L'insufficienza cardiaca è la principale causa di morte sia per gli uomini che per le donne nel mondo. Nuove prove suggeriscono che l'alterazione del metabolismo cardiaco e sistemico contribuisce alla patologia dell'insufficienza cardiaca. Identificare rapidamente quali metaboliti influenzano l'accoppiamento eccitazione-contrazione è ancora una sfida.
L'approccio tradizionale di isolare il miocita cardiaco dal topo adulto è un processo impegnativo e dispendioso in termini di tempo. Il metodo innovativo in questo articolo rende un processo rigoroso più efficiente e più facile da eseguire. Inoltre, utilizzando la sonda fluorescente, possiamo eseguire molte valutazioni fenotipiche di come le sostanze chimiche possono indurre tossicità cardiaca o disfunzione a livello cellulare.
Identificando quali molecole alterano la funzione del miocita, è possibile identificare nuove terapie per il trattamento dell'insufficienza cardiaca. Utilizzando topi transgenici, possiamo sondare diversi geni per determinare quali possono prevenire e contribuire all'insufficienza cardiaca. Queste informazioni saranno essenziali in futuro per curare l'insufficienza cardiaca.
A dimostrare la procedura saranno Matthew Klos e uno studente Shreyas Suresh. Per iniziare, scongelare la soluzione di laminina funzionante sul ghiaccio. Utilizzando una pipetta P1000, aspirare 200 microlitri di laminina e trascinare delicatamente la punta della pipetta lungo un bordo del coperchio sterilizzato per consentire all'azione capillare di estrarre una minuscola quantità di laminina per facilitare l'attacco delle coperture alla piastra a sei pozzi.
Quindi espellere la laminina rimanente al centro della coverslip con un movimento circolare. Stendere la goccia di laminina sulla coverslip. Posizionare i coprisparsi in un incubatore di 37 gradi Celsius per almeno un'ora e fino a 24 ore prima dell'isolamento.
Per isolare i miociti da un cuore preparato in KHB-HB freddo, posizionare il campione al microscopio stereo. Per prevenire gli emboli, innescare la cannula aortica immergendola nella soluzione KHB-HB e utilizzando una siringa da 20 millilitri per forzare l'adozione della soluzione. Assicurati che il cuore sia sommerso e che la cannula sia innescata prima dell'escissione cardiaca.
Con 5 forcep, cannulate il cuore. Confermare il corretto posizionamento della cannula visualizzando la punta della cannula circa un millimetro sopra l'inserimento aortico nel ventricolo. Quindi inizia il flusso di KHB-HB ruotando il fermacock sul Langendorf.
Collegare la cannula al Langendorf per perfondere il cuore per cinque minuti. Quindi, ruotare il fermaflusso per passare la perfusione dal serbatoio KHB-HB al serbatoio del tampone di digestione. Una volta che il buffer di digestione raggiunge il cuore, impostare un timer.
Raccogliere il perfusato in un becher sterile da 100 millilitri. Riempire il serbatoio del tampone di digestione in base alle esigenze con il perfuso fino alla scadenza del tempo di digestione. Dopo la digestione, in un becher sterile da 100 millilitri, separare le camere del cuore con forcep e forbici Iris.
Posizionare ogni camera in un pozzo separato di una piastra a sei poi. Versare cinque millilitri di soluzione di collagenasi in ogni pozzo. Usa immediatamente le forbici per tritare il tessuto cardiaco in pezzi di circa un metro cubo.
Utilizzando una pipetta di trasferimento sterile, triturare delicatamente il tessuto cardiaco tritato con tampone di digestione. Una volta che i pezzi di tessuto diventano bianchi e piumati, posizionare la piastra sotto un microscopio invertito per esaminare le cellule. Se il numero di cellule vitali è superiore all'80%, procedere a sforzare le cellule in un tubo conico da 50 millilitri utilizzando un colino a celle da 100 micron.
Se il numero di celle vitali è inferiore all'80%, controllare il tempo necessario per la cannulazione. Se il tempo di cannula è superiore a cinque minuti, prova un altro cuore. In caso meno, saggio nuove fessure di collagenasi attraverso il programma di campionamento della collagenasi.
Quindi, pellettare le cellule centrifugando a 215 volte g per due minuti. Il pellet deve essere compatto e non allentato. Se il pellet è allentato, la preparazione contiene molte cellule morte.
In una cappa di coltura tissutale, rimorsi il pellet compatto in 10 millilitri di tampone di arresto. Pellettare nuovamente le cellule centrifugando a 215 volte g per due minuti. Rimospendare le cellule in cinque millilitri di tampone di placcatura.
Eseguire un conteggio delle cellule su un contatore di cito e regolare il volume del tampone di placcatura per raggiungere una concentrazione finale di miocita di due volte 10 alle quattro cellule per millilitro. Ora rimuovi le copertine rivestite di laminina dall'incubatrice. Aspirare la goccia di laminina se presente.
Piastra 200 microlitri di sospensione miocita su ogni coverlip. Posizionare le coverlips in un incubatore di 37 gradi Celsius con il 21% di ossigeno e il 5% di anidride carbonica per due ore per consentire l'attacco. Dopo due ore, esegna i copriparsi e aspira le cellule non attaccate.
