando il tasto EPI / TIRF. </li><li> Scegliere acquisizione &quot;continua&quot;. </li><li> Regolare tegli TIRF basata cursore illuminazione. Nota: TIRF si ottiene quando vi è un improvviso oscuramento di sfondo e il campione può essere focalizzata su un piano 18. Se nuove caratteristiche diventano evidenti attraverso concentrandosi su nel campione, l&#39;angolo di incidenza è troppo bassa perché in TIRF c&#39;è solo un piano di attenzione. </li><li> Doppio controllare l&#39;angolo TIRF utilizzando la traccia 561 con il laser 405 nm &quot;off&quot;. </li><li> Ruotare il laser 405 nm torna &quot;on&quot; prima di avviare un esperimento PALM. </li></ol></li><li> Raccogliere dati PALM. <ol><li> Hit &quot;start esperimento.&quot; Nota: Se si desidera, aprire la scheda &quot;opzioni di elaborazione on-line&quot; e spunta &quot;PALM linea di trasformazione&quot; e &quot;Fit Gauss2D&quot; (prima di iniziare l&#39;esperimento) per monitorare l&#39;immagine PALM ricostruita durante la raccolta dei dati grezzi. Ciò faciliterà la valutazione della qualità dei dati e quindi il valore di continuare il processo di raccolta dati relativamente tempo. </li><li> Visivamentemonitorare fotoconversione. </li><li> Aumenta l&#39;intensità del laser 405 nm (photoconverting) quando Dendra2 diminuisce fotoconversione (in genere dopo l&#39;acquisizione di ~ 10.000 immagini crude). </li><li> Continua l&#39;esperimento, se aumenta fotoconversione. In caso contrario, interrompere l&#39;esperimento (senza perdita di dati), premendo il tasto &quot;stop&quot; passo corrente. </li><li> Salvare le immagini quando la raccolta dei dati è completa (dopo ~ 15 min). </li></ol></li></ol> 3. Elaborazione immagini, visualizzazione e analisi <ol><li> In assenza di linea di trasformazione, elaborare immagini crude che sono stati salvati su disco. <ol><li> Fare clic sulla scheda di elaborazione, aprire la scheda metodo, e selezionare &quot;PALM&quot;. </li><li> Scegliere &quot;PALM&quot; di nuovo dai quattro sotto-opzioni. </li><li> Vai al menu dei file, aprire e visualizzare il file di interesse, e premi &quot;seleziona&quot;. </li><li> Clicca su &quot;Applica&quot;. Nota: Questo avvierà picco / fluoroforo individuazione e la localizzazione di picco con otti predefinitoons. Se necessario, i picchi possono anche essere raggruppati utilizzando la scheda &quot;PAL-Group&quot;. Raggruppamento assegna picchi che compaiono in diversi fotogrammi consecutivi di una singola molecola, se le coordinate di picco sono sufficientemente simili. Inoltre, i dati possono essere corretti per la deriva del campione utilizzando l&#39;opzione di allineamento deriva model-based del software. </li></ol></li><li> Filtrare i componenti mal localizzati e mal campionate nei dati di picco-localizzata. <ol><li> Gettare fluorofori con precisioni di localizzazione, σ,&gt; 35 nm, utilizzando lo strumento &quot;PAL-Filter&quot;. </li><li> Gettare fluorofori nelle zone in cui la distanza media tra i picchi, d, è troppo grande per risolvere vescicole di diametro, D. <ol><li> Estrarre la precisione di localizzazione media, σ, dal istogramma precisione di localizzazione. </li><li> Calcolare un valore massimo accettabile per d basata su σ, e il Criteron Shannon-Nyquist 19, come sancito nella risoluzione ravvicinamento 20 R = D =[(2.35σ) 2 + (2d) 2] 1/2. </li><li> Impostare la soglia in funzione &quot;Elimina valori anomali PALME&quot; per eliminare i picchi circondate da meno di πD 2 / (4d 2) vicini di casa all&#39;interno di un cerchio di raggio D / 2. </li></ol></li><li> Convertire i dati PALM trasformato in un&#39;immagine PALM utilizzando lo strumento &quot;PAL-Rendering&quot;; vedi Figura 1. </li><li> Quantificare le dimensioni e separazioni scegliendo la funzione &quot;Profilo&quot;. <ol><li> Controllare la linea associata e le opzioni da tavola, e tracciare una linea lungo la direzione desiderata nell&#39;immagine. </li><li> Quantificare diametri determinando larghezze pieni a metà intensità massima. </li><li> Quantificare separazioni determinando picco-picco distanze di profili di intensità. </li></ol></li></ol></li></ol>

