La rappresentazione microscopica è stata condotta tramite i servizi della Michigan State University Center for Advanced Microscopia. Il mais callo è stato acquistato dalla trasformazione centro di mais dell&#39;Iowa State University. Gli autori desiderano ringraziare Jeffrey R. Weatherhead della MSU Plant Research Laboratory per la sua assistenza tecnica per l&#39;analisi dei carboidrati. Questa ricerca è stata generosamente finanziata dal Programma Corn Marketing del Michigan (CMPM) e il Consorzio per la Plant Biotechnology Research (CPBR).

1. Preparazione di dsRNAi costrutti utilizzati per la down-regolazione di ZmCCR1 <ol><li> Gene disegno primer specifici, tra cui i siti necessari enzimi di restrizione per fare un dsRNAi costruire knock-out del gene ZmCCR1. Due set di primer sono stati progettati per amplificare due segmenti frammento di ZmCCR1 cDNA:. Un frammento di 523 bp dal nucleotide 748-1271, e un frammento di 285 bp dal nucleotide 986-1271 La ZmCCR1 cDNA è stato fornito dal Genome Institute dell&#39;Arizona (AGI). Ulteriori dettagli sono descritti in Figura 1. </li><li> Amplificare il grande frammento da polymerase chain reaction (PCR) dal modello ZmCCR1 cDNA utilizzando i primer ZmCCR1_748F_BglII (5&#39;-AGATCTACATCCTCAAGTACCTGGAC-3 &#39;) e ZmCCR1_1271R_NcoI (5&#39;-CCATGGTTTACACAGCAGGGGAAGGT-3&#39;). Amplificare il frammento più piccolo (285 bp) utilizzando i primers ZmCCR1_986F_BglII (5&#39;-AGATCTGGAAGCAGCCGTACAAGTTC-3 &#39;) e un ZmCCR1_1271R_SacI (5R17;-GAGCTCTTTACACAGCAGGGGAAGGT-3 &#39;). </li><li> Legare autonomamente i frammenti in pGEM-T facile seguendo le istruzioni del produttore. </li><li> Eseguire mini-prep plasmide isolamento del DNA dai singoli trasformanti, ciascuna contenente il pGEM-T costruisce utilizzando un kit mini-prep commerciali plasmide. </li><li> Digerire sia la pGEM-T :: ZmCCR1 (523 bp) e ImpactVector (IV) -1.1 (espressione citoplasma vector) sia con BglII e NcoI. </li><li> Legare il grande digerito purificato su gel ZmCCR1 frammento (523 bp) nel gel digerito purificato IV-1.1. </li><li> Digerire il pGEM-T :: ZmCCR1 (285 bp) e IV-1.1 :: ZmCCR1 (523 bp) sia con BglII e SacI per inserire il frammento piccolo nel IV-1.1 :: ZmCCR1 (523 bp). </li><li> Legare la piccola gel digerito purificato frammento ZmCCR1 (285 bp) nel gel digerito purificato IV-1.1 :: ZmCCR1 (523 bp). </li><li> Clonare sia 523 bp e 285 bp frammentazionets nel IV-1.1 per rendere il ZmCCR1 RNAi costruire, che ha una sequenza ripetuta invertita 285 bp con un distanziale 238 bp nel mezzo dei frammenti di ripetizione invertiti (vedi Figura 1). </li><li> Trasferire questo costrutto in Escherichia coli (E. coli), farle crescere ed eseguire una taglia plasmide isolamento del DNA midi-prep per ottenere abbastanza DNA plasmidico per il mais trasformazione genetica. </li></ol> 2. Granturco trasformazione genetica <ol><li> Preparazione di particelle di tungsteno <ol><li> Porre 60 mg di perle di tungsteno (M10) in una provetta da 1,5 ml e lavare con 1 ml di etanolo al 70% vortexando per 2 min. Incubare per 10 min a 23 ° C e poi centrifugare a 18.894 xg per 2 minuti e scartare il surnatante. </li><li> Lavare 3x con 1 ml di etanolo al 100%, centrifugazione per 2 min e scartare il surnatante. Aggiungere 1 ml di glicerolo sterile 50% per portare la concentrazione di microparticelle a 60 mg / ml. </li></ol></li><li> Preparazione di DNA per Bombardamento <ol><li> Place 50 microlitri (3 mg) di perline di tungsteno preparati nel 50% glicerolo in una provetta da 1,5 ml. Aggiungere 5 ml (1 mg), del IV-1.1 :: ZmCCR1 RNAi DNA plasmidico, 50 ml di 2,5 M CaCl 2, e 20 ml di 0,1 M spermidina. Vortex brevemente tra ogni aggiunta dei reagenti di cui sopra. </li><li> Vortex il tungsteno tallone-DNA miscela brevemente e centrifugare a 18.894 xg per 30 sec. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 140 ml di etanolo al 70%. Rimuovere il liquido e scartare. Aggiungere 140 ml di etanolo al 100%. Rimuovere il liquido e scartare. </li><li> Aggiungere 48 ml di etanolo al 100%. Utilizzare immediatamente o conservare in ghiaccio fino a 4 ore prima del bombardamento. </li></ol></li><li> Bombardamento <ol><li> Posizionare un calli di mais embriogenica di 3-5 cm di diametro Hi-II (fornito da granturco trasformazione Center of Iowa State University) nel bel mezzo di 100 millimetri piastre Petri contenenti supporti N6OSM 32 (osmotium) almeno 4 ore prima del bombardamento. </li><li> Prepae il PSD-1000/He dispositivo Particle consegna secondo le istruzioni del produttore 33. </li><li> Sterilizzare parete della camera con il 70% di etanolo. Caricare sterile disco di rottura 650 psi nel tappo di contenimento sterile. Diffondere 5-6 microlitri della soluzione M10-DNA sulla superficie di un macrocarrier, brevemente asciutto. Load macrocarrier e l&#39;arresto schermo in microcarrier assemblaggio di lancio. </li><li> Posizionare microcarrier assemblaggio di lancio e il granturco calli in camera ad una distanza selezionata dallo schermo di arresto (L2 = 6 cm) e chiudere la porta. Accelerare in un vuoto di 27 psi contro uno schermo rete metallica. </li><li> Premere il pulsante di fuoco fino a quando scoppia disco di rottura e la pressione dell&#39;elio manometro scende a zero. Rilasciare il pulsante di fuoco. </li><li> Incubare le calli bombardati in una capsula di Petri contenente N6OSM (medio osmotica) 32 per 16 ore al buio a 27 ° C. Rompere le calli in una decina di pezzi e trasferimento N6E (medio induzione callo) 32 in piastre di Petri e incubare per 5 giorni in al buio a 27 ° C. </li></ol></li><li> Selezione <ol><li> Dopo 5 giorni di N6E, trasferire il calli sulla N6S medio (selezione media) 32. Subculture tutti i calli sul mezzo di selezione ogni 30 giorni per 8-12 settimane senza disturbare la struttura calli. </li><li> Dopo circa 8-10 settimane bianche settori in rapida crescita crescerà fuori della non-proliferazione e parzialmente necrotico madre calli. Accise bianco tessuti in rapida crescita e la loro sottocultura e medie selezione fresco (N6S) 32 e continuare a incubare come sopra. </li></ol></li><li> Rigenerazione <ol><li> Trasferire la calli embrionale bianco e rapida crescita sul rigenerazione medio 32 e incubare come sopra per 1 settimana. Accendere il rigenerante calli embriogenica per un periodo di 16 ore di luce e 8 ore al buio a 25-27 ° C </li><li> Trasferire la rigenerante tira sulla radicazione media 32 in una provetta di vetro dopo 3-4 settimane, continuano ad incubare come sopra. Dopo il sostanziale rAppare sviluppo oot, lavare accuratamente le radici sotto l&#39;acqua del rubinetto, poi trapiantare le piantine a 4 &quot;vasi di terra. Coprire i vasi con sacchetti di plastica per mantenere umido. Dopo 2 giorni fanno piccoli fori i sacchetti di plastica. Dopo 5-6 giorni rimuovere i sacchetti di plastica. Continuare a incubare come sopra per altri 5-6 giorni. </li></ol></li><li> Serra <ol><li> Trasferire le piantine in vasi da 18 &quot;con il suolo e mantenere in pieno sole d&#39;estate o la luce a effetto serra. Le piante rigenerate iniziali sono chiamati T 0, mentre i primi semi appartengono alla T 1 generazione. </li></ol></li></ol> 3. Assay istologico <ol><li><ol><li> Fissare i mais centro-foglia nervature in 5 ml di 10% formalina tamponata neutra. </li><li> Processo e vuoto infiltrano con paraffina su un processore tessuto utilizzando un processore tessuto. </li><li> Incorporare i tessuti in paraffina utilizzando una stazione di incorporamento HistoCentre III. </li><li> Rimuovere la paraffina in eccesso dai bordi una bloccoks sono raffreddati. </li><li> Campione Sezione a 4-5 micron con un microtomo utilizzando un microtomo. </li><li> Posizionare sezioni su vetrini da microscopio e asciugare