Development of the method presented here has been carried out with various sources of funding, including Genome Canada and Genome Quebec, Environment Canada STAGE program and internal NRC funds.

1 16S rRNA gene Amplicon Biblioteca Preparazione con il metodo Fusion <ol><li> Scongelare i primer (forward, F343-Iona-MIDXX: 5&#39;-CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG AC T CAG XXX XXX XXX XTA CGG RAG GCA GCA G-3 &#39;; inversa, R533-IonP1: 5&#39;-CCT CTC TAT GGG CAG TCG GTG AT A TTA CCG CGG CTG CTG GC-3 &#39;; grassetto: Ion Torrent adattatori specifici; corsivo: tasto sequenza per la calibrazione di intensità di segnale all&#39;inizio della corsa di sequenziamento; carattere regolare: primer specifici template; X ... X: 10 bp del codice a barre, vedere la Tabella 1 per alcune sequenze di codici a barre), il master mix 2x HotStartTaq Plus e dei campioni. Mescolare accuratamente prima dell&#39;uso, ad eccezione del master mix che deve essere miscelato con delicatezza. </li><li> Preparare una miscela di PCR (20 reazioni microlitri) con 0,5 mM del primer reverse, 0,4 mg / ml di albumina di siero bovino (BSA) e 1x HotStartTaq Inoltre mix master. Aggiungere 18,5 ml della master mix all&#39;etubo ach PCR. </li><li> Aggiungere un primer forward (0,5 ml a 20 mm) con un codice a barre diverso per ciascuno dei campioni che saranno sequenziati insieme. Aggiungere 1 ml di campione (1-10 ng / mL) al tubo di PCR. </li><li> Porre i tubi in una macchina PCR ed eseguire il seguente programma: denaturazione iniziale a 95 ° C per 5 min; 25 cicli di 95 ° C per 30 sec, 55 ° C per 30 sec e 72 ° C per 45 sec; allungamento finale a 72 ° C per 10 min. I prodotti di PCR possono essere conservati a 4 ° CO / N o congelati fino al momento dell&#39;utilizzo. </li></ol> 2 Amplicon Purificazione, quantificazione e Pooling <ol><li> Preparare un gel di agarosio al 2% utilizzando più grandi pettini disponibili. Aggiungere 5 ml di gel loading dye 6x alla reazione e carico sul gel, separando ciascun campione da un pozzo vuoto. Attivare il gel a 70 V per 50 min. </li><li> Scatta una foto del gel e tagliare le bande (dimensioni previste circa 250 bp: 190 bp prodotto più di 63 adattatori bp e codici a barre) utilizzando un bisturi pulito. </li><li&gt; Pesare le bande asportati e procedere con l&#39;estrazione gel e purificazione dei prodotti di PCR (con, ad esempio, kit QIAquick Gel Extraction). </li><li> Quantificare ciascun prodotto PCR con PicoGreen e fare diluizioni per ottenere una soluzione madre a 5 x 10 9 molecole / ml (circa 1 ng / ml). Se alcuni campioni mostrano minore amplificazione, regolare le diluizioni ad una concentrazione più bassa, tenendo presente che la concentrazione più bassa adatto per le procedure successive è 1,57 x 10 7 molecole / ml (26 pM). </li><li> Pool 10 ml di ciascun prodotto di PCR diluito per ottenere una piscina equimolare di campioni. Preparare una piscina separata per ciascuna della corsa sequenza programmata. I prodotti della PCR in pool possono essere conservati nel congelatore fino al momento dell&#39;utilizzo. </li></ol> 3. Emulsione PCR e sequenziamento <ol><li> Eseguire emulsione PCR: <ol><li> Diluire i prodotti di PCR in pool a 26 pM in un volume di 25 microlitri. Scongelare i reagenti provenienti da un kit modello Ion PGM. </li><li> Preparare la miscela di emulsione PCR (reagenti forniti nel kit) in una cappa PCR e aggiungere i prodotti di PCR in pool e le particelle sfera (in dotazione) in panchina. Mescolare accuratamente e inserire il composto in una cartuccia filtrante e top accuratamente con olio emulsione (in dotazione). </li><li> Lentamente invertire la cartuccia del filtro e carico sul emulsione automatizzato PCR apparecchi (ad esempio, Ion Uno strumento Touch 2). Selezionare il programma appropriato e avviare la procedura. </li></ol></li><li> Dopo l&#39;emulsione automatizzato PCR è stata completata, rimuovere il surnatante dai tubi di raccolta e recuperare le particelle sfera sul fondo delle provette. Risospendere le sfere in 100 ml di soluzione di lavaggio (fornito nel kit) e prendere un aliquota di 2,0 microlitri per la libreria quantificazione. </li><li> Eseguire la quantificazione biblioteca. <ol><li> Mescolare 100 ml di tampone PESS (150 mM NaCl, 10mM NaPO 4, 1mM Na 2 -EDTA) con 2 ml di adattatore B&#39;-Fam (5&#39;-FAM -CTG AGA CTG CCA AGG CAC ACA GGG AGG GAT-3 &#39;) della sonda e 2 ml di Adapter A-Cy5 (5&#39;-Cy5 -CCA TCT CAT-3 CAG CCC TGC GTG TCT CCG ACT&#39; sonda). Aggiungere 52 ml di questa miscela per l&#39;aliquota di 2,0 microlitri preso nel passo 3.2 e aggiungere 2 ml di soluzione di lavaggio (dal kit modello) per i restanti 52 microlitri come un vuoto per la quantificazione. </li><li> Incubare a 95 ° C per 2 min, quindi a 37 ° C per 2 min. Trasferire le miscele in provette da 