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	<li>Goldstein, A. Y., Wang, X., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+and+the+delivery+of+pre-synaptic+components.">Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components.</a> Curr Opin Neurobiol. 18, 495-503 (2008).</li><li>Combs, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy:+a+concise+guide+to+current+imaging+methods.">Fluorescence microscopy: a concise guide to current imaging methods.</a> Curr Protoc Neurosci. , (2010).</li><li>Sengupta, P., Van Engelenburg, S., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+cell+structure+and+function+with+point-localization+superresolution+imaging.">Visualizing cell structure and function with point-localization superresolution imaging.</a> Dev Cell. 23, 1092-1102 (2012).</li><li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2007).</li><li>Bury, L. A., Sabo, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+trafficking+of+synaptic+vesicle+and+active+zone+proteins+prior+to+synapse+formation.">Coordinated trafficking of synaptic vesicle and active zone proteins prior to synapse formation.</a> Neural Dev. 6, 24 (2011).</li><li>Matsuda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+activity-dependent+secretion+of+brain-derived+neurotrophic+factor+from+axon+and+dendrite.">Differential activity-dependent secretion of brain-derived neurotrophic factor from axon and dendrite.</a> J Neurosci. 29, 14185-14198 (2009).</li><li>Tao-Cheng, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+localization+of+active+zone+and+synaptic+vesicle+proteins+in+a+preassembled+multi-vesicle+transport+aggregate.">Ultrastructural localization of active zone and synaptic vesicle proteins in a preassembled multi-vesicle transport aggregate.</a> Neuroscience. 150, 575-584 (2007).</li><li>Zhai, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembling+the+presynaptic+active+zone:+a+characterization+of+an+active+zone+precursor+vesicle.">Assembling the presynaptic active zone: a characterization of an active zone precursor vesicle.</a> Neuron. 29, 131-143 (2001).</li><li>Ahmari, S. E., Buchanan, J., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+presynaptic+active+zones+from+cytoplasmic+transport+packets.">Assembly of presynaptic active zones from cytoplasmic transport packets.</a> Nat Neurosci. 3, 445-451 (2000).</li><li>Garner, C. C., Zhai, R. G., Gundelfinger, E. D., Ziv, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+CNS+synaptogenesis.">Molecular mechanisms of CNS synaptogenesis.</a> Trends Neurosci. 25, 243-251 (2002).</li><li>Chuang, J. Z., Milner, T. A., Zhu, M., Sung, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+29+kDa+intracellular+chloride+channel+p64H1+is+associated+with+large+dense-core+vesicles+in+rat+hippocampal+neurons.">A 29 kDa intracellular chloride channel p64H1 is associated with large dense-core vesicles in rat hippocampal neurons.</a> J Neurosci. 19, 2919-2928 (1999).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+photoactivatable+fluorescent+protein+Dendra2+to+track+protein+movement.">Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement.</a> Biotechniques. 42, (2007).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li><li>Scalettar, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hindered+submicron+mobility+and+long-term+storage+of+presynaptic+dense-core+granules+revealed+by+single-particle+tracking.">Hindered submicron mobility and long-term storage of presynaptic dense-core granules revealed by single-particle tracking.</a> Dev Neurobiol. 72, 1181-1195 (2012).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putting+super-resolution+fluorescence+microscopy+to+work.">Putting super-resolution fluorescence microscopy to work.</a> Nat Methods. 6, 21-23 (2009).</li><li>Helander, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde+binding+in+brain+and+kidney:+A+kinetic+study+of+fixation.">Formaldehyde binding in brain and kidney: A kinetic study of fixation.</a> Journal of Histotechnology. 22, 317-318 (1999).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+in+cell+biology.">Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology.</a> Traffic. 2, 764-774 (2001).</li><li>Toomre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alignment+and+calibration+of+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+systems.">Alignment and calibration of total internal reflection fluorescence microscopy systems.</a> Cold Spring Harb Protoc. 4, 504-509 (2012).</li><li>Shannon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Communication+in+the+presence+of+noise.">Communication in the presence of noise.</a> Proc IRE. 37, 10-21 (1949).</li><li>Hess, S. T., Gould, T. J., Gunewardene, M., Bewersdorf, J., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrahigh+resolution+imaging+of+biomolecules+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultrahigh resolution imaging of biomolecules by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Methods Mol Biol. 544, 483-522 (2009).</li><li>Sengupta, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+protein+heterogeneity+in+the+plasma+membrane+using+PALM+and+pair+correlation+analysis.">Probing protein heterogeneity in the plasma membrane using PALM and pair correlation analysis.</a> Nat Methods. 8, 969-975 (2011).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> J Cell Biol. 190, 165-175 (2010).</li><li>Zhong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivated+localization+microscopy+(PALM):+an+optical+technique+for+achieving+~10-nm+resolution.">Photoactivated localization microscopy (PALM): an optical technique for achieving ~10-nm resolution.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010, (2010).</li><li>Lochner, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+copackaging+and+cotransport+yields+postsynaptic+colocalization+of+neuromodulators+associated+with+synaptic+plasticity.">Efficient copackaging and cotransport yields postsynaptic colocalization of neuromodulators associated with synaptic plasticity.</a> Dev Neurobiol. 68, 1243-1256 (2008).</li><li>Geisler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drift+estimation+for+single+marker+switching+based+imaging+schemes.">Drift estimation for single marker switching based imaging schemes.</a> Optics Express. 20, 7274-7289 (2012).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

