Questo protocollo può essere utilizzato per rispondere alla domanda se e come la fratturazione idraulica influisce sui batteri nei flussi vicini e, per estensione, sui flussi stessi. Il vantaggio principale di questa tecnica è la sua natura olistica, in quanto porta il ricercatore dalla raccolta dei campioni fino all'analisi dei dati. A dimostrare la procedura saranno Jeremy Chansee, un bioinformatico nel mio laboratorio, Sydney Regal, uno studente universitario al Juniata College, e Gillian Leister, il mio responsabile di laboratorio.
Per raccogliere campioni di sedimenti per l'estrazione di acidi nucleici, utilizzare guanti per immergere un tubo conico sterile da 50 millilitro nell'acqua del torrente dalla riva. Mentre il tubo è sommerso, rimuovere il cappuccio e utilizzare il cappuccio per raccogliere circa tre millilitri di sedimenti da una profondità di uno a tre centimetri nel tubo. Dopo aver raccolto il campione, scaricare tutto tranne circa un millilitro di acqua dal tubo e utilizzare una pipetta da 1.000 microlitri per aggiungere tre millilitri di conservante DNA / RNA al campione.
Ruotare il tubo conico tappato per cinque secondi per mescolare accuratamente il conservante e il campione e conservare il campione sul ghiaccio. Al ritorno in laboratorio, conservare il campione a meno 20 gradi Celsius per l'analisi del DNA 16S o meno 70 gradi Celsius per l'analisi dell'RNA metatrascrittomico. Per la raccolta del filtro, riempire e svuotare completamente un'intera bottiglia sterile da un litro con acqua corrente tre volte per condizionare la bottiglia prima di riempire la bottiglia un'ultima volta.
Su una superficie stabile, aspirare un intero volume di acqua di flusso in una siringa sterile luer lock e collegare la siringa a un filtro in polietersolfone sterile e privo di DNA/RNA di 1,7 centimetri di diametro con una dimensione dei pori di 0,22 micron. Lavare l'intero volume di acqua di flusso attraverso il filtro. Quando l'intero volume del campione è stato filtrato nello stesso modo, aspirare circa 20 millilitri di aria nella siringa e spingere l'aria attraverso il filtro per rimuovere l'acqua in eccesso dal filtro.
Quindi, utilizzare una micropipetta P1000 per aggiungere due millilitri di conservante DNA / RNA all'apertura più grande del filtro mentre si tiene il filtro orizzontalmente con la punta della pipetta nella canna del filtro per assicurarsi che il conservante entri nel filtro. Quindi sigillare il filtro con quadrati di pellicola di paraffina ben avvolti attorno a ciascuna apertura e posizionare il filtro in un sacchetto di campione sterile sul ghiaccio. Al ritorno dal campionamento, conservare i filtri per 16S o per l'analisi metatrascrittomica come dimostrato.
Prima di iniziare un trasferimento del campione, pulire l'area di lavoro con il 10% di candeggina e il 70% di etanolo. Per l'estrazione di acido nucleico da un campione di sedimento, utilizzare uno strumento metallico sterilizzato a fiamma ed etanolo per trasferire circa 250 milligrammi di campione in un tubo di microcentrifuga. Per l'estrazione di acido nucleico da un campione di filtro, utilizzare un'impugnatura a etanolo e fiamma al 70% sterilizzata per rompere l'involucro del filtro sulla superficie sterile e rimuovere il nucleo dall'involucro.
Utilizzare un bisturi sterile per affettare in alto, in basso e lungo la cucitura del nucleo e utilizzare pinzette sterili per piegare la carta da filtro prima di tagliarla a pezzetti con il bisturi. Quindi posizionare con cura i pezzi del filtro in un tubo microcentrifuga senza contattare superfici non sterilizzate. Per la lisi delle cellule all'interno di entrambi i tipi di campione, sottoporre il tubo a un distruttore cellulare ad alta velocità.
Dopo almeno cinque minuti, centrifugare i campioni e trasferire il surnatante in un nuovo tubo microcentrifuga sterile. Aggiungere il tampone di lisi al surnatante con un rapporto uno a uno e trasferire la soluzione al filtro fornito. Posizionare il filtro in un nuovo tubo microcentrifuga e aggiungere 400 microlitri di tampone di preparazione al tubo.