in un incubatore a 56 ° C per 2-24 ore. Accertarsi che le sezioni sono pienamente rispettate alla diapositiva. </li><li> Deparaffinare sezioni in due cambi di xilene per 5 min a 23 ° C. </li><li> Idrato scorre attraverso due cambi di etanolo 100% per 2 min e due cambi di etanolo al 95% per 2 min a 23 ° C. </li><li> Lavare le sezioni in acqua corrente per 2 minuti. </li><li> Colorare con il 0,05% di toluidina O blu per 1-2 minuti e sciacquare brevemente con DDH 2 O. </li><li> Posizionare un vetrino sui campioni di olio per immersione e visualizzazione con microscopio ottico. </li></ol></li><li> Microscopia elettronica a scansione (SEM) <ol><li> Fissare i mais centro-foglia costole sezionata in 4% e glutaraldeide 0,1 M tampone fosfato di sodio (pH 7,4) a 4 ° C per 1-2 ore. </li><li> Risciacquare brevemente i campioni nel buffer, li disidratato in unserie di etanolo (25%, 50%, 75% e 95%) per 10-15 min a ciascuna gradazione e 100% etanolo per 10 min, 3x. </li><li> Essiccare le disidratati mais centro-foglia nervature a sezione trasversale in un essiccatore punto critico usando biossido di carbonio liquido come fluido transitorio. </li><li> Montare i campioni essiccati su mozzi in alluminio con alette in carbonio ad alto vuoto </li><li> Rivestire le foglie di granturco metà costole montati su mozzi in alluminio con l&#39;oro (circa 20 nm di spessore) in un gruppo di verniciatura polverizzazione lavata con gas argon. </li><li> Esaminare i campioni rivestiti in un JEOL JSM-6400V (lantanio hexaboride emette elettroni) microscopio elettronico a scansione. </li><li> Le immagini digitali sono stati raffigurati con un software Pro di analisi (versione 3.2). </li></ol></li></ol> 4. Klason lignina misura <ol><li> Mill i campioni attraverso uno schermo da 2 mm. </li><li> Utilizzare un analizzatore di umidità per determinare il contenuto di umidità di ciascun campione e registrare il valore. </li><li> Pesare circa 1,5 g di ciascun campione e registrare la massa. EXtract i campioni utilizzando acqua nella prima estrazione, seguito da etanolo per la seconda estrazione utilizzando un estrattore automatico solvente (3 cicli per estrazione, ~ 14 min per ciclo) o apparecchio Soxhlet (8 ore per l&#39;estrazione). (Nota: Questo passaggio rimuove estrattivi che può condensare durante l&#39;idrolisi acida e interferire con la misura lignina accurate, aumentando l&#39;apparente contenuto di lignina Klason.) </li><li> Asciugare i campioni estratti a 45 ° C per una notte, poi lasciare raffreddare nell&#39;essiccatore e pesare di nuovo. </li><li> Impostare un incubatore a 30 ° C. Misura 0.3 g di ciascun secca, campione estratto nel tappo a vite tubi ad alta pressione (triplicato per campione è consigliato) e registrare i pesi con un&#39;approssimazione di 0,1 mg. Aggiungere 3 ml di 72% H 2 SO 4 in ciascuna provetta pressione. </li><li> Mescolare il campione con un bicchiere o una barra Teflon mescolare. Lasciare l&#39;asta scalpore nel tubo fino a quando viene aggiunta acqua a seguito di incubazione. </li><li> Posizionare le fiale in un incubatore sét a 30 ° C e 150 rpm per 60 min. Dopo 1 ora aggiungere 84 ml di acqua deionizzata per diluire la concentrazione di acido al 4% e mescolare con l&#39;asta di agitazione. Fare attenzione a non lasciare grandi quantità di campione sui lati del flaconcino di sopra della linea di galleggiamento. </li><li> Strettamente sigillare i tappi su tutti i flaconi e metterli in un telaio di metallo o grandi bicchieri. Autoclave a 121 ° C con un ciclo di sterilizzazione liquido per 1 ora. Lasciar raffreddare a temperatura ambiente prima di aprire. </li><li> Pre-cenere i crogioli filtranti in un forno a 575 ° C per almeno 4 ore. Lasciare crogioli raffreddare in un essiccatore per almeno un&#39;ora. </li><li> Filtro a vuoto la soluzione da ciascuna provetta attraverso un crogiolo separata, utilizzando un adattatore di gomma per fissare il crogiolo. Usare acqua deionizzata per lavare ogni residuo di particelle dal tubo. </li><li> Essiccare il residuo lignina a 105 ° C per un minimo di 4 ore. Registrare il peso del crogiolo e residuo secco. </li><li> Se si utilizza un 575 ° C, preFuoco i campioni nel corso di un becco Bunsen fino a quando non c&#39;è fumo o cenere e poi mettere in forno per 24 ore, o se si utilizza un forno programmabile, non pre-cenere e utilizzare il seguente programma: </li><li> Rampa da temperatura ambiente a 105 ° C e mantenere per 12 min. </li><li> Rampa a 250 ° C a 10 ° C / min premuto per 30 min. </li><li> Rampa a 575 ° C a 20 ° C / min e tenere premuto per almeno 180 min. </li><li> Rimuovere i crogioli dal forno e lasciare raffreddare in un essiccatore. Pesare il crogiolo e cenere. </li><li> Calcolare il residuo insolubile acido utilizzando la seguente equazione: </li></ol><img alt="Equazione 1" fo:content-width="300" src="/files/ftp_upload/51340/51340eq1.jpg" width="450" /> M PRE = massa di biomassa pre-estratto M POST = Massa di biomassa post-estratti M VIAL = massa di biomassa estratta aggiunto al flaconcino M RESIDUO = Massa di resid crogiolo e ligninaue M ASH = Massa del crogiolo e cenere MC = contenuto di umidità della biomassa pre-estratti, in base peso totale 5. Analisi Carboidrati <ol><li> Eseguire cella carboidrati muro di analisi basato sulla Foster et al. (2010) il protocollo 31. In breve, Preparare alcol residuo insolubile da liofilizzati materiale vegetale. Poi idrolizzare il materiale con acido trifluoroacetico e abbinare i derivati ​​solubilizzate monosaccaridi ai loro acetati alditolo corrispondenti. Analizzare questi derivati ​​volatili mediante gascromatografia (GC) collegato ad uno spettrometro di massa quadrupla. </li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semimicro+determination+of+cellulose+in+biological+materials.">Semimicro determination of cellulose in biological materials.</a> Anal Biochem. 32, 420-424 (1969).</li><li>Yemm, E. W., Willis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+estimation+of+carbohydrates+in+plant+extracts+by+anthrone.">The estimation of carbohydrates in plant extracts by anthrone.</a> The Biochemical journal. 57, 508-514 (1954).</li><li>Filomena, A. P., Cherie, W., Geoffrey, B. F., Antony, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+polysaccharide+composition+of+plant+cell+walls.">Determining the polysaccharide composition of plant cell walls.</a> Nature. 7, 1590-1607 (2012).</li><li>Foster, C. E., Martin, T. M., Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Compositional+Analysis+of+Plant+Cell+Walls+(Lignocellulosic+biomass)+Part+II:+Carbohydrates.">Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates.</a> J. Vis. Exp. (e1837), (2010).</li><li>Department of Agronomy, Iowa State University. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+bombardment+of+Hi+II+immature+zygotic+embryos+and+recovery+of+transgenic+maize+plants.">Particle bombardment of Hi II immature zygotic embryos and recovery of transgenic maize plants.</a> , (2005).</li><li>Cano-Delgado, A., Penfield, S., Smith, C., Catley, M., Bevan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+cellulose+synthesis+invokes+lignification+and+defense+responses+in+Arabidopsis+thaliana.">Reduced cellulose synthesis invokes lignification and defense responses in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 34, 351-362 (2003).</li><li>Boudet, A. M., Kajita, S., Grima-Pettenati, J., Goffner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignins+and+lignocellulosics:+a+better+control+of+synthesis+for+new+and+improved+uses.">Lignins and lignocellulosics: a better control of synthesis for new and improved uses.</a> Trends in plant science. 8, 576-581 (2003).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