PALM e super-risoluzione relative tecniche di microscopia a fluorescenza hanno recentemente emerso come un prezioso complemento alle forme meglio consolidati di microscopia ottica e microscopia elettronica (EM) 22-24. Attributi positivi di PALM includono relativamente semplice preparazione del campione e minimale perturbazione del campione. In linea di principio, PALM anche può essere usato per studiare le cellule viventi. Probabilmente il principale attributo negativo di PALM è l&#39;acquisizione di dati r...

Un certo numero di processi cellulari dipendono traffico accurato ed efficiente vescicola-mediata di biomolecole a destinazioni specifiche subcellulari. Un esempio importante è l&#39;Assemblea sinaptica, che è preceduto da lunga distanza, consegna vescicola-mediata dei componenti sinaptiche da siti di biogenesi nel soma neuronale potenzialmente distali siti pre-e post-sinaptici 1. Microscopia a fluorescenza è un metodo potente e popolare di studiare il traffico di vescicole. Punti di forza di questa tecnica sono la sua sensibilità, la specificità e la compatibilità con l&#39;imaging dal vivo 2. Purtroppo, fino a tempi relativamente recenti, la tecnica ha subito da una grande debolezza, risoluzione di diffrazione limitata 2, che ostacola gli studi di strutture con dimensioni inferiori a ~ 250 nm. Recentemente, risoluzione laterale in microscopia a fluorescenza superato la barriera di diffrazione con l&#39;introduzione di mi fluorescenza super-risoluzionetecniche croscopy, come PALM 3. La risoluzione laterale di PALM, decine di nanometri, è ideale per lo studio delle vescicole, che hanno dimensioni che in genere vanno da ~ 50-250 nm 4. È quindi ora possibile utilizzare fluorescenza, con la sua miriade di forza, per chiarire uno spettro di attributi precedentemente inaccessibili di vescicole, compresi alcuni aspetti del loro traffico verso specifici siti subcellulari. PALM non è banale da implementare e strategie di successo, spesso, devono essere adattati al tipo di sistema in fase di studio. Qui si descrive come implementare studi Palma di strutture vescicolari, e abbiamo dimostrato l&#39;efficacia del nostro approccio per il caso di DCVs in neuroni dell&#39;ippocampo. In particolare, usiamo PALM affrontare l&#39;ipotesi che il traffico di DCVs alle sinapsi dei neuroni dell&#39;ippocampo è mediato dai cluster DCV 5-8. Traffico Cluster-mediata di vescicole di sinapsi nello sviluppo di neurons è una possibilità intrigante perché può facilitare una rapida stabilizzazione sinaptica e il montaggio 9,10. I fautori della tratta cluster di DCVs citano la grande dimensione apparente del puncta fluorescente extrasinaptica ospitare esogeno DCV carico come prove a sostegno di clustering 6. Tuttavia, questi puncta appaiono in immagini generate utilizzando tecniche di microscopia a fluorescenza diffrazione limitata, che non sono adatti a distinguere gli effetti di dimensioni derivanti dalla diffrazione da quelli derivanti da clustering. Per risolvere questo problema, abbiamo raccolto convenzionale fluorescenza widefield e le immagini palmo di neuroni dell&#39;ippocampo che esprimono chimere mirati a DCVs. L&#39;analisi di queste immagini ha rivelato che il&gt; 92% dei presunti cluster DCV extrasynaptic in immagini convenzionali sono risolti come 80 nm (individuale DCV-sized) 11 puncta in immagini PALM. Quindi, questi dati ampiamente invalidare l&#39;ipotesi di clustering applicati agli DCVs nello sviluppo hippocaneuroni mpal.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1105">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Zeiss PALM</td>