Dopo la centrifugazione, aggiungere 700 microlitri di tampone di lavaggio al tubo e centrifugare nuovamente il filtro. Dopo aver scartato il flusso passante, aggiungere 400 microlitri di tampone di lavaggio al tubo per un'ulteriore centrifugazione e trasferire il filtro in un nuovo tubo microcentrifuga sterile. Per eluire il DNA, trattare il filtro con 50 microlitri di acqua priva di DNasi/RNasi per cinque minuti a temperatura ambiente.
Nel frattempo, posizionare un filtro a tre HRC in un tubo di raccolta e aggiungere 600 microlitri di soluzione di preparazione HRC. Dopo la centrifugazione, trasferire il filtro in un nuovo tubo microcentrifuga sterile e trasferire il DNA eluito al filtro per la centrifugazione. Il flusso-attraverso contiene il DNA estratto.
Per creare una libreria di DNA 16S RNA, utilizzare prima il prodotto DNA appena estratto per l'amplificazione dell'RNA ribosomiale 16S con un protocollo PCR standard. Mescolare sette microlitri del prodotto PCR risultante e 13 microlitri di acqua priva di DNasi e caricare la soluzione PCR su un gel di acarosio al 2%. Quindi eseguire il gel a 90 volt per 60-90 minuti per verificare la dimensione della banda di 386 coppie di basi come prova di un'amplificazione riuscita.
Per purificare la libreria di RNA ribosomiale del DNA 16S, mettere insieme 10 microlitri dei prodotti PCR che hanno prodotto bande luminose e 13 microlitri dei campioni che hanno prodotto bande deboli in un tubo microcentrifuga sterile e caricare circa 150-200 nanogrammi di ciascun campione raggruppato in singoli pozzetto di un nuovo gel al 2%. Dopo aver eseguito il gel come dimostrato, asportare le 386 bande della coppia di basi dal gel e utilizzare un kit commerciale per purificare il DNA. Quindi eluire il DNA purificato con 30 microlitri di Tris cloridrato da 10 millimolari e imballare le librerie purificate in ghiaccio secco prima di essere spedite per il sequenziamento di prossima generazione.
In questa analisi rappresentativa, tutte le estrazioni tranne una sarebbero soprannominate di successo. Le bande luminose osservate dopo l'amplificazione PCR indicano il successo del protocollo 16S. I campioni 16S dovrebbero avere un minimo di 1.000 sequenze con almeno 5.000 ideali, mentre i campioni metatrascrittisomici dovrebbero avere un minimo di 500.000 sequenze con almeno 2 milioni ideali.
Vengono mostrati campioni di sedimenti provenienti da 21 siti diversi in 13 flussi diversi per l'analisi 16S e metatrascrittomica. Di questi 21 siti, 12 erano a valle dell'attività di fracking e classificati come positivi alla fratturazione idraulica, e nove erano a monte dell'attività di fracking o in uno spartiacque in cui il fracking era assente e classificato come fratturazione idraulica negativa. Come valutato dall'analisi PERMANOVA, la separazione osservata tra i dati positivi e negativi della fratturazione idraulica suggerisce che i campioni positivi della fratturazione idraulica sono stati influenzati dal fracking.
I più importanti predittori di foreste casuali rivelerebbero quali caratteristiche erano più essenziali per differenziare correttamente i campioni. Se un taxon è identificato come importante dal modello di foresta casuale, il suo profilo di resistenza antimicrobica nei campioni positivi di fratturazione idraulica potrebbe essere confrontato con il suo profilo nei campioni negativi di fratturazione idraulica. Se differiscono notevolmente, ciò potrebbe suggerire che il fluido di fracking contenente biocidi sia entrato nel flusso.
I microbi sono ovunque, quindi la contaminazione è un potenziale problema significativo con questo tipo di lavoro. Le fasi iniziali di trasferimento del campione sono particolarmente inclini a questo. Se si è interessati alla biodegradazione microbica o ad altri metabolismi, il sequenziamento shotgun dell'RNA può essere utilizzato per studiare l'espressione genica microbica attiva.
Questa tecnica consente la standardizzazione delle tecniche molecolari per lo studio delle comunità batteriche in situ, nonché le analisi bioinformatiche dei dati di sequenza batterica.