L&#39;accessibilità di cellulasi microbiche per piantare polisaccaridi della parete cellulare dipende in larga misura il grado in cui essi sono associati con polimeri fenolici 23. Il tasso di conversione da biomassa lignocellulosica fermentabili zucchero è correlato negativamente con il contenuto di lignina depositato nelle pareti cellulari secondadry vegetali. Questa correlazione è attribuito alle proprietà fisiche della lignina come idrofobicità 24, eterogeneità chimica, e l&#39;assenza di ...

La produzione di biocarburanti da biomassa lignocellulosica è altamente auspicabile per la sua abbondanza presente negli Stati Uniti 1, e nel caso della raccolta sostenibile dei residui agricoli e forestali, la capacità di non competere direttamente per il terreno agricolo utilizzato per l&#39;alimentazione animale e produzione di mangimi. Tuttavia, a differenza di granturco, che è la principale fonte di biocarburante attualmente generata negli Stati Uniti, materiali lignocellulosici sono significativamente più complesso e difficile da abbattere. Oltre al carboidrati a catena lunga, cellulosa ed emicellulosa, che sono le principali fonti di zuccheri durante la fermentazione di materiali lignocellulosici, molti tipi di pareti cellulari delle piante contengono anche lignina, un polimero stirene che fornisce la resistenza, difesa contro attacco patogeno, e idrofobicità alla cella pareti. Mentre necessario per la crescita delle piante e la sopravvivenza, lignina presenta anche un ostacolo significativo per la conversione enzimatica successo della cellulosa e hemicelluperdere di zuccheri solubili. I materiali ad alto contenuto di lignina sono in genere materiali meno desiderabili sia per il biocarburante (attraverso percorsi di conversione biologica) e la polpa e della carta a causa di impatti negativi sulle caratteristiche di lavorazione e la qualità del prodotto. Quindi, la manipolazione genetica di materiali vegetali per la riduzione lignina ad un livello che non interferisce con la coltura resistenza strutturale e sistemi di difesa potrebbe essere importante per la riduzione dei costi di produzione sia per il biocarburante lignocellulosica e le industrie cartiere. Nel mais (Zea mays), lignina è covalentemente reticolato di emicellulosa nella parete cellulare primaria attraverso Ferulate e ponti diferulate 2. Il complesso lignina-emicellulosa lega a microfibrille di cellulosa attraverso legami idrogeno, formando una matrice complessa che conferisce integrità e resistenza alla parete cellulare secondaria. La resistenza meccanica delle pareti cellulari delle piante è in gran parte determinato dal tipo di lignin subunità 3-5. In studi precedenti, alterando le proporzioni di subunità lignina ha mostrato alcuna tendenza chiara sulla digeribilità enzimatica 6-11. Tuttavia, la riduzione del contenuto di lignina generalmente mostrano un miglioramento conversioni 12,13 e può essere una chiave per aumentare la digeribilità del materiale vegetale da enzimi idrolitici compresi endocellulases, cellobiohydrolases, e β-glucosidasi 14. L&#39;ingegneria genetica per regolare il livello di espressione dei trascritti è stato ampiamente praticato per migliorare le caratteristiche delle colture. Tecniche avanzate, tra cui anti-senso 15 e co-soppressione di 16 tecnologie, consentono efficaci down-regolazione dei geni bersaglio. Completa gene knock-out è stato raggiunto anche utilizzando costrutti genici codificanti RNA introne-impiombato con una struttura tornante 17. Inoltre, un doppio filamento di RNA interference (dsRNAi) tecnica, vale a dire un mezzo di espressione genica potente ed efficacetor che funziona da una mira degradazione trascrizione o di traduzione repressione, fornisce un potente mezzo per indurre una vasta gamma di effetti di soppressione sul bersaglio mRNA 18. Tecniche di silenziamento genico mostrano diversi limiti. Queste tecniche non regolano con precisione il livello di trascrizione e potrebbe causare effetti silenziamento impreviste su altri geni omologhi. In questo metodo, abbiamo impiegato bombardamento di particelle per trasportare il dsRNAi costruisce nel genoma del mais. Fino ad oggi, una vasta gamma di specie vegetali sono state trasformate con successo utilizzando bombardamento di particelle, Agrobacterium trasformazione mediata, elettroporazione, e metodi di microiniezione. Nel mais trasformazione genetica, il metodo bombardamento di particelle è vantaggioso su tutti gli altri metodi in quanto è il più efficiente. Bombardamento di particelle non dipende batteri, per cui il metodo è privo di vincoli biologici quali le dimensioni del gene, specie di gene oOr igi neCu, o il genotipo pianta. Il sistema fisico consegna transgene consente DNA ad alto peso molecolare e più geni da introdurre nel genoma vegetale e in taluni casi nei cloroplasti ad alta efficienza di trasformazione 19. La riduzione lignina nel sistema vascolare della foglia venatura può essere visualizzato mediante microscopia elettronica a scansione (SEM) che è vantaggioso per l&#39;esame della topografia e composizione dei campioni. In piante di mais, due dei reduttasi cinnamoil-CoA (ZmCCR1: X98083 e ZmCCR2: Y15069) geni sono stati trovati nel genoma del mais 20. Cinnamoil-CoA reduttasi catalizza la conversione degli esteri hydroxycinnamoyl-CoA in aldeidi cinnamil. Abbiamo scelto il gene ZmCCR1 di down-regolare questo enzima perché il gene è espresso in tutti i tessuti lignifying. I 523 nucleotidi a terminus 3 &#39;del gene ZmCCR1 sono stati scelti per un dsRNAi costruire perché le sequenze apparivanopiù diversificata rispetto a quelli di ZmCCR2. Così, il costrutto dsRNAi sarebbe proprio legarsi solo a ZmCCR1, evitando off-target tacere 21. Un costrutto ZmCCR1_RNAi è stato progettato nel sistema di espressione ImpactVector1.1-tag citoplasmatica (IV 1.1) contenente il verde tessuto promotore specifico, ribulosio-1, 5-bifosfato carbossilasi ossigenasi (Rubisco). Per studiare gli effetti della dsRNAi costrutto di piante transgeniche, il contenuto di lignina è stato quantificato. La misurazione lignina Klason (acido insolubile) è noto per essere più precisi rispetto ai metodi acido detergente lignina quantificazione che solubilizzano alcuni dei lignina 22. Pertanto, la lignina Klason stata misurata in stocchi di mais transgenici. Questa procedura consiste di una idrolisi acida in due fasi che converte i carboidrati polimerici in monosaccaridi solubili 23. La biomassa idrolizzato è stato poi frazionato in materi solubili e insolubili in acidoSLA e la lignina insolubile acido è stata misurata secondo studi precedenti 23,24. Idealmente, analisi lignina dovrebbe comprendere estrazioni con acqua ed etanolo prima della fase di idrolisi, per la rimozione delle sostanze solubili che possono interferire con i risultati, e un post-combustione idrolisi del residuo lignina per tenere conto di eventuali ceneri presenti nel residuo. Senza questi passaggi, il contenuto di lignina del campione potrebbe essere