			<td style="width:169px;">Carl Zeiss, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">Elyra PS.1</td>
			<td style="width:572px;">With Zeiss Efficient Navigation (ZEN) software and fluorescence filter Set 77 HE GFP/mRFP/Alexa633&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:245px;">Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td style="width:169px;">Life Technoligies</td>
			<td style="width:119px;">11668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Minimum Essential Medium</td>
			<td style="width:169px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11095-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td style="width:169px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:245px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:169px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">19208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Sucrose</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S-8501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">growth glass coverslips 18mm 1.5D</td>
			<td style="width:169px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NC0059095</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution imaging of neuronal dense-core vesicles

<html> Rilevamento della fluorescenza fornisce le basi per molte tecniche di microscopia molto utilizzate e in rapido progresso impiegati in applicazioni biologiche e mediche moderne. Punti di forza della fluorescenza comprendono la sua sensibilità, la specificità e la compatibilità con l&#39;imaging dal vivo. Purtroppo, forme convenzionali di microscopia a fluorescenza soffrono di una debolezza, risoluzione diffrazione limitata importante nel piano di imaging, che ostacola studi di strutture con dimensioni inferiori a ~ 250 nm. Recentemente, questa limitazione è stata superata con l&#39;introduzione di super-risoluzione tecniche di microscopia a fluorescenza, come la microscopia localizzazione fotoattivati ​​(PALM). A differenza dei suoi omologhi convenzionali, PALM grado di produrre immagini con una risoluzione laterale di decine di nanometri. È quindi ora possibile utilizzare fluorescenza, con la sua miriade di forza, per chiarire uno spettro di attributi precedentemente inaccessibili di struttura e organizzazione cellulare. _content &quot;&gt; Purtroppo, PALM non è banale da implementare e strategie di successo, spesso, devono essere adattati al tipo di sistema in fase di studio. In questo articolo mostriamo come implementare studi PALMA monocolore di strutture vescicolari, in neuroni in coltura fissi. PALM è ideale per lo studio delle vescicole, che hanno dimensioni che in genere vanno da ~ 50-250 nm. passaggi chiave nel nostro approccio includere etichettatura neuroni con fotoconvertibile (verde a rosso) chimere di vescicole carico, la raccolta di immagini RAW scarsamente campionate con sistema di microscopia super-risoluzione, e l&#39;elaborazione delle immagini raw per produrre un&#39;immagine PALM ad alta risoluzione. Abbiamo anche dimostrare l&#39;efficacia del nostro approccio con la presentazione di immagini eccezionalmente ben risolte, di vescicole dense-core (DCVS) in neuroni ippocampali in coltura, che confutare l&#39;ipotesi che il traffico extrasinaptica di DCVs è mediato principalmente dai cluster DCV.

