I mitocondri sono organelli essenziali di cellule eucariotiche in grado di respirare aerobicamente. La loro disfunzione è una fonte ben nota di malattie umane. I mitocondri di lievito di Baker contengono genoma circolare che codifica per otto proteine.
In questo video, abbiamo descritto il protocollo utilizzato per saggiare la biosintesi proteica nei mitocondri del lievito attraverso l'etichettatura radioattiva di prodotti traslazionali e la successiva separazione per elettroforesi gel. La procedura prevede diversi passaggi principali. Striato lievito da colture di stock congelati su piatti freschi con mezzo appropriato.
Mettere le piastre nell'incubatore di coltura a 30 gradi per 24-48 ore. Inoculare queste colture in due millilitri di mezzo dalla striscia fresca in un tubo da 15 millilitri e incubarle durante la notte agitando a 200 giri/min a 30 gradi. Misurare la densità ottica della coltura alla lunghezza d'onda di 600 nanometri.
Prendere il volume corrispondente a 0,2 unità di assorbenza in tubi sterili Palette cellule di lievito a 9.000 G per 30 secondi a temperatura ambiente. Scartare questo supernatante. Lavare le cellule con 0,5 millilitri di acqua sterile vortice per cinque secondi.
Pallettizzazione delle cellule di lievito a 9.000 G per 30 secondi a temperatura ambiente. Scartare il supernatante. Diluire le cellule in due millilitri di mezzo agar fresco.
Incubare il bordo prelevato a 200 RPM e 30 gradi fino a quando la densità ottica raggiunge da 1,5 a 1,9 da 1,5 a 1,9 valori. Trasferire il volume di coltura equivalente a un'unità ottica in un tubo di micro centrifuga. Ruotare i tubi a 3000 G per un minuto.
Scartare il supernatante. Lavare le cellule con 0,5 millilitri di acqua sterile vortice per cinque secondi. Pallettare le cellule di lievito a 9.000 G per 30 secondi a temperatura ambiente Scartare il supernatante.
Sospendere di nuovo le cellule di lievito in 0,5 millilitri di tampone di traduzione sterile. Posizionare la sospensione in un tubo da 15 millilitri. Aggiungere cicloeximide alla sospensione cellulare fino alla concentrazione finale di 0,2 milligrammi per millilitro Incubare per cinque minuti bordo assunto a 200 RPM e 30 gradi per inibire la traduzione citosolica.
Aggiungere da 25 a 30 Aggiungere da 25 a 30 microcurie di metinina S35 di metinina S35 alla sospensione cellulare e incubare per 30 minuti bordo prelevato a 200 RPM e 30 gradi. Aggiungere meionina fredda senza etichetta e borimicina per interrompere l'etichettatura Incubate per 10 minuti di bordo prelevato a 200 giri/min e 30 gradi. Raccogliere le cellule di lievito per centrifugazione a 9.000 G per 30 secondi.
Lavare le cellule con 0,5 millilitri di acqua sterile vortice per cinque secondi. Pallettizzazione delle cellule di lievito a 9.000 G per 30 secondi a temperatura ambiente. Scartare il supernatante.
Aggiungere 75 microlitri di tampone di lysis alla tavolozza e al vortice per cinque o 10 secondi. Aggiungere 500 microlitri di 0,5 tris tampone molare di 0,5 tris buffer molare con pH 6.8. Con pH 6.8.
Vortice brevemente. Aggiungere 600 microlitri di metanolo al campione. Vortice per cinque secondi.
Aggiungere 150 microlitri di cloroformio al campione. Vortice per cinque secondi. Centrifugare i campioni per due minuti a 12.000 G.Scartare accuratamente l'opaface con un campionatore.
Aggiungere 600 microlitri di metanolo al campione. Mescolare con attenzione invertendo il tubo più volte. Centrifuga i campioni per due minuti a 12.000 G.Discard supernatant.
Asciugare all'aria la pallette per due minuti a 80 gradi. Sciogliere le proteine precipitate in 60 microlitri di tampone campione Laemmli. Riscaldare i campioni per 10 minuti a 14 gradi.
Causare il gel di poliacrilammide Laemmli SDS al 17,5%. Caricare 15 microlitri di ogni campione nelle tasche. Eseguire il gel nella cella frigorifere fino a quando il colorante blu raggiunge circa il 65% della linfa gel.
Macchia il gel con Kumasi blu brillante e fai la scansione o la foto che è richiesta come controllo del carico. Asciugare il gel nell'essiccatore a gel. Tienilo nella cassetta con schermo di fosforo di archiviazione per tre o cinque giorni.
Scansiona lo schermo su un imager al fosforo. Seguendo il protocollo sopra descritto, abbiamo assegnato prodotti di traduzione mitocondriale da due ceppi di Saccharomyces cerevisiae. Il tipo selvatico e la variante mutante soppressioni del gene Aim23 che codifica per l'iniziazione alla traduzione mitocondriale fattore tre.
I prodotti di traduzione mitocondriale erano già attivamente etichettati e separati nel gel di poliacrilammide denaturante. I campioni venivano raccolti ogni due minuti e mezzo prima della saturazione per costruire il corso di tempo. Il gel è stato macchiato, asciugato e schermato dopo l'esposizione di cinque giorni.
Nel caso di un esperimento riuscito, l'immagine mostra otto bande assegnate secondo il modello standard. Tuttavia, le intensità delle singole bande possono essere altamente variabili a seconda della deformazione e delle condizioni sperimentali. Ogni banda corrisponde a un prodotto di traduzione.
I dati suggeriscono che il ceppo mutante è in grado di sintesi proteica mitocondriale perché tutti i prodotti che appaiono nel tipo selvaggio sono visibili in questo mutante. Tuttavia, le intensità delle bande sono diverse dal tipo selvaggio, il che significa che questa cancellazione di Aim23 influenza l'espressione genica mitocondriale. Kumasi è stato preparato in macchia blu e funge da controllo del carico.
Il loro risultato nei dati può essere quantificato per identificare le differenze tra ceppi o condizioni sperimentali utilizzando il software Image G o Image Quan. Per questi, il rapporto del segnale corrispondente a ogni prodotto viene calcolato al segnale totale. I valori medi e le deviazioni standard sono calcolati in almeno tre esperimenti indipendenti.
La cinetica della proteina sintetizzata girata è studiata in un esperimento dell'anno scorso. I campioni vengono raccolti nei punti di tempo indicati dopo che la reazione di etichettatura è stata interrotta dalla meionina fredda e dalla borimicina. Questo controllo è necessario per stimare la stabilità del prodotto.
La colorazione immuno-con anti-porina un anticorpo è un controllo del carico. Abbiamo descritto il metodo, che viene spesso utilizzato per studiare la biosintesi proteica nei mitocondri del lievito. Questo protocollo è relativamente semplice e veloce da eseguire.
Allo stesso tempo, consente di ottenere informazioni preziose sul tasso di traduzione di quattro mRNA mitocondriali di lievito, il che è altamente vantaggioso. Tuttavia, ha diverse limitazioni che richiedono ulteriori esperimenti e si trova in questi livelli interstatali di proteine e mRNA. Può fornire le informazioni su queste funzioni nel sistema di traduzione mitocondriale, ma dovrebbero essere utilizzate tecniche più avanzate per scoprire il meccanismo.