artificiosamente gonfiato. Il metodo completo è qui presentata, ma per i nostri esperimenti siamo stati in grado di eseguire entrambe queste operazioni a causa del piccolo volume di materiale disponibile per il test Altri due componenti della parete cellulare, cellulosa ed emicellulosa sono stati analizzati anche in lignina linee down-regolato mais transgenico. E &#39;stato riportato che le piante transgeniche che sono state down-regolati in entrambi i loro fenilalanina ammoniaca-liasi (PAL) 25, 4-coumarate: CoA ligasi (4CL) 26, o un cinnamillcohol deidrogenasi (CAD) 27 mostrano un aumento delle altre componenti strutturali della parete cellulare. Come primo passo nei nostri studi, cellulosa cristallina è stata misurata con il metodo Updegraff 28. Questo metodo è stato originariamente ideato per la determinazione di cellulosa in un gran numero di batteri e funghi cellulolitici. In breve, le scorte di mais macinati sono stati trattati con Updegraff reagente (acido acetico: acido nitrico: acqua) per rimuovere emicellulosa, lignina e xylosans. La cellulosa cristallina è stato completamente idrolizzato in glucosio tramite Saeman idrolisi con l&#39;aggiunta di H 2 SO 4. La cellulosa cristallina è stato poi analizzato con il metodo colorimetrico anthrone 29. Per verificare se sono stati modificati i contenuti emicellulosa, gli estratti monosaccaride da steli lavorato sono idrolizzati con acido trifluoroacetico, derivatizzati con il metodo acetato alditolo e poi analizzati mediante gascromatografia (GC) 30. Le procedure dettagliate per cel cristallinaanalisi del contenuto lulose e matrice polisaccaridi composizione sono descritti in Foster et al. (2010) 31. Qui, descriviamo le procedure utilizzate per la lignina down-regulation nel mais mediante una tecnologia di RNAi, particella bombardamento trasformazione, e l&#39;analisi lignina per la decostruzione accelerata di granturco biomassa lignocellulosica in zuccheri fermentabili per i biocarburanti.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Media</td>
			<td>Chemical compositions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6OSM</td>
			<td>4 g/l N6 salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Osmotic medium)</td>
			<td>1 ml/l N6 vitamin stock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2 mg/l 2,4-D</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/l myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>0.69 g/L proline</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>30 g/l sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/L casein hydrolysate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>36.4 g/l sorbitol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>36.4 g/l mannitol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2.5g/l gelrite, pH 5.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6E</td>
			<td>4 g/l N6 salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Callus induction)</td>
			<td>1 ml/l (1000X) N6 vitamin stock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2 mg/l 2,4-D</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/l myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2.76 g/l proline</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>30 g/l sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/l casein hydrolysate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2.5g/l gelrite, pH 5.8.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6S media</td>
			<td>4 g/l N6 salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Selection media)</td>
			<td>1 ml/l N6 vitamin stock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2 mg/l 2,4-D</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/l myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>0.69 g/L proline</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>30 g/L sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/L casein hydrolysate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>36.4 g/l sorbitol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>36.4 g/l mannitol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2.5g/l gelrite, pH 5.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regeneration medium</td>
			<td>4.3 g/L MS salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1 ml/L (1000X) MS vitamin stock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/L myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>60 g/L sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>3 g/L gelrite, pH 5.8 (100x25 mm petri-plates)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Add filter sterilized bialaphos (3 mg/L) added after autoclaving.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rooting medium</td>
			<td>4.3 g/L MS salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1 ml/L MS vitamin stock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/L myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>30 g/L sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>3g/L gelrite, pH 5.8 (100x25 mm petri-plates).</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specific materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-top high pressure tubes</td>
			<td>Pressure tube (#8648-27); Ace Glass, Vineland, NJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Plug (#5845-47); Ace Glass, Vineland, NJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Neutral buffered formalin&#160;</td>
			<td>100ml of formalin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(1 liter)</td>
			<td>900ml of ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>4.0 g of Sodium dihydrogen phosphate, monohydrate&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>(NaH2PO4.H2O)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad PSD-1000/He Particle Delivery device (Hercules, CA, United States)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss PASCAL confocal laser scanning microscope (Carl Zeiss, Jena, Germany)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excelsior ES Tissue Processor (Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoCentre III Embedding Station (Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Microtome Model Reichert 2030 (Reichert, Depew, NY, United States)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emscope Sputter Coater model SC 500 (Ashford, Kent, England)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEOL JSM-6400V Scanning Electron Microscope (JEOL Ltd., Tokyo, Japan)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fitzpatrick JT-6 Homoloid mill; Continental Process Systems, Inc., Westmont, IL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA35 Moisture Analyzer; Sartorius</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical point dryer, Balzers CPD (Leica Microsysstems Inc, Buffalo Grove, IL, United States)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lignin down-regulation of zea mays via dsrnai and klason lignin analysis