La Figura 1 mostra un prodotto finale di immagine e l&#39;elaborazione. In questa immagine PALM, coordinate laterali di fluorofori localizzati vengono visualizzati utilizzando la modalità di visualizzazione centroide, e l&#39;immagine super-risoluzione del DCV associato viene visualizzato utilizzando la modalità di visualizzazione gaussiana. Figura 2A mostra widefield analogo ed immagini palmo della soma e processi prossimali di un otto giorni in vitro...

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Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Si descrive come implementare fotoattivati ​​microscopia localizzazione (PALM) a base di studi di vescicole in fissi, neuroni in coltura. I componenti chiave del nostro protocollo includono etichettatura vescicole con chimere fotoconvertibile, la raccolta di immagini crude scarsamente campionate con un sistema di microscopia super-risoluzione, e l&#39;elaborazione delle immagini crude per produrre un&#39;immagine super-risoluzione.

Super-Resolution Imaging di vescicole neuronali Dense-core

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.6K Views.  Lewis & Clark College.  Si descrive come implementare fotoattivati ​​microscopia localizzazione (PALM) a base di studi di vescicole in fissi, neuroni in coltura. I componenti chiave del nostro protocollo includono etichettatura vescicole con chimere fotoconvertibile, la raccolta di immagini crude scarsamente campionate con un sistema di microscopia super-risoluzione, e l'elaborazione delle immagini crude per produrre un'immagine super-risoluzione. 

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In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

In vivo imaging di calcio neuronale in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Ricerca

Neuroscienze

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of stress-induced plasticity is the dauer stage of C. elegans. Dauers are an alternative developmental larval stage formed under conditions of low concentrations of bacterial food and high concentrations of a dauer pheromone. Dauers display extensive developmental and behavioral plasticity. For example, a set of four inner-labial quadrant (IL2Q) neurons undergo extensive reversible remodeling during dauer formation. Utilizing the well-known environmental pathways regulating dauer entry, a previously established method for the production of crude dauer pheromone from large-scale liquid nematode cultures is demonstrated. With this method, a concentration of 50,000 - 75,000 nematodes/ml of liquid culture is sufficient to produce a highly potent crude dauer pheromone. The crude pheromone potency is determined by a dose-response bioassay. Finally, the methods used for in vivo time-lapse imaging of the IL2Qs during dauer formation are described.

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant &#8216;dauer&#8217; juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

In Vivo Imaging di Dauer-specifica neuronale ritocca in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the experimental time, and increases the number of animals that are utilized per study. This limitation specifically impacts protocols such as calcium imaging that require prolonged pre-incubation with bath-applied dyes. Exponential bacterial growth within 3 - 4 h after slicing is tightly correlated with a decrease in tissue health. This study describes a method for&#160;limiting the proliferation of bacteria in acute preparations to maintain viable neuronal tissue for prolonged periods of time (&#62;24 h) without the need for antibiotics, sterile procedures, or tissue culture media containing growth factors. By cycling the extracellular fluid through UV irradiation and keeping the tissue in a custom holding chamber at 15 - 16 &#176;C, the tissue shows no difference in electrophysiological properties, or calcium signaling through intracellular calcium dyes at &#62;24 h postdissection. These methods will not only extend experimental time for those using acute neuronal tissue, but will reduce the number of animals required to complete experimental goals, and will set a gold standard for acute neuronal tissue incubation.