1,5 ml. </li><li> Aggiungere 1,0 ml di tampone TEX (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, 0,01% Triton X-100, pH 8.0), mescolare e centrifugare a 15.500 xg per 3 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante e lasciare 20 microlitri in ciascun tubo. Ripetere questa procedura di lavaggio due volte. </li><li> Aggiungere 180 ml di tampone TEX, risospendere le particelle di pellet e trasferirli in provette 500 microlitri Qubit. </li><li> Misurare la fluorescenza per FAM e Cy5 utilizzando un apparato Qubit e calcolare il rapporto delle sfere positive utilizzando la calcolatrice disponibile sul sito web Ion Comunità. </li></ol></li><li> Arricchisci il resto delle particelle sfera di sfere positivi (contenenti DNA amplificato) utilizzando un sistema di arricchimento automatico (ad esempio, Ion One Touch Enrichment System). <ol><li> Reagenti Dispensare nei pozzetti della strip 8-ben fornito: Bene 1: particelle sfera dal punto 3.2; Bene 2: pre-lavato perline MyOne streptavidina C1 (13 microlitri); Beh 3, 4 e 5: soluzione di lavaggio (fornito nel kit modello); Ben 6: vuota; Ben 7: fondere-off soluzione (NaOH 125 mM, 0,1% Tween 20); Ben 8: vuoto. </li><li> Installare un suggerimento sul braccio pipettaggio e un tubo di 0,2 ml per la raccolta del campione. Avviare lo strumento. Alla fine l&#39;arricchimento, aggiungere 10 ml di soluzione neutralizzante (fornito). Le sfere arricchite possono essere conservati a 4 ° C per un massimo di 15 giorni. </li></ol></li><li> Inizializzare lo strumento sequenza: <ol><li> Collegare allo strumento sequenziamento e preparare un piano di corsa di sequenziamento, specificando i dettagli della corsa sequenziamento. </li><li> Installarel la soluzione di lavaggio # 2 (fornita nel kit di sequenziamento Ion PGM), la soluzione di lavaggio # 1 (350 ml NaOH 100 mM) e la soluzione tampone di auto-pH (in dotazione). </li><li> Avviare la procedura di inizializzazione e quando viene richiesto aggiungere il dATP, dGTP dCTP e dTTP nucleotidi (in dotazione) nelle rispettive provette da 50 ml. Avvitare i tubi sulla macchina per il sequenziamento e continuare la procedura di inizializzazione. Quando l&#39;inizializzazione è completata, avvia immediatamente la procedura di esecuzione. </li></ol></li><li> Preparare i campioni per il sequenziamento e caricare il chip: <ol><li> Raccogliere le sfere arricchite dal punto 3.4 alla parte inferiore del tubo per centrifugazione a 15.500 xg per 1,5 min. Rimuovere il surnatante lasciando esattamente 3 ml. </li><li> Aggiungere 3 ml di sequenziamento Primer (fornito nel kit di sequenziamento), mescolare accuratamente pipettando su e giù per risospendere le particelle. Incubare a 95 ° C per 2 min, quindi a 37 ° C per 2 min. </li><li> Aggiungere 1 ml di polimerasi (in dotazione), mescolare bene e incubmangiato a temperatura ambiente per 5 min. Procedere per caricare la miscela di enzimi sfera sul chip sequenziamento entro 30 min. </li><li> Durante l&#39;incubazione, caricare il chip sequenza sul sequencer ed eseguire un controllo di qualità chip. Rimuovere il liquido dal chip per centrifugazione e caricare il campione nel chip lentamente pipeting premuto il mix enzima-sfera (7 ml) ed evitando l&#39;introduzione di bolle nel chip. </li><li> Centrifugare il chip per tre volte per 1 minuto in una microcentrifuga. Modificare l&#39;orientamento del chip ad ogni centrifugazione e mescolare pipettando su e giù tra ogni esecuzione. </li><li> Caricare il circuito integrato nello strumento e iniziare la corsa. </li></ol></li></ol> Analisi 4. base dei dati di sequenza <ol><li> Connettersi al server di dati di sequenziamento e scaricare il file FASTQ. Creare un file delimitato da tabulazioni &quot;oligo&quot; contenente le informazioni di fondo e di codici a barre (vedi esempio nella tabella 1). Scaricare i file di riferimento Greengenes dal Motsito Hur ( <a href="http://www.mothur.org/wiki/Taxonomy_outline">http://www.mothur.org/wiki/Taxonomy_outline</a> ). </li><li> Avviare Mothur ed eseguire analisi: <ol><li> Convertire il file FASTQ ad un FASTA e un file di qualità utilizzando il seguente comando: fastq.info (FASTQ = test.fastq) </li><li> Determinare l&#39;appartenenza al gruppo di ogni sequenza e tagliare le sequenze utilizzando il seguente comando: trim.seqs (FASTA = test.fasta, oligo = barcode.txt, qfile = test.qual, qwindowaverage = 20, qwindowsize = 50, minLength = 150, keepforward = T) </li><li> Le varie opzioni possono essere modificati secondo la severità desiderato </li><li> Classificare le sequenze del greengenes tassonomia utilizzando il seguente comando: classify.seqs (FASTA = test.trim.fasta, method = wang, gruppo = test.groups, template = gg_99_otus.fasta, tassonomia = gg_99_otus.tax, cutoff = 50) </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