Per facilitare l&#39;uso di biomassa lignocellulosica come risorsa bioenergia alternativa, durante i processi di conversione biologici, è necessaria una fase di pretrattamento per aprire la struttura della parete cellulare, aumentando l&#39;accessibilità dei carboidrati della parete cellulare. Lignina, un materiale polifenolico presente in molti tipi di parete cellulare, è noto per essere un ostacolo significativo enzimatica accesso. Riduzione del contenuto di lignina ad un livello tale da non interferire con l&#39;integrità e difesa sistema strutturale dell&#39;impianto potrebbe essere un passo importante per ridurre i costi di produzione di etanolo. In questo studio, abbiamo geneticamente down-regolato uno dei geni della biosintesi legati lignina, cinnamoil-CoA reduttasi (ZmCCR1) tramite un doppio filamento di RNA tecnica interferenze. Il costrutto ZmCCR1_RNAi è stato integrato nel genoma del mais con il metodo del bombardamento di particelle. Piante di mais transgeniche crescevano normalmente rispetto alle piante di controllo wild-type senza aterfering con una crescita di biomassa o meccanismi di difesa, con l&#39;eccezione della visualizzazione di colore marrone-colorazione in transgeniche piante a foglia metà costole, bucce e gambi. Le analisi microscopiche, in combinazione con il dosaggio istologica, hanno rivelato che le fibre sclerenchima foglia furono diradate ma la struttura e le dimensioni di altri componenti principali del sistema vascolare non è stato modificato. Il contenuto di lignina nel mais transgenico è stato ridotto del 7-8,7%, il contenuto di cellulosa cristallina è stata aumentata in risposta alla riduzione della lignina, emicellulose e rimasto invariato. Le analisi possono indicare che il flusso di carbonio potrebbe essere stato spostato dalla biosintesi di lignina alla biosintesi di cellulosa. Questo articolo delinea le procedure utilizzate per down-regolare il contenuto di lignina nel mais tramite tecnologia RNAi, e l&#39;analisi composizionale parete cellulare utilizzato per verificare l&#39;effetto delle modifiche sulla struttura della parete cellulare.