Once removed from the body, neuronal tissue is greatly affected by environmental conditions, leading to eventual degradation of the tissue after 6 - 8 h. Using a unique incubation method, which closely monitors and regulates the extracellular environment of the tissue, tissue viability can be significantly extended for &#62;24 h.

L&#39;incubazione prolungata di acuta neuronale tessuto per Elettrofisiologia e Calcio imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and columns to facilitate brain wiring during development and information processing in developed animals. Postsynaptic neurons elaborate dendrites in type-specific patterns in specific layers to synapse with appropriate presynaptic terminals. The fly medulla neuropil is composed of 10 layers and about 750 columns; each column is innervated by dendrites of over 38 types of medulla neurons, which match with the axonal terminals of some 7 types of afferents in a type-specific fashion. This report details the procedures to image and analyze dendrites of medulla neurons. The workflow includes three sections: (i) the dual-view imaging section combines two confocal image stacks collected at orthogonal orientations into a high-resolution 3D image of dendrites; (ii) the dendrite tracing and registration section traces dendritic arbors in 3D and registers dendritic traces to the reference column array; (iii) the dendritic analysis section analyzes dendritic patterns with respect to columns and layers, including layer-specific termination and planar projection direction of dendritic arbors, and derives estimates of dendritic branching and termination frequencies. The protocols utilize custom plugins built on the open-source MIPAV (Medical Imaging Processing, Analysis, and Visualization) platform and custom toolboxes in the matrix laboratory language. Together, these protocols provide a complete workflow to analyze the dendritic routing of Drosophila medulla neurons in layers and columns, to identify cell types, and to determine defects in mutants.

Here, we show how to analyze dendritic routing of Drosophila medulla neurons in columns and layers. The workflow includes a dual-view imaging technique to improve the image quality and computational tools for tracing, registering dendritic arbors to the reference column array and for analyzing the dendritic structures in 3D space.

Analizzando dendritiche Morfologia in colonne e strati

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Imaging del due-fotone calcio nei dendriti neuronali nelle fette del cervello

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans

Toxicity of misfolded proteins and mitochondrial dysfunction are pivotal factors that promote age-associated functional neuronal decline and neurodegenerative disease across species. Although these neurotoxic challenges have long been considered to be cell-intrinsic, considerable evidence now supports that misfolded human disease proteins originating in one neuron can appear in neighboring cells, a phenomenon proposed to promote pathology spread in human neurodegenerative disease.
C. elegans adult neurons that express aggregating proteins can extrude large (~4 &#181;m) membrane-surrounded vesicles that can include the aggregated protein, mitochondria, and lysosomes. These large vesicles are called &#8220;exophers&#8221; and are distinct from exosomes (which are about 100x smaller and have different biogenesis). Throwing out cellular debris in exophers may occur by a conserved mechanism that constitutes a fundamental, but formerly unrecognized, branch of neuronal proteostasis and mitochondrial quality control, relevant to processes by which aggregates spread in human neurodegenerative diseases.
While exophers have been mostly studied in animals that express high copy transgenic mCherry within touch neurons, these protocols are equally useful in the study of exophergenesis using fluorescently tagged organelles or other proteins of interest in various classes of neurons.
Described here are the physical features of C. elegans exophers, strategies for their detection, identification criteria, optimal timing for quantitation, and animal growth protocols that control for stresses that can modulate exopher production levels. Together, details of protocols outlined here should serve to establish a standard for quantitative analysis of exophers across laboratories. This document seeks to serve as a resource in the field for laboratories seeking to elaborate molecular mechanisms by which exophers are produced and by which exophers are reacted to by neighboring and distant cells.

Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans

This protocol describes approaches for detection and quantitation of large aggregate and/or organelle extrusions (~4 &#181;m) produced by C. elegans cells in the form of membrane-bound exophers. We describe strains, growth conditions, scoring criteria, timing, and microscopy considerations needed to facilitate dissection of this debris expulsion mechanism.