<html> Il metodo presentato qui è semplice e poco costoso, e dovrebbe consentire a molti laboratori di accedere al potere di sequenziamento metagenomica. Anche se varia a seconda della piattaforma di sequenziamento utilizzate, una volta che le librerie sono costruite è richiesto molto poco hands-on tempo, con la maggior parte del processo di essere automatizzate. Per la piattaforma di sequenziamento qui utilizzato (Ion Torrent PGM), la procedura completa può essere eseguita in due giorni di lavoro. Al momento della scrittura (settembre 2013), i costi dei reagenti relativi all&#39;esempio sopra descritto sono stati i seguenti: amplificazione PCR di 36 campioni: $ 25, purificazione gel e DNA PicoGreen quantificazione di 36 campioni: $ 125, emulsione PCR per un campione ampliconi pool : $ 150 e reagenti di sequenziamento: $ 250, per un totale di $ 550 o $ 15 per campione o $ 0,0015 lettura qualità-filtrato. Questo prezzo non comprende contratto di strumento di servizio, gli ammortamenti strumento, stipendio tecnico e l&#39;utilizzo dello spazio in laboratorio. tenda &quot;&gt; Uno dei passi più importanti è quello di riunire tutti i prodotti in un rapporto equimolare, al fine di recuperare numero simile di letture per ciascuno dei campioni. PicoGreen quantificazione è stato utilizzato qui, ma altri metodi potrebbe essere adatto, anche se meno preciso (ad esempio, la quantificazione UV, quantificazione a base di gel). Anche facendo la quantificazione più accurata e messa in comune, vi è una certa variabilità nel numero di letture per campione, e nel tipico run indicato nella tabella 2, che varia da 4.380 a 32.750 legge, con una media di 10.338 letture. Se l&#39;elaborazione di gran numero di campioni (più di 40-50), singola colonna di purificazione gel può essere sostituito da purificazione gel in lamiera o di purificazione utilizzando perline con un taglio rigoroso dimensioni (ad esempio, AMPure perline) . Ad oggi, la tecnologia di sequenziamento di nuova generazione più utilizzato per il gene 16S rRNA è 454. tecnologia di sequenziamento La Ion Torrent utilizzato in questo protocollo è concettualmente molto similea 454 e le due tecnologie sono soggette allo stesso tipo di errori di sequenziamento. Non sorprendentemente, è stato dimostrato che il sequenziamento Ion Torrent portato risultati di sequenziamento molto simili a 454 sequenziamento 10. Recentemente, molti ricercatori hanno esplorato l&#39;uso della tecnologia Illumina per 16S rRNA gene ampliconi sequenziamento 18,19. In ogni caso, sarebbe facile per adattare l&#39;attuale protocollo per altri sequencer da banco come l&#39;Illumina MiSeq o la 454 GS Junior cambiando le sequenze dei primer fusione per abbinare gli adattatori e codici a barre necessari per queste tecnologie di sequenziamento, come nel metodo descritto recentemente per il Illumina MiSeq 19. In alternativa, i ricercatori potrebbero seguire i passi 1 e 2 del protocollo qui descritto e inviare i ampliconi pool a un centro di sequenziamento, dove sarebbero stati eseguiti l&#39;emulsione PCR e sequenziamento. Il gene 16S rRNA letture sono stati tagliati e classificati utilizzando Mothur, ma molte altre analisi può essere eseguita su16S rRNA ampliconi del gene. Ad esempio, la diversità beta può essere valutata calcolando le distanze Unifrac tra ogni coppia campione utilizzando la procedura descritta in <a href="http://unifrac.colorado.edu/">http://unifrac.colorado.edu/</a> 20. Alpha indici di diversità e il numero di unità tassonomiche operative di ciascun campione possono essere calcolati utilizzando strumenti all&#39;interno QIIME come AmpliconNoise 21 o utilizzando la procedura descritta da Huse et al. 22 e disponibili all&#39;interno Mothur. I primer usati qui amplificato le regioni variabili 3 e 4 del gene 16S rRNA, ma molte altre regioni potrebbero essere mirati. In questo studio, i geni 16S rRNA sono stati amplificati da materiale vegetale e la scelta di fondo è stata fatta per evitare l&#39;amplificazione del cloroplasto 16S rRNA gene 23,24. Vi è un&#39;ampia varietà di altri primer disponibili che variano in termini di durata del prodotto, potenza tassonomica e l&#39;utilità 25,26. Tuttavia, in tutti i casi 200-400 bp legge del gene 16S rRNA non può essere classificato in modo affidabile a livello di specie, e le analisi sono limitate al genere e livelli tassonomici più elevati. Altri geni potrebbero essere più appropriato se sono necessarie informazioni a livello di specie, come i cpn60 e rpoB geni 27,28. Future gocce drastici nel costo di sequenziamento e di aumenti nel potere di strumenti analitici potrebbero rendere fattibile sostituire 16S rRNA gene sequencing da metagenomica fucile, ma fino ad allora 16S rRNA sequenziamento del gene rimane il gold standard di microbiologia ambientale.