Abbiamo dimostrato una riduzione del tenore di lignina in piante di mais tramite RNAi. Il metodo di trasformazione bombardamento di particelle ceduto circa il 30% di efficienza trnasformation. Il silenziamento genico di ZmCCR1 è stata costantemente osservata nelle generazioni T0-T2. I transgenici lignina ridotta cresciuto in modo simile a piante di mais di tipo selvatico, tranne per la visualizzazione di colorazione marrone in foglia venatura, buccia, e gambo. L&#39;analisi istologica ha dimostrato che le line...

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Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

Un doppio filamento di RNA interference (dsRNAi) tecnica viene impiegata per down-regolare il coenzima mais cinnamoil A reduttasi (ZmCCR1) gene a basso contenuto di lignina pianta. La lignina down-regulation dalla parete cellulare viene visualizzato mediante analisi al microscopio e quantificato con il metodo Klason. Cambiamenti di composizione in emicellulosa e cellulosa cristallina vengono analizzati.

La lignina down-regulation dei<em&gt; Zea mays</em&gt; Via dsRNAi e Klason lignina analisi

To facilitate the use of lignocellulosic biomass as an alternative bioenergy resource, during biological conversion processes, a pretreatment step is ...

lignin-down-regulation-zea-mays-via-dsrnai-klason-lignin

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

13.3K Views.  University of Arizona.  Un doppio filamento di RNA interference (dsRNAi) tecnica viene impiegata per down-regolare il coenzima mais cinnamoil A reduttasi (ZmCCR1) gene a basso contenuto di lignina pianta. La lignina down-regulation dalla parete cellulare viene visualizzato mediante analisi al microscopio e quantificato con il metodo Klason. Cambiamenti di composizione in emicellulosa e cellulosa cristallina vengono analizzati. 

Video: Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

Contrast Ultrasound Targeted Treatment of Gliomas in Mice via Drug-Bearing Nanoparticle Delivery and Microvascular Ablation

We are developing minimally-invasive contrast agent microbubble based therapeutic approaches in which the permeabilization and/or ablation of the microvasculature are controlled by varying ultrasound pulsing parameters.  Specifically, we are testing whether such approaches may be used to treat malignant brain tumors through drug delivery and microvascular ablation.  Preliminary studies have been performed to determine whether targeted drug-bearing nanoparticle delivery can be facilitated by the ultrasound mediated destruction of "composite" delivery agents comprised of 100nm poly(lactide-co-glycolide) (PLAGA) nanoparticles that are adhered to albumin shelled microbubbles. We denote these agents as microbubble-nanoparticle composite agents (MNCAs). When targeted to subcutaneous C6 gliomas with ultrasound, we observed an immediate 4.6-fold increase in nanoparticle delivery in MNCA treated tumors over tumors treated with microbubbles co-administered with nanoparticles and a 8.5 fold increase over non-treated tumors. Furthermore, in many cancer applications, we believe it may be desirable to perform targeted drug delivery in conjunction with ablation of the tumor microcirculation, which will lead to tumor hypoxia and apoptosis. To this end, we have tested the efficacy of non-theramal cavitation-induced microvascular ablation, showing that this approach elicits tumor perfusion reduction, apoptosis, significant growth inhibition, and necrosis. Taken together, these results indicate that our ultrasound-targeted approach has the potential to increase therapeutic efficiency by creating tumor necrosis through microvascular ablation and/or simultaneously enhancing the drug payload in gliomas.

Insonation of microbubbles is a promising strategy for tumor ablation at reduced time-averaged acoustic powers, as well as for the targeted delivery of therapeutics. The purpose of the present study is to develop low duty cycle ultrasound pulsing strategies and nanocarriers to maximize non-thermal microvascular ablation and payload delivery to subcutaneous C6 gliomas.

Mezzo di contrasto ecografico mirato trattamento dei gliomi nei topi tramite Drug-Bearing consegna delle nanoparticelle e ablazione microvascolari

We are developing minimally-invasive contrast agent microbubble based therapeutic approaches in which the permeabilization and/or ablation of the ...

Ricerca

Bioingegneria

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Microarrays polimerici per Discovery High Throughput di Biomateriali

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Ponteggi self-reporting per coltura cellulare 3-Dimensional

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised the only means available, the development of noninvasive imaging modalities (echocardiography, MRI, CT) having high temporal and spatial resolution provide a new window for quantitative diastolic function assessment. Echocardiography is the agreed upon standard for diastolic function assessment, but indexes in current clinical use merely utilize selected features of chamber dimension (M-mode) or blood/tissue motion (Doppler) waveforms without incorporating the physiologic causal determinants of the motion itself.&#160;The recognition that all left ventricles (LV) initiate filling by serving as mechanical suction pumps allows global diastolic function to be assessed based on laws of motion that apply to all chambers. What differentiates one heart from another are the parameters of the equation of motion that governs filling. Accordingly, development of the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism&#160;has shown that the entire range of clinically observed early transmitral flow (Doppler E-wave) patterns are extremely well fit by the laws of damped oscillatory motion.&#160;This permits analysis of individual E-waves in accordance with a causal mechanism (recoil-initiated suction) that yields three (numerically) unique lumped parameters whose physiologic analogues are chamber stiffness (k), viscoelasticity/relaxation (c), and load (xo).&#160;The recording of transmitral flow (Doppler E-waves) is standard practice in clinical cardiology and, therefore, the echocardiographic recording method is only briefly reviewed. Our focus is on determination of the PDF parameters from routinely recorded E-wave data.&#160;As the highlighted results indicate, once the PDF parameters have been obtained from a suitable number of load varying E-waves, the investigator is free to use the parameters or construct indexes from the parameters (such as stored energy 1/2kxo2, maximum A-V pressure gradient kxo, load independent index of diastolic function, etc.) and select the aspect of physiology or pathophysiology to be quantified.

