Questo protocollo potrebbe aiutare a migliorare la resa atriale da un cuore di topo perfuso. Il vantaggio principale di questo metodo è che il miocita atriale e ventricolare può essere isolato contemporaneamente nella stessa condizione di digestione. Questo metodo potrebbe fornire informazioni sui meccanismi delle malattie cardiache a livello cellulare e subcellulare.
Dopo l'eutanasia di un topo maschio C57 black six di otto-10 settimane, utilizzare una pinza tissutale per sollevare la pelle dello xifoide. Quindi usando le forbici dei tessuti, fare una piccola incisione laterale attraverso la pelle. Eseguire una dissezione smussata tra la pelle e la fascia.
Estendere l'incisione cutanea verso le ascelle a forma di V su entrambi i lati e continuare l'incisione attraverso la gabbia toracica. Quindi utilizzando una pinza tissutale, bloccare lo sterno e deviare la cassa toracica verso l'alto per esporre completamente il cuore e i polmoni. Usando una pinza curva, staccare il pericardio.
Se la ghiandola del timo copre i grandi vasi, usa due pinze curve per strappare la ghiandola del timo verso entrambi i lati, quindi tira delicatamente la base del cuore verso la coda fino a quando l'aorta e le sue arterie di ramo sono visibili come un vaso sanguigno a forma di Y. Transect l'aorta all'arteria carotide comune sinistra, quindi tagliare l'arteria brachiocefalica. Asportare il cuore e immergerlo immediatamente in una capsula di Petri contenente la soluzione di Tyrode per lavare e pompare fuori il sangue residuo.
Quindi trasferire il cuore in un'altra capsula di Petri contenente la soluzione uno. Sotto uno stereomicroscopio, usando forbici dell'iride fini, tagliare qualsiasi tessuto in eccesso. Espellere le bolle d'aria dalla siringa.
Quindi, con l'assistenza di due pinze di legatura diritte, eseguire la cannulazione aortica retrograda, facendo attenzione che l'intero processo di cannulazione venga eseguito sotto la superficie del liquido. Regolare la profondità di cannulazione in modo tale che la punta della cannula si trovi nell'aorta ascendente, facendo attenzione a non penetrare nelle valvole aortiche. Quindi, con una sutura 3-O pre-nodo, ligate l'aorta alla tacca della cannula.
Iniettare delicatamente la soluzione uno dalla siringa per scovare il sangue residuo. Quindi collegare il cuore cannulato all'apparato Langendorff, facendo attenzione a non introdurre bolle d'aria nel cuore. Dopo aver collegato il cuore cannulato all'apparato di Langendorff, perfondere il cuore con la soluzione uno per circa due minuti.
Utilizzando una pipetta sterile in polietilene monouso, prelevare circa 2,5 millilitri di soluzione tre e preriscaldarla a bagnomaria per un uso successivo. Quindi, per digerire i tessuti, perfondere il cuore con la soluzione rimanente tre per circa 11-12 minuti. Dopo i primi due minuti di perfusione con la soluzione tre, riciclare la soluzione perfusa nei serbatoi perfusati dalla pompa peristaltica per il riutilizzo fino al completamento della digestione.
Quando il cuore diventa gonfio, diventando leggermente pallido e flaccido, usando una pinza dentata, pizzicare delicatamente il miocardio. Se un'impronta è visibile, terminare la digestione e staccare il cuore dall'apparato. Per isolare i miociti arteriosi e ventricolari, utilizzare una pinza per rimuovere i ventricoli e gli atri e metterli in diverse piastre di Petri.
Quindi aggiungere la soluzione preriscaldata tre a entrambi i piatti. Usando una pinza smussata, triturare i tessuti in una consistenza torbida, quindi pipettare delicatamente il tessuto per una digestione uniforme senza introdurre bolle d'aria. Per arrestare l'attività enzimatica rimanente, utilizzando una pipetta, trasferire il tessuto torbido digerito nella soluzione quattro, quindi centrifugare per 20 secondi a 192 volte G.Dopo aver rimosso il surnatante, risospesciare il sedimento cellulare nella soluzione cinque.
Per evitare il paradosso del calcio e il sovraccarico di calcio, reintrodurre il calcio in modo graduale aggiungendo gradualmente un totale di 50 microlitri di cloruro di calcio da 100 millimolari per litro alla sospensione cellulare. Una volta che tutto il cloruro di calcio è stato aggiunto, conservare le cellule nella soluzione di Tyrode per lo studio del morsetto patch. La profondità di cannulazione è associata alla perfusione degli atri e delle sue appendici.
Quando la punta della cannula si trova all'aorta ascendente, entrambe le appendici atriali sono gonfiate indicando una sufficiente perfusione degli atri. Tuttavia, quando la punta della cannula è alla radice aortica, entrambe le appendici atriali vengono appassite, indicando una perfusione insufficiente. I miociti atriali isolati per cannulazione all'aorta ascendente avevano tassi di sopravvivenza più elevati rispetto a quelli isolati per cannulazione alla radice aortica sia prima che dopo la reintroduzione del calcio.
Al contrario, non vi è stata alcuna differenza nei tassi di sopravvivenza dei miociti ventricolari isolati per cannulazione sia all'aorta ascendente che alla radice aortica sia prima che dopo la reintroduzione del calcio. La registrazione del morsetto patch a cellule intere della corrente di sodio nei miociti atriali e ventricolari isolati, così come le densità attuali confermano che la qualità delle cellule isolate soddisfa i requisiti per gli esperimenti elettrofisiologici. Quando si transecting l'aorta, assicurarsi di mantenere una ghiandola sufficiente per la legatura.
Altrimenti, la cannula può penetrare nella valvola aortica dopo la legatura.