Sequenziamento metagenomiche è una tecnologia molto potente in quanto esso si rivolge la totalità delle informazioni genetiche contenute in un campione ambientale. Ci sono diversi gusti di sequenziamento metagenomica, tra cui shotgun sequencing, librerie di grandi inserti e amplicon sequenziamento. Amplicon sequenziamento offre il vantaggio di essere relativamente poco costoso, veloce e in grado di produrre legge da una singola regione genomica che può essere generalmente allineato. Inoltre, il flusso dei dati per il sequenziamento degli ampliconi è per lo più standardizzata. Tuttavia, poiché si basa sulla PCR, ha tutti i pregiudizi legati alla specificità incompleta, copertura incompleta e Primer polarizza 1,2, il che rende questo approccio semiquantitativo al meglio. Diverse regioni genomiche possono essere mirati per il sequenziamento degli ampliconi compresi i geni funzionali, ma le opzioni più popolari sono da utilizzare geni marcatori quali il gene 16S rRNA per generare un profilo di comunità. Tradizionalmente, 16S rRNA gene ampliconi sequencing è stata effettuata utilizzando tecniche di alta intensità di lavoro che comprendeva la clonazione in E. coli, colonia di raccolta ed estrazione plasmide seguita da Sanger sequenziamento sui plasmidi isolati, e, di conseguenza, la maggior parte degli studi analizzati meno di 100 cloni per campione. Sequenziamento di prossima generazione ha portato due importanti progressi: massiccia parallelizzazione delle reazioni di sequenziamento e, soprattutto, la separazione clonale di modelli senza la necessità di inserire frammenti di geni in un ospite. Questo ha semplificato enormemente il sequenziamento del 16S rRNA ampliconi del gene, che ora è tornato come una caratteristica di routine di molti studi di microbiologia ambientale, risultando in un &quot;rinascimento&quot; per il 16S rRNA gene ampliconi sequenziamento 3. Dal momento che l&#39;avvento di Roche 454 sequenziamento nel 2005 4, molte altre tecnologie di sequenziamento di prossima generazione sono apparsi sul mercato (ad esempio, Illumina, Solido, PacBio). Più recentemente, l&#39;introduzione della sequenza bancors portati a piccoli laboratori la capacità di sequenziamento, una volta esclusivo di grandi centri di sequenziamento. Cinque macchine da banco sono attualmente disponibili: la 454 GS Junior, la Ion Torrent Personal Genome automatico (PGM) e Proton, e la Illumina MiSeq e NextSeq 500 Mentre tutti questi sequencer offrono meno legge per corsa e un minor numero di basi per ogni dollaro di più pieno sequencer scala, sono più flessibili, rapidi, e le loro bassi costi di acquisizione e di esecuzione li rende alla portata di piccoli laboratori accademici. Sequencer da banco sono particolarmente adatte per ampliconi, piccolo genoma e bassa complessità metagenoma sequenziamento negli studi di microbiologia ambientale, perché questo tipo di studi in genere non richiede una profondità estrema di sequenziamento. Ad esempio, è generalmente accettato che per il 16S rRNA sequenziamento del gene studia il numero di letture per campione non è di primaria importanza, come ~ 1000 recita in grado di generare gli stessi schemi come multi-milioni di letture dataset 5. Detto questo, da banco di nuova generatio<html> n sequencer ancora generano grandi quantità di dati di sequenza, con rese massime di ~ 35 Mbp (454 GS Junior), ~ 2 Gbp (Ion Torrent PGM), ~ 10-15 Gbp (Ion Torrent Proton), ~ 10 Gbp (Illumina MiSeq) e ~ 100 GBP (Illumina Successivo Seq 500), che è più che sufficiente per la maggior parte degli studi di microbiologia ambientale. Sequenziamento di prossima generazione di ampliconi 16S rRNA utilizzando sequenziatori da banco è stata recentemente applicata a una vasta gamma di ambienti. Ad esempio, la Ion Torrent PGM è stata utilizzata per la comunità analisi di sterili di miniera di uranio che avevano particolarmente pH elevato e bassa permeabilità 6, dei sistemi di acquacoltura a ricircolo 7, di idrocarburi contaminati suoli artici 8,9, di sabbie petrolifere di estrazione sedimenti colpite e biofilm dal fiume Athabasca 10,11, della rizosfera di salici piantati in terreni contaminati 12, dei corpi umani e animali 13-16 e di digestori anaerobici 17. jove_content &quot;&gt; In questo contributo abbiamo dettaglio il nostro approccio alla sequenza 16S rRNA ampliconi del gene in casa utilizzando un banco sequencer di nuova generazione (la Ion Torrent PGM). Dopo l&#39;estrazione del DNA, i geni 16S rRNA sono amplificati utilizzando primer batteriche a livello di dominio che contengono adattatori di sequenziamento e, sequenze specifiche del campione unici (codici a barre). Gli ampliconi sono purificati, quantificati e riunite in un rapporto equimolare. I campioni aggregati vengono poi amplificati clonale in una emulsione PCR e sequenziati. sequenze risultanti vengono analizzati utilizzando strumenti bioinformatici disponibili al pubblico ( ad esempio, Mothur).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="544">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">Reagent</td>
			<td style="width:145px;">Company</td>
			<td style="width:128px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Ion 314 Chip Kit v2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:128px;">4482261</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Ion PGM Sequencing 200 Kit v2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:128px;">4482006</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Ion PGM Template OT2 200 Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:128px;">4480974</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HotStarTaq Plus Master Mix Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>203646</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primers and probes</td>
			<td style="width:145px;">IDT</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qiaquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA 20 mg/ml</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10,711,454,001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>65001</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