Aggiungere due millilitri di mezzi di coltura e cultura nell'incubatore a 37 gradi Celsius per un massimo di quattro giorni. In primo luogo, rimuovere il componente A e il componente B dal kit potenziale della membrana. In un tubo conico da 15 millilitri, combinare 50 microlitri del componente B e cinque microlitri del componente A per formare una miscela di coloranti di tensione.
Vortice da mescolare. Aggiungere 10 millilitri di mezzi di placcatura al tubo conico da 15 millilitri contenente la miscela di colorante di tensione per formare la potenziale miscela di coloranti a membrana. Ancora una volta, vortice da mescolare.
Quindi rimuovere una piastra di sei pozzi di miociti dall'incubatore. Aspirare i media. Aggiungere 800 microlitri della potenziale miscela di coloranti a membrana ad ogni pozzo.
Coprire la piastra con un foglio e lasciare la piastra a temperatura ambiente per 15 minuti. Successivamente, aspirare la miscela di coloranti da ogni pozzo e aggiungere un millilitro della soluzione tyrode modificata ad ogni pozzo. Coprire con un foglio.
Accendere l'apparecchiatura nell'ordine del microscopio, della lampada ad arco, di HyperSwitch, del sistema di interfaccia a fluorescenza, dell'alimentatore MyoCam, dello stimolatore di campo e del computer. Assicurarsi che i set di filtri di emissione di eccitazione siano appropriati per il colorante per immagini. Ad esempio, fura-2 è eccitato a 340 nanometri e 380 nanometri di luce.
Emette a 510 nanometri di luce. Fluo-4 e il colorante a membrana di tensione sono eccitati a 485 nanometri di luce ed emettono a 520 nanometri di luce. Innescare il sistema di registrazione accendendo il vuoto, aprendo completamente il morsetto del tubo flessibile e immergendo delicatamente ogni siringa da 60 millilitri con la soluzione di Tyrode nel collettore.
Per le registrazioni di calcio, utilizzare la soluzione Tyrode standard. Per le registrazioni di tensione, utilizzare la soluzione Tyrode modificata. Accendere il riscaldatore in linea.
Mantenere la temperatura in modo che il perfusato nella camera sia a 36 più o meno un grado Celsius per almeno 15 minuti. Aprire quindi il software di acquisizione. Assicurarsi che i parametri siano impostati per il colorante per immagini corretto.
Spegnere lo stimolatore. Al buio, rimuovere il foglio dalla piastra a sei poggiagli e posizionare un coverslip nella camera di stimolazione. Posizionare la piastra al microscopio e concentrarsi sui miociti utilizzando l'obiettivo 10X.
Una volta a fuoco, inizia a camminare sul campo stimolando a uno hertz e 0,2 volt. Aumentare gradualmente la tensione fino a ottenere un ritmo uno a uno. Quindi aumentare la tensione fino a raggiungere 1,5 volte la soglia.
Passare dall'obiettivo 10X all'obiettivo 40X. Concentrarsi su una cella che segue un ritmo uno-a-uno. Regolare le tonalità di plastica in modo che nel campo visivo sia presente una sola cella.
Utilizzando il software, posizionare la casella dell'area di interesse su sarcomer ben definiti. Avviare il software di acquisizione per avviare la luce di eccitazione. Utilizzando i filtri di densità neutra, regolare l'impostazione dell'intensità di conseguenza per ottenere un adeguato rapporto segnale-rumore.
Qui vengono mostrate le tracce rappresentative di calcio e sarcomero che accorciano le tracce registrate dai miociti del topo C57BL/6 usando fura-2. Una quantificazione dei dati medi dell'insieme ottenuti dai topi C57BL/6 e dai loro compagni di lettiera transgenica non mostra alcuna differenza tra i gruppi se non per il tempo di rilassamento a 10 hertz pacing. Il tracciamento della tensione registrato da un miocita del mouse C57BL/6 camminato a 10 hertz è stato post-elaborato per ottenere un segnale utilizzabile.
L'insieme ha un potenziale d'azione medio dopo l'applicazione di un Butterworth a basso passaggio o di un filtro digitale Savitzky-Golay mostrano sottili differenze nella forma dei potenziali d'azione. Le tracce registrate dai miociti di ratto camminavano ad un hertz mostrano che oltre al segnale di tensione inferiore al segnale di calcio, anche la cinetica di contrazione è diversa. Questo perché i coloranti di calcio tamponano il calcio mentre i coloranti di tensione no.
Come per il transitore di calcio, i miociti hanno dimostrato cambiamenti dipendenti dal ritmo nella loro durata potenziale di azione ottica. È stato dimostrato anche il prolungamento indotto dalla droga del potenziale d'azione. Gli ultimi 11 secondi di una registrazione di 20 secondi indicavano che l'esposizione prolungata dei miociti alla luce blu porta all'attività innescata.
Quando si tenta questa procedura, la cosa più importante da ricordare è usare la luce a intensità più bassa possibile in modo da non danneggiare i miociti. Il miocita isolato usando il nostro approccio può anche essere utilizzato per l'immunoistochimica o condotto per l'analisi western blot. La bellezza di questa tecnica, permette ai ricercatori di valutare rapidamente come la varietà di molecole e geni aiuti l'accoppiamento eccitazione-contrazione utilizzando un unico sistema.
