Qui, dimostriamo il metodo Updegraff, il metodo più utilizzato al mondo per la stima del contenuto cristallino di cellulosa. La cellulosa è fondamentalmente composta da monomeri di glucosio collegati da beta-1, 4 legami glicosidici. Abbiamo diviso questo protocollo in cinque fasi.
Nella prima fase, prepariamo il materiale della biomassa vegetale. Nella seconda fase estraiamo la parete cellulare grezza. Nella terza fase, utilizziamo il trattamento Updegraff in cui Updegraff è composto da acido acetico e acido nitrico che aiuta nella rimozione di emicellulosa e lignina dai nostri campioni.
Nella quarta fase, lo sottoscrivamo all'idrolisi acida con l'aiuto di acido solforico che produce i monomeri di glucosio. Infine, nella quinta fase, usiamo il saggio dell'antronrone per stimare il contenuto cristallino di cellulosa. Raccogliere il materiale vegetale dalla serra, lavarlo accuratamente con acqua, asciugare all'aria per due giorni, separare il tessuto e trasferire il tessuto nei contenitori etichettati individualmente e incubare nell'incubatrice a 49 gradi centigradi per 10 giorni.
Quindi, infine, tagliare a pezzi usando forbici o lama. Congelare il tessuto e caricarlo in malta e pestello per la macinazione fine in polvere uniforme o, in alternativa, utilizzare Freezer / Mill. Qui dimostriamo di utilizzare Freezer / Mill, quindi carichiamo i nostri campioni di tessuto in queste fiale di rettifica e li posizionare nel congelatore / mulino ed eseguiamo la velocità di 10 CP per tre cicli.
La polvere di tessuto viene raccolta nel tubo Falcon come mostrato qui. Pesare 20 mg di polvere di tessuto e trasferirlo in un tubo pre-pesato da due ml. Aggiungere un mL di tampone di solubilizzazione proteica per rimuovere le proteine. vortice.
Centrifuga a 15.000 giri/min per cinque minuti. Scartare il supernatante. Ripetere questo passaggio altre due volte.
Aggiungere un mL di acqua sterile al pellet trattenuto. vortice. Centrifuga a 15.000 giri/min per cinque minuti. Ripetere questo passaggio altre due volte.
Aggiungere una ML di 70% di etanolo al pellet trattenuto. vortice. Trasferire in un blocco centigrado preriscaldato di 70 gradi con scuotimento simultaneo per un'ora. Dopo un'ora di incubazione, centrifugare a 15.000 giri/min per cinque minuti.
Ripetere questo passaggio ancora una volta. Al pellet salvato aggiungere un mL di metile al 100%. vortice. Centrifuga a 15.000 giri/min per cinque minuti.
Aggiungere un mL di metanolo cloroformio. vortice. Centrifuga a 15.000 giri/min per cinque minuti. Scartare il supernatante e aggiungere un mL di acetone. vortice.
Incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Centrifuga a 15.000 giri/min per cinque minuti. Ri-scartare il supernatante e asciugarlo all'aria a 37 gradi centigradi durante la notte o continuare con l'essiccazione sottovuoto.
Caricare i campioni nell'essiccatore sottovuoto e asciugare all'aria per due o tre ore o fino a quando il pellet non è completamente asciutto. Pesare cinque mg dell'estratto della parete cellulare ottenuto dal passaggio precedente. Trasferire in un tubo a vite da due ml.
Includere anche il controllo positivo a questo punto. Usa due mg di carta filtrante Whatman per questo scopo. Trasferimento su un tubo a vite da due ml.
Aggiungere 1,5 mL di reagente Updegraff a ogni estratto di parete cellulare pesato. Vortice e incubare a 100 gradi centigradi in un blocco preriscaldato per 30 minuti. Dopo 30 minuti di incubazione, trasferire su un rack.
Lasciare raffreddare in panchina per 10 minuti. Centrifuga a 15.000 giri/min per 10 minuti. Scartare il supernatante senza disturbare il pellet.
Aggiungere un mL di acqua sterile. vortice. Centrifuga a 15.000 giri/min per 10 minuti. Scartare 500 microlitri del supernatante.
Aggiungere un mL di acetone. vortice. Centrifuga a 15.000 giri/min per cinque minuti. Scartare un mL del supernatante.
Aggiungere un mL di acetone. vortice. Centrifuga a 15.000 giri/min per cinque minuti. Scarta completamente il supernatante.