next-generation sequencing of 16s ribosomal rna gene amplicons

Una delle principali questioni in ecologia microbica è &quot;chi è là?&quot; Questa domanda si può rispondere utilizzando vari strumenti, ma uno degli standard d&#39;oro di lunga durata è quello di sequenziare ampliconi 16S RNA ribosomiale (rRNA) gene generati da-livello di dominio PCR Le reazioni di amplificazione di DNA genomico. Tradizionalmente, questo è stato eseguito da clonazione e Sanger (elettroforesi capillare) sequenziamento degli ampliconi della PCR. L&#39;avvento di sequenziamento di prossima generazione ha enormemente semplificato e aumentato la profondità di sequenziamento per 16S rRNA sequenziamento del gene. L&#39;introduzione di sequencer da banco permette ora piccoli laboratori per svolgere il loro 16S rRNA sequenza in-casa in una questione di giorni. Qui, un approccio per 16S rRNA gene ampliconi sequenziamento utilizzando un banco di nuova generazione sequencer è dettagliata. Il DNA ambientale viene prima amplificato mediante PCR utilizzando primer che contengono le schede di sequenziamento e codici a barre. Essi vengono poi accoppiati alle particelle sferiche tramite emulsione PCR. Le particelle sono loaded su un chip monouso ed il chip viene inserito nella macchina sequenziamento dopo di che viene eseguito il sequenziamento. Le sequenze vengono recuperati in formato FASTQ, filtrati ed i codici a barre vengono utilizzati per stabilire l&#39;appartenenza campione della legge. Il filtrato e categorizzata letture vengono poi ulteriormente analizzati utilizzando gli strumenti disponibili pubblicamente. Un&#39;analisi esempio in cui la legge sono stati classificati con un algoritmo di tassonomia trovare all&#39;interno del pacchetto software Mothur è dato. Il metodo qui descritto è semplice, poco costoso e semplice e dovrebbe aiutare i laboratori più piccoli di trarre vantaggio dalla rivoluzione genomica in corso.