Accurate, causality-based quantification of global diastolic function has been achieved by kinematic modeling-based analysis of transmitral flow via the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism. PDF generates unique stiffness, relaxation,&#160;and load parameters and elucidates &#39;new&#39; physiology while providing sensitive and specific indexes of dysfunction.

Quantificazione di Global Funzione diastolica da Analisi basata su modellazione cinematica del flusso transmitralico tramite il formalismo di riempimento parametrizzate diastolica

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Studying Soft-matter and Biological Systems over a Wide Length-scale from Nanometer and Micrometer Sizes at the Small-angle Neutron Diffractometer KWS-2

The KWS-2 SANS diffractometer is dedicated to the investigation of soft matter and biophysical systems covering a wide length scale, from nm to &#181;m. The instrument is optimized for the exploration of the wide momentum transfer Q range between 1x10-4 and 0.5 &#197;-1 by combining classical pinhole, focusing (with lenses), and time-of-flight (with chopper) methods, while simultaneously providing high-neutron intensities with an adjustable resolution. Because of its ability to adjust the intensity and the resolution within wide limits during the experiment, combined with the possibility to equip specific sample environments and ancillary devices, the KWS-2 shows a high versatility in addressing the broad range of structural and morphological studies in the field. Equilibrium structures can be studied in static measurements, while dynamic and kinetic processes can be investigated over time scales between minutes to tens of milliseconds with time-resolved approaches. Typical systems that are investigated with the KWS-2 cover the range from complex, hierarchical systems that exhibit multiple structural levels (e.g., gels, networks, or macro-aggregates) to small and poorly-scattering systems (e.g., single polymers or proteins in solution). The recent upgrade of the detection system, which enables the detection of count rates in the MHz range, opens new opportunities to study even very small biological morphologies in buffer solution with weak scattering signals close to the buffer scattering level at high Q.
In this paper, we provide a protocol to investigate samples with characteristic size levels spanning a wide length scale and exhibiting ordering in the mesoscale structure using KWS-2. We present in detail how to use the multiple working modes that are offered by the instrument and the level of performance that is achieved.

Here, we present a protocol to investigate soft matter and biophysical systems over a wide mesoscopic length scale, from nm to &#181;m that involves the use of the KWS-2 SANS diffractometer at high intensities and an adjustable resolution.

Studiare Soft-materia e sistemi biologici per una lunghezza scala larga da nanometri e micrometro Taglie al piccolo angolo Neutron Diffrattometro KWS-2

The KWS-2 SANS diffractometer is dedicated to the investigation of soft matter and biophysical systems covering a wide length scale, from nm to &#181;m. ...

Rapid, Scalable Assembly and Loading of Bioactive Proteins and Immunostimulants into Diverse Synthetic Nanocarriers Via Flash Nanoprecipitation

Nanomaterials present a wide range of options to customize the controlled delivery of single and combined molecular payloads for therapeutic and imaging applications. This increased specificity can have significant clinical implications, including decreased side effects and lower dosages with higher potency. Furthermore, the in situ targeting and controlled modulation of specific cell subsets can enhance in vitro and in vivo investigations of basic biological phenomena and probe cell function. Unfortunately, the required expertise in nanoscale science, chemistry and engineering often prohibit laboratories without experience in these fields from fabricating and customizing nanomaterials as tools for their investigations or vehicles for their therapeutic strategies. Here, we provide protocols for the synthesis and scalable assembly of a versatile non-toxic block copolymer system amenable to the facile formation and loading of nanoscale vehicles for biomedical applications. Flash nanoprecipitation is presented as a methodology for rapid fabrication of diverse nanocarriers from poly(ethylene glycol)-bl-poly(propylene sulfide) copolymers. These protocols will allow laboratories with a wide range of expertise and resources to easily and reproducibly fabricate advanced nanocarrier delivery systems for their applications. The design and construction of an automated instrument that employs a high-speed syringe pump to facilitate the flash nanoprecipitation process and to allow enhanced control over the homogeneity, size, morphology and loading of polymersome nanocarriers is described.

Nanomaterials provide versatile mechanisms of controlled therapeutic delivery for both basic science and translational applications, but their fabrication often requires expertise that is unavailable in most biomedical laboratories. Here, we present protocols for the scalable fabrication and therapeutic loading of diverse self-assembled nanocarriers using flash nanoprecipitation.

Montaggio veloce e scalabile e caricamento di proteine bioattive e immunostimolanti in nanovettori diversi sintetici tramite Flash nanoprecipitazione

Nanomaterials present a wide range of options to customize the controlled delivery of single and combined molecular payloads for therapeutic and imaging ...

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in live-cell imaging and high-throughput microscopy techniques. This led to a constant increase in the amount and complexity of the microscopy data for a single experiment. Because manual analysis of microscopy data is very time consuming, subjective, and prohibits quantitative analyses, automation of bioimage analysis is becoming almost unavoidable. We built an informatics workflow called Substructure Analyzer to fully automate signal analysis in bioimages from fluorescent microscopy. This workflow is developed on the user-friendly open-source platform Icy and is completed by functionalities from ImageJ. It includes the pre-processing of images to improve the signal to noise ratio, the individual segmentation of cells (detection of cell boundaries) and the detection/quantification of cell bodies enriched in specific cell compartments. The main advantage of this workflow is to propose complex bio-imaging functionalities to users without image analysis expertise through a user-friendly interface. Moreover, it is highly modular and adapted to several issues from the characterization of nuclear/cytoplasmic translocation to the comparative analysis of different cell bodies in different cellular sub-structures. The functionality of this workflow is illustrated through the study of the Cajal (coiled) Bodies under oxidative stress (OS) conditions. Data from fluorescence microscopy show that their integrity in human cells is impacted a few hours after the induction of OS. This effect is characterized by a decrease of coilin nucleation into characteristic Cajal Bodies, associated with a nucleoplasmic redistribution of coilin into an increased number of smaller foci. The central role of coilin in the exchange between CB components and the surrounding nucleoplasm suggests that OS induced redistribution of coilin could affect the composition and the functionality of Cajal Bodies.