Approcci quantitativi per il punteggio in vivo Neuronal Aggregate e Organelle Extrusion in Grandi Vesicles esopher in C. elegans

Toxicity of misfolded proteins and mitochondrial dysfunction are pivotal factors that promote age-associated functional neuronal decline and ...

Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. Imaging studies are widely used to investigate their function and plasticity in physiological and pathological conditions. Because of their size and structure, localization studies of proteins require high-resolution imaging techniques. In this protocol, we describe a procedure to study in primary neurons the co-localization of target proteins with synaptic markers at a super-resolution level using structured illumination microscopy (SIM). SIM is a patterned-light illumination technique that doubles the spatial resolution of wide-field microscopy, reaching a detail of around 100 nm. The protocol indicates the required controls and settings for robust co-localization studies and an overview of the statistical methods to analyze the imaging data properly.

This protocol shows how to employ super-resolution microscopy to study protein co-localization in primary neuronal cultures.

Imaging super-risoluzione per studiare la co-localizzazione di proteine e marcatori sinaptici nei neuroni primari

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are optimized to minimize their impact on behavior. This is first achieved by using a holder that minimizes movement hindrances. The back of the fly&#8217;s head is glued to this holder at an angle that allows optical access to the whole brain while retaining the fly&#8217;s ability to walk, groom, smell, taste and see. The back of the head is dissected to remove tissues in the optical path and muscles responsible for head movement artefacts. The fly brain can subsequently be imaged to record brain activity, for instance using calcium or voltage indicators, during specific behaviors such as walking or grooming, and in response to different stimuli. Once the challenging dissection, which requires considerable practice, has been mastered, this technique allows to record rich data sets relating whole brain activity to behavior and stimulus responses.

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

We present a method specifically tailored to image the whole brain of adult Drosophila during behavior and in response to stimuli. The head is positioned to allow optical access to the whole brain, while the fly can move its legs and the antennae, the tip of the proboscis, and the eyes can receive sensory stimuli.

Preparazione della Drosophila melanogaster adulta per l'imaging cerebrale intero durante il comportamento e le risposte agli stimoli

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...

ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the different ROS, hydrogen peroxide (H2O2) is best characterized with respect to roles in cellular signaling. H2O2 has been implicated during the development in several species. For example, a transient increase in H2O2 has been detected in zebrafish embryos during the first days following fertilization. Furthermore, depleting an important cellular H2O2 source, NADPH oxidase (NOX), impairs nervous system development such as the differentiation, axonal growth, and guidance of retinal ganglion cells (RGCs) both in&#160;vivo and in vitro. Here, we describe a method for imaging intracellular H2O2 levels in cultured zebrafish neurons and whole larvae during development using the genetically encoded H2O2-specific biosensor, roGFP2-Orp1. This probe can be transiently or stably expressed in zebrafish larvae. Furthermore, the ratiometric readout diminishes the probability of detecting artifacts due to differential gene expression or volume effects. First, we demonstrate how to isolate and culture RGCs derived from zebrafish embryos that transiently express roGFP2-Orp1. Then, we use whole larvae to monitor H2O2 levels at the tissue level. The sensor has been validated by the addition of H2O2. Additionally, this methodology could be used to measure H2O2 levels in specific cell types and tissues by generating transgenic animals with tissue-specific biosensor expression. As zebrafish facilitate genetic and developmental manipulations, the approach demonstrated here could serve as a pipeline to test the role of H2O2 during neuronal and general embryonic development in vertebrates.

This protocol describes the use of a genetically encoded hydrogen peroxide (H2O2)-biosensor in cultured zebrafish neurons and larvae for assessing the physiological signaling roles of H2O2 during nervous system development. It can be applied to different cell types and modified with experimental treatments to study reactive oxygen species (ROS) in general development.

Imaging cellulare vivo ROS durante lo sviluppo neuronale

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.