Dopo purificazione su gel, con 25 cicli di amplificazione PCR, i prodotti di amplificazione sono generalmente ad una concentrazione di 0,2-10,0 ng in 50 ml di acqua. Questo può variare notevolmente a seconda della concentrazione di DNA di partenza, il tipo di campione e il kit di purificazione utilizzato. Si raccomanda di mantenere il numero di cicli di PCR per il più basso possibile per evitare la formazione chimera e diminuire pregiudizi amplificazione, tenendo presente che tutti i campioni devono essere amplificati utilizzando lo stesso numero di cicli. Per ridurre al minimo il numero di policlonale letture e sfere vuote e massimizzare il numero di letture, il rapporto Qubit deve essere compresa tra 0,1 e 0,3 e la fluorescenza FAM deve essere superiore a 200 314 Utilizzo di un chip su una Ion Torrent PGM, la produzione media è di circa 0,3-0,5 M buona qualità legge dopo il filtraggio dei risultati in Mothur. Tabella 2 mostra una tipica composizione del numero di letture dopo ogni fase della procedura per una corsa contenente 36 ambienti multiplexaticampioni mentali amplificato con primer mira la regione V3-4 delle 16S e analizzati utilizzando Mothur. In Mothur, la procedura trim.seqs generare un file &quot;* .trim.fasta&quot; che contiene le sequenze che passavano i filtri di qualità e un &quot;* .scrap.fasta&quot; che contiene le sequenze che non ha superato i filtri di qualità con la ragione di reiezione in sequence header. Quando fornito con codici a barre nel file &quot;oligo&quot;, questo comando genererà anche un file &quot;* .Gruppi&quot; che contiene l&#39;appartenenza al gruppo di ogni sequenza in base alla sequenza di codice a barre. La procedura classify.seqs genera un &quot;.tax.summary&quot; che può essere aperto in Excel. Questo file contiene il riassunto della appartenenza tassonomica (in linee) per ciascuno dei campioni (nelle colonne). Questo file può essere utilizzato per analisi statistiche a valle e di visualizzare composizione della comunità a vari livelli tassonomici. Il file &quot;.taxonomy&quot; contiene il tassonomica dettagliataaffiliazione per ogni sequenza. La composizione media della comunità a livello di phylum / classe in tutti i 36 campioni è mostrato in Figura 1. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51709/51709fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1 Composizione media comunitaria a livello di phylum / classe per tutti i campioni. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="248"><colgroup><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:64px;"> avanti </td><td style="width:139px;"> TACGGRAGGCAGCAG </td><td style="width:47px;"></td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> codice a barre </td><td> CTAAGGTAAC </td><td> Sample01 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> codice a barre </td><td> TAAGGAGAAC </td><td> Sample02 </td></tr><tr height = &quot;20&quot;&gt; <td height="20" style="height:20px;"> codice a barre </td><td> AAGAGGATTC </td><td> Sample03 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> codice a barre </td><td> TACCAAGATC </td><td> Sample04 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> codice a barre </td><td> CAGAAGGAAC </td><td> Sample05 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> codice a barre </td><td> CTGCAAGTTC </td><td> Sample06 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> codice a barre </td><td> TTCGTGATTC </td><td> Sample07 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> codice a barre </td><td> TTCCGATAAC </td><td> Sample08 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> codice a barre </td><td> TGAGCGGAAC </td><td> Sample09 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> codice a barre </td><td> CTGACCGAAC </td><td> Sample10 </td></tr></tbody></table> Tabella 1 Esempio di file &quot;oligo&quot; per l&#39;uso in Mothur. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="660"><colgroup><col /><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"></td><td style="width:67px;"> # Di legge </td><td style="width:123px;"> % Del passo precedente </td><td style="width:107px;"> Avg. per campione </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> Numero di pozzi </td><td align="center"> 1262519 </td><td> - </td><td align="center"> 35.070 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> Wells con perline </td><td align="center"> 1114108 </td><td align="center"> 88.20% </td><td align="center"> 30.947 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> Perline con i modelli </td><td align="center"> 1112746 </td><td align="center"> 99.90% </td><td align="center"> 30.910 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> Perline monoclonali </td><td align="center"> 826.805 </td><td align="center"> 74.30% </td><td align="center"> 22.967 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> Buona qualità legge (uscita dal sequencer) </td><td align="center"> 782.204 </td><td align="center"> 94.60% </td><td align="center"> 21.728 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;"> (Lunghezza di 150bp min. Media. Punteggio di qualità di 20 su una finestra 50bp, min.) Passo Mothur filtri </td><td align="center"> 372.168 </td><td align="center"> 47.60% </td><td align="center"> 10.338 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;"> Classificato al livello di phylum in GreenGenes (il 50% della soglia di confidenza) </td><td align="center"> 342.171 </td><td align="center"> 91.90% </td><td align="center"> 9505 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;"> Classificata a livello familiare in GreenGenes (il 50% della soglia di confidenza) </td><td align="center"> 316.512 </td><td align="center"> 92.50% </td><td align="center"> 8.792 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;"> Classificato al livello di genere in GreenGenes (il 50% della soglia di confidenza) </td><td align="center"> 289.899 </td><td align="center"> 91.60% </td><td align="center"> 8053 </td></tr></tbody></table> Tabella 2 Numero di letture prodotte da una corsa tipica per 36 campioni ambientali multiplexing su una Ion Torrent 314 chip.