Aggiungere un mL di acetone. vortice. Centrifuga a 15.000 giri/min per cinque minuti. Scartare il supernatante.
Asciugare a 37 gradi centigradi durante la notte. Dopo un'incubazione di una notte, trasferire su un rack. Aggiungere un mL di acido solforico al 67%. vortice.
Incubare a 25 gradi centigradi per un'ora con scuotimenti simultanei. Dopo un'ora di incubazione, assicurarsi che il pellet sia completamente sciolto. Trasferimento su un rack.
Questa è la fase finale dell'estrazione della cellulosa. Ora i campioni sono pronti per la diluizione del campione. Per la diluizione del campione, utilizzare 10 microlitri di ciascun campione del passaggio precedente e aggiungere 490 microlitri di acqua sterile.
Ripetere questa procedura per tutti i campioni sperimentali. Per la preparazione della curva standard del glucosio, preparare uno stock fresco di un mg per mL di glucosio e preparare zero microgrammi a 200 microgrammi di concentrazioni aggiungendo un mg per mL di glucosio in incrementi di 20 microliter e copportare il volume finale a un mL con acqua sterile. Prendere 500 microliter di ogni standard preparato in un tubo a vite e aggiungere un mL 0,2% di antronrone.
E ora i campioni sono pronti per il test dell'antronrone. Aggiungere un mL di antronrone appena preparato. Mescolare immediatamente con vortice e trasferimento sul ghiaccio.
Ripetere per tutti gli standard e campioni allo stesso modo. Quindi trasferire in un blocco centigrado preriscaldato di 100 gradi per 10 minuti. Dopo 10 minuti di incubazione, trasferire sul ghiaccio e incubare per cinque minuti sul ghiaccio.
Dopo l'incubazione, assumere 200 microlitri di ogni campione in tre repliche. Ripetere per entrambi gli standard e campioni allo stesso modo. E una piastra carica da 96 po' è stata caricata in un rilevatore multimodale.
Utilizzando il programma Smart Max Pro, abbiamo impostato l'impostazione del filtro su 620 nanometri. Tipo di piastra a tipo 96-well. Selezionare tutta l'area di lettura.
Fare clic su OK. leggere. Leggi il piatto. Si ottengono le letture di assorbanza di standard e campioni, che verranno raccolte nella scheda excel per ulteriori analisi e stime del contenuto di cellulosa.
La curva standard del glucosio viene preparata utilizzando le concentrazioni di glucosio in microgrammi per mL sull'asse x e i valori di assorbanza normalizzati della rispettiva concentrazione a 620 nanometri sull'asse y. Otteniamo la linea di regressione con valori m e c nel grafico a dispersione tracciato che usiamo per stimare il contenuto di cellulosa cristallina del campione. Nel primo passo, abbiamo fatto una media dei valori di OD a 620 nanometri.
E poi abbiamo normalizzato i dati sottraendo il valore vuoto. Calcoliamo la concentrazione di glucosio usando la formula x è uguale a OD meno c/m dove colleghiamo i valori c e m dal passo precedente della linea di regressione nella curva standard. Poiché il volume totale utilizzato per il test dell'antronrone è di 500 microlitri, lo dividiamo per fattore di diluizione due.
Poiché il volume del campione utilizzato era di soli 10 microlitri, divideremo ulteriormente per 10 per ottenere microgrammi per concentrazione di microlitri di glucosio che è uguale a mg per concentrazione di mL. E poi abbiamo usato il fattore di umidità 1.11 che è il guadagno di umidità nel processo. E infine, calcoliamo il contenuto di cellulosa cristallina percentuale dividendolo con il peso della parete cellulare, che è vicino a cinque mg, e moltiplichiamo per 100 per ottenere la percentuale.
Poi abbiamo mediato il contenuto cristallino di cellulosa di tre repliche biologiche per ottenere il valore per i singoli campioni, che verrà confrontato con un'altra media di linea sperimentale di tre repliche biologiche. E il test t può essere usato per testare il loro livello di significatività. Qui nella tabella A, mostriamo i valori della tabella della concentrazione e del rispettivo OD a 620 nanometri, che è stato ulteriormente utilizzato per tracciare un grafico a dispersione e una linea di regressione con i valori m e c che sono stati utilizzati in C per ottenere le differenze di contenuto di cellulosa tra le due linee sperimentali.
In conclusione, entrambi i campioni mostrano differenze di cellulosa. Grazie per l'attenzione.
