Questo protocollo produce regioni pacemaker intatte della pelvi renale, l'organo muscolare liscio all'interno del rene che pompa l'urina nell'uretere e nella vescica. A differenza dell'isolamento delle cellule dalla pelvi renale, questo approccio fornisce ambienti intatti in situ delle regioni del pacemaker della pelvi renale e una preparazione più fisiologica per lo studio del pacemaking della pelvi renale. Un individuo che non ha mai eseguito questa tecnica può avere difficoltà a tagliare sezioni uniformi.
Un utente per la prima volta deve assicurarsi che il rene sia livellato sullo stadio del vibratoma e non acceleri il processo di taglio. Usando pinze per tessuti interni e forbici per dissezione interna, pizzicare l'intestino e sollevarli lontano dalla parete addominale. Tagliare contemporaneamente la parte inferiore dell'intestino libero dal corpo al duodeno prossimale e al colon distale per ottenere l'accesso allo spazio retroperitoneale contenente i reni.
Pizzicare delicatamente e sollevare l'estremità distale dell'uretere con una pinza tissutale. Usando le forbici da dissezione, tagliare sotto l'uretere pizzicato verso il rene fino a quando non è stato liberato dal tessuto connettivo circostante. Una volta che i reni sono esposti, estrarli individualmente.
Riempire una soluzione rivestita in elastomero di silicio con una soluzione di KRB ghiacciata. Trasferire il rene al piatto di dissezione e assicurarsi che sia completamente sommerso. Utilizzare forbici a molla fine e pinza interna per rimuovere il tessuto adiposo dalla base del rene per esporre la pelvi renale distale, o RP, e l'uretere prossimale.
Rimuovere l'uretere prossimale e una parte del RP distale dalla base usando forbici e pinza a molla fine. Forare la capsula renale esterna con una pinna a punta fine, allontanando le punte dal corpo renale. Usando una pinza con ogni mano, pizzicare le estremità sciolte della capsula e staccarle fino a quando la membrana della capsula renale rimanente non viene rimossa completamente.
Inserire una lama di rasoio nel supporto della lama dello strumento vibratome e regolare l'angolo di gioco della lama a circa 18 gradi. Regolare i parametri della lama come menzionato nel manoscritto di testo, assicurandosi che lo spessore della sezione renale non superi i 150 micrometri, il che avrebbe un impatto negativo sugli esperimenti di imaging degli ioni calcio. Utilizzare piniche smussate per afferrare delicatamente e rimuovere il rene preparato dalla soluzione di KRB ghiacciata.
Posizionare immediatamente il rene su carta assorbente per circa due o quattro secondi per rimuovere l'umidità esterna in eccesso. Arrotolare delicatamente il rene sulla carta assorbente per assicurarsi che tutti i lati del parenchima si siano asciugati in modo che vi sia un'adesione ottimale del rene allo stadio del vibratoma. Applicare immediatamente un sottile strato di colla cianoacrilata alla base della piastra del campione di vibratoma e utilizzare pinza smussata per posizionare l'uretere renale lato verso il basso sull'area coperta di colla.
Applicare delicatamente la pressione verso il basso sulla parte superiore del rene con il bordo piatto della pincipe per circa 10-20 secondi per asciugare la colla. Fissare saldamente la piastra del campione sul fondo del vassoio tampone e regolare il livello della soluzione di KRB in modo che la parte superiore del rene sia completamente immersa. Per il sezionamento automatico del vibratome, selezionare le posizioni iniziale e finale del ciclo di taglio della lama del vibratoma da 0,5 a 1 centimetro di disa dal rene per assicurarsi che l'intero piano renale venga sezionato.
Avviare il processo di taglio automatico, assicurandosi che la lama sia in contatto con il rene. Usando la pinacova, raccogli le sezioni che vengono liberate dal rene e trasferiscile immediatamente nei singoli pozzeli. Continuare il protocollo di sezionamento e utilizzare un microscopio ottico per identificare le regioni PKJ nelle fette renali fino a quando le regioni PKJ diventano più evidenti.
Riempire una parabola di imaging rivestita in elastomero di silicio con una soluzione KRB ghiacciata. Trasferire una singola fetta di rene al piatto. Inserire i perni Minutien intorno alla periferia di una fetta di rene per fissare la sezione alla base del piatto di imaging.
Posizionare la parabola di imaging sul palco di un microscopio confocale a disco rotante verticale e iniziare immediatamente a perfusare con la soluzione KRB. Utilizzare una lente per obiettivo a immersione in acqua a basso ingrandimento per individuare la fetta di rene. Centrare il campo di imaging sulle aree della sezione in cui è presente il PKJ utilizzando i punti di riferimento.
Una volta individuato il PKJ, utilizzare una lente per obiettivo ad immersione in acqua a ingrandimento più elevato per ingrandire l'area di interesse. Distinguere le diverse cellule di interesse in diversi tipi di durate transitorie di ioni calcio nella parete PKJ. Una volta identificate le celle di interesse, regolare l'intensità del laser per ottenere un buon rapporto segnale-rumore e registrare le immagini a una frequenza di campionamento temporale compresa tra 16 e 32 Hertz.
Immagini microscopiche leggere di intere sezioni renali mostrano punti di riferimento annotati di una singola regione PKJ. Più regioni PKJ presenti vicino al midollo interno e al rene distale. Le posizioni delle arterie renali PKJ e dei confini PKJ sono mostrate qui.
Una sezione PKJ di un topo che esprime GCaMP in cellule PDGFR alfa positive è mostrata qui. La sottile parete PKJ sospesa tra il tessuto parenchimale può essere distinta utilizzando punti di riferimento come l'arteriola renale. L'espressione di GCaMP6f in questo specifico tessuto transgenico è distribuita su tutta la larghezza del PKJ attraverso gli strati muscolari e avventiziali.
Nelle fette renali positive di PDGFR alfa GCaMP6f, una rete di cellule che si estende tipicamente sulla larghezza della parete PKJ è fluorescente e mostra transitori oscillanti di ioni calcio di varie durate e frequenze. Nelle fette renali positive di SMC GCaMP3, uno strato di cellule positive GCaMP3 è presente nello strato muscolare. Una mappa spaziotemporale mostra che le cellule alfa positive di PDGFR situate nell'avventizia PKJ suscitano transitori di ioni calcio a bassa frequenza di lunga durata, mentre le SMC hanno sparato transienti di ioni calcio di durata più breve più frequentemente.
Allo stesso modo, sono stati osservati anche una serie di segnali fluorescenti di ioni calcio all'interno e intorno ai dotti di raccolta e ai transitori oscillanti degli ioni calcio negli SMC. Quando si tenta questa procedura, è importante che il rene sia il più livello possibile durante il sezionamento del vibratoma per garantire che le fette di rene uniformi vengano liberate dal blocco. Seguendo questa procedura, altri metodi come l'isolamento monocellulare, l'immunoistochimica e gli studi molecolari possono essere eseguiti per aumentare la nostra comprensione dei meccanismi del pacemaker nella pelvi renale.