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Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

Sequenziamento di prossima generazione del 16S RNA ribosomiale Gene ampliconi

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

83.2K Views.  National Research Council Canada. Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer. 

Video: Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the subcellular distribution of a specific tagged fluorescent marker in the secretory pathway. Arabidopsis is a powerful biological model for genetic studies because of its genome size, generation time, and conservation of molecular mechanisms among kingdoms. The array genotyping as an approach to map the mutation in alternative to the traditional method based on molecular markers is advantageous because it is relatively faster and may allow the mapping of several mutants in a really short time frame. This method allows the identification of proteins that can influence the integrity of any organelle in plants. Here, as an example, we propose a screen to map genes important for the integrity of the endoplasmic reticulum (ER). Our approach, however, can be easily extended to other plant cell organelles (for example see1,2), and thus represents an important step toward understanding the molecular basis governing other subcellular structures.

A fundamental quest in cell biology is to define the mechanisms that underlie the identity of the organelles that make eukaryotic cells. Here we propose a method to identify the genes responsible for the morphological and functional integrity of plant organelles using fluorescence microscopy and next-generation sequencing tools.

Microscopia a fluorescenza-Screening e sequenziamento di prossima generazione: Strumenti utili per l&#39;identificazione di geni coinvolti in organelli Integrity

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Ricerca

Biologia

Depletion of Ribosomal RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity and functionality of the gut community will provide insight into the effects of gut microbiota on mosquito life traits. Metagenomic RNA-Seq has become an important tool to analyze transcriptomes from various microbes present in a microbial community. Messenger RNA usually comprises only 1-3% of total RNA, while rRNA constitutes approximately 90%. It is challenging to enrich messenger RNA from a metagenomic microbial RNA sample because most prokaryotic mRNA species lack stable poly(A) tails. This prevents oligo d(T) mediated mRNA isolation. Here, we describe a protocol that employs sample derived rRNA capture probes to remove rRNA from a metagenomic total RNA sample. To begin, both mosquito and microbial small and large subunit rRNA fragments are amplified from a metagenomic community DNA sample. Then, the community specific biotinylated antisense ribosomal RNA probes are synthesized in vitro using T7 RNA polymerase. The biotinylated rRNA probes are hybridized to the total RNA. The hybrids are captured by streptavidin-coated beads and removed from the total RNA. This subtraction-based protocol efficiently removes both mosquito and microbial rRNA from the total RNA sample. The mRNA enriched sample is further processed for RNA amplification and RNA-Seq.

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Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

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We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

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We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

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Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

Mirati RNA Sequencing test per caratterizzare espressione genica e genomica Alterazioni