We present a freely available workflow built for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in specific cell compartments in fluorescence microscopy images. This user-friendly workflow is designed on the open-source software Icy and also uses ImageJ functionalities. The pipeline is affordable without knowledge in image analysis.

Substructure Analyzer: un flusso di lavoro facile da usare per l'esplorazione rapida e l'analisi accurata dei corpi cellulari nelle immagini di microscopia a fluorescenza

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, differentiation, morphology, and molecular synthesis. However, variables such stimuli strength and stimulation times need to be considered when stimulating either cells, tissues or scaffolds. Given that EFs and MFs vary according to cellular response, it remains unclear how to build devices that generate adequate biophysical stimuli to stimulate biological samples. In fact, there is a lack of evidence regarding the calculation and distribution when biophysical stimuli are applied. This protocol is focused on the design and manufacture of devices to generate EFs and MFs and implementation of a computational methodology to predict biophysical stimuli distribution inside and outside of biological samples. The EF device was composed of two parallel stainless-steel electrodes located at the top and bottom of biological cultures. Electrodes were connected to an oscillator to generate voltages (50, 100, 150 and 200 Vp-p) at 60 kHz. The MF device was composed of a coil, which was energized with a transformer to generate a current (1 A) and voltage (6 V) at 60 Hz. A polymethyl methacrylate support was built to locate the biological cultures in the middle of the coil. The computational simulation elucidated the homogeneous distribution of EFs and MFs inside and outside of biological tissues. This computational model is a promising tool that can modify parameters such as voltages, frequencies, tissue morphologies, well plate types, electrodes and coil size to estimate the EFs and MFs to achieve a cellular response.

This protocol describes the step-by-step process to build both electrical and magnetic stimulators used to stimulate biological tissues. The protocol includes a guideline to simulate computationally electric and magnetic fields and manufacture of stimulator devices.

Dispositivi elettrici e a campo magnetico per la stimolazione dei tessuti biologici

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...

Inactivation of Pathogens via Visible-Light Photolysis of Riboflavin-5&#8242;-Phosphate

Riboflavin-5&#39;-phosphate (or flavin mononucleotide; FMN) is sensitive to visible light. Various compounds, including reactive oxygen species (ROS), can be generated from FMN photolysis upon irradiation with visible light. The ROS generated from FMN photolysis are harmful to microorganisms, including pathogenic bacteria such as Staphylococcus aureus (S. aureus). This article presents a protocol for deactivating S. aureus, as an example, via photochemical reactions involving FMN under visible light irradiation. The superoxide radical anion (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01v3.png" style="margin: auto;" />) generated during the FMN photolysis is evaluated via nitro blue tetrazolium (NBT) reduction. The microbial viability of S. aureus that is attributed to reactive <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01v3.png" style="margin: auto;" /> species was used to determine the effectiveness of the process. The bacterial inactivation rate is proportional to FMN concentration. Violet light is more efficient in inactivating S. aureus than blue light irradiation, while the red or green light does not drive FMN photolysis. The present article demonstrates FMN photolysis as a simple and safe method for sanitary processes.

Inactivation of Pathogens via Visible-Light Photolysis of Riboflavin-5&amp;#8242;-Phosphate

Here, we present a protocol to inactivate pathogenic bacteria with reactive oxygen species produced during photolysis of flavin mononucleotide (FMN) under blue and violet light irradiation of low intensity. FMN photolysis is demonstrated to be a simple and safe method for sanitary processes.

Inattivazione di agenti patogeni tramite fotolisi in luce visibile della riboflavina-5′-fosfato

Riboflavin-5&#39;-phosphate (or flavin mononucleotide; FMN) is sensitive to visible light. Various compounds, including reactive oxygen species (ROS), can ...

Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance

Surface plasmon resonance (SPR) is used to measure hemagglutinin (HA) binding to domain-swapped Cyanovirin-N (CV-N) dimer and to monitor interactions between mannosylated peptides and CV-N's high-affinity binding site. Virus envelope spikes gp120, HA, and Ebola glycoprotein (GP) 1,2 have been reported to bind both high- and low-affinity binding sites on dimeric CVN2. Dimannosylated HA peptide is also bound at the two low-affinity binding sites to an engineered molecule of CVN2, which is bearing a high-affinity site for the respective ligand and mutated to replace a stabilizing disulfide bond in the carbohydrate-binding pocket, thus confirming multivalent binding. HA binding is shown to one high-affinity binding site of pseudo-antibody CVN2 at a dissociation constant (KD) of 275 nM that further neutralizes human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) through oligomerization. Correlating the number of disulfide bridges in domain-swapped CVN2, which are decreased from 4 to 2 by substituting cystines into polar residue pairs of glutamic acid and arginine, results in reduced binding affinity to HA. Among the strongest interactions, Ebola GP1,2 is bound by CVN2 with two high-affinity binding sites in the lower nanomolar range using the envelope glycan without a transmembrane domain. In the present study, binding of the multispecific monomeric CV-N to severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) spike (S) glycoprotein is measured at KD = 18.6 &#181;M as compared with nanomolar KD to those other virus spikes, and via its receptor-binding domain in the mid-&#181;-molar range.

Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance

The present protocol describes new tools for SPR binding assays to examine CV-N binding to HA, S glycoprotein, related hybrid-type glycans, and high-mannose oligosaccharides. SPR is used to determine the KD for binding either dimeric or monomeric CV-N to these glycans.

Ingegneria di agenti antivirali tramite risonanza plasmonica di superficie

Surface plasmon resonance (SPR) is used to measure hemagglutinin (HA) binding to domain-swapped Cyanovirin-N (CV-N) dimer and to monitor interactions ...