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. Deviations from what is considered a healthy microbiota composition (dysbiosis) may impair vital functions leading to pathologic conditions. Recent and ongoing research efforts have been directed toward the characterization of associations between microbial composition and human health and disease.
Advances in high-throughput sequencing technologies enable characterization of the gut microbial composition. These methods include 16S rRNA-amplicon sequencing and shotgun sequencing. 16S rRNA-amplicon sequencing is used to profile taxonomical composition, while shotgun sequencing provides additional information about gene predictions and functional annotation. An advantage in using a targeted sequencing method of the 16S rRNA gene variable region is its substantially lower cost compared to shotgun sequencing. Sequence differences in the 16S rRNA gene are used as a microbial fingerprint to identify and quantify different taxa within an individual sample.
Major international efforts have enlisted standards for 16S rRNA-amplicon sequencing. However, several studies report a common source of variation caused by batch effect. To minimize this effect, uniformed protocols for sample collection, processing, and sequencing must be implemented. This protocol proposes the integration of broadly used protocols starting from fecal sample collection to data analyses. This protocol includes a column-free, direct-PCR approach that enables simultaneous handling and DNA extraction of large numbers of fecal samples, along with PCR amplification of the V4 region. In addition, the protocol describes the analysis pipeline and provides a script using the latest version of QIIME (QIIME 2 version 2017.7.0 and DADA2). This step-by-step protocol is aimed to guide those interested in initiating the use of 16S rRNA-amplicon sequencing in a robust, reproductive, easy to use, detailed way.

This manuscript describes a detailed standardized protocol of high-throughput 16S rRNA-amplicon sequencing. The protocol introduces an integrated, uniformed, feasible, and inexpensive protocol starting from fecal sample collection through data analyses. This protocol enables analysis of large numbers of samples with rigorous standards and several controls.

Protocollo guidata per caratterizzazione microbica fecale mediante sequenziamento del 16S rRNA-amplicone

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. ...

Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to poorly folding proteins or random open reading frames. We have developed a strategy where, by using TEM-1 &#946;-lactamase (the enzyme conferring ampicillin resistance) on a genomic scale, we can select collections of correctly folded protein domains from the coding portion of the DNA of any intronless genome. The protein fragments obtained by this approach, the so called &#34;domainome&#34;, will be well expressed and soluble, making them suitable for structural/functional studies.
By cloning and displaying the &#34;domainome&#34; directly in a phage display system, we have showed that it is possible to select specific protein domains with the desired binding properties (e.g., to other proteins or to antibodies), thus providing essential experimental information for gene annotation or antigen identification.
The identification of the most enriched clones in a selected polyclonal population can be achieved by using novel next-generation sequencing technologies (NGS). For these reasons, we introduce deep sequencing analysis of the library itself and the selection outputs to provide complete information on diversity, abundance and precise mapping of each of the selected fragment. The protocols presented here show the key steps for library construction, characterization, and validation.

The protocols described allow the construction, characterization and selection (against the target of choice) of a &#34;domainome&#34; library made from any DNA source. This is achieved by a research pipeline that combines different technologies: phage display, a folding reporter and next generation sequencing with a web tool for data analysis.

Interactoma-Seq: Un protocollo per la costruzione della libreria Domainome, la convalida e la selezione di Phage Display e sequenziamento di nuova generazione

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to ...

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective and widely available vaccines are lacking for a majority of these diseases, necessitating the development of novel disease mitigation strategies. To this end, a promising avenue of disease control involves targeting the vector microbiome, the community of microbes inhabiting the vector. The vector microbiome plays a pivotal role in pathogen dynamics, and manipulations of the microbiome have led to reduced vector abundance or pathogen transmission for a handful of vector-borne diseases. However, translating these findings into disease control applications requires a thorough understanding of vector microbial ecology, historically limited by insufficient technology in this field. The advent of next-generation sequencing approaches has enabled rapid, highly parallel sequencing of diverse microbial communities. Targeting the highly-conserved 16S rRNA gene has facilitated characterizations of microbes present within vectors under varying ecological and experimental conditions. This technique involves amplification of the 16S rRNA gene, sample barcoding via PCR, loading samples onto a flow cell for sequencing, and bioinformatics approaches to match sequence data with phylogenetic information. Species or genus-level identification for a high number of replicates can typically be achieved through this approach, thus circumventing challenges of low detection, resolution, and output from traditional culturing, microscopy, or histological staining techniques. Therefore, this method is well-suited for characterizing vector microbes under diverse conditions but cannot currently provide information on microbial function, location within the vector, or response to antibiotic treatment. Overall, 16S next-generation sequencing is a powerful technique for better understanding the identity and role of vector microbes in disease dynamics.

Here we present a next-generation sequencing protocol for 16S rRNA sequencing which enables identification and characterization of microbial communities within vectors. This method involves DNA extraction, amplification and barcoding of samples through PCR, sequencing on a flow-cell, and bioinformatics to match sequence data to phylogenetic information.

Tick Microbiome caratterizzazione ordinando Amplicon del rRNA 16S di prossima generazione

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

Analisi microbiota utilizzando PCR in due fasi e sequenziamento genico rRNA 16S di nuova generazione

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...