Abbiamo sviluppato un semplice metodo privo di Langendorff per isolare le singole cellule cardiache del topo con una tecnica di imballaggio antigrado. Questo metodo consente l'isolamento delle cellule cardiache dai topi giovani a quelli più anziani. La perfusione retrograda a base di Langendorff è stata considerata un gold standard per l'isolamento dei miociti cardiaci in vari animali da esperimento.
Tuttavia, la cannulazione dell'LTA è tecnicamente difficile nei topi a causa delle loro piccole dimensioni. Per la raccolta del cuore del topo, dopo aver confermato l'eutanasia e aver rasato l'addome, aprire rapidamente la cavità toracica per esporre il cuore e utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica con la punta tagliata approssimativamente alle dimensioni del cuore per succhiare il cuore nella pipetta. Sollevare la pipetta per creare spazio sufficiente per inserire forbici curve e utilizzare le forbici per asportare il cuore dal lato dorsale facendo attenzione a evitare di danneggiare gli atri.
Immediatamente, posizionare il cuore in un bicchiere da 30 millilitri contenente CIB-EGTA ghiacciato per circa un minuto. Quando le contrazioni si sono fermate, mettere il cuore in un piatto di coltura da 35 millilitri contenente CIB-EGTA ghiacciato e rimuovere il polmone e altri tessuti visibili. Posizionare il cuore appena pulito su un supporto cardiaco pieno di lato apice CIB-EGTA refrigerato verso il basso e posizionare il supporto sotto un microscopio stereoscopico.
Rimuovere il grasso e i tessuti connettivi da intorno all'aorta. Se la lunghezza dell'aorta tagliata è troppo lunga, tagliare l'aorta appena sotto l'arteria brachiocefalica e orientare il cuore in modo che la superficie anteriore sia rivolta in avanti. Utilizzare una pinzetta per sollevare l'estremità dell'aorta e utilizzare un piccolo morsetto vascolare per bloccare l'aorta vicino all'atria mentre si spinge delicatamente verso il basso sugli atri.
Quindi posizionare il cuore bloccato su una piastra di perfusione con il lato anteriore rivolto verso l'alto e idratare il cuore con alcune gocce di CIB-EGTA. Per la perfusione antegrada, caricare una siringa da 20 millilitri contenente CIB-EGTA prebellico collegato a un tubo di estensione flessibile e un ago di iniezione marcato sulla pompa per infusione e avviare la pompa a una portata di 0,5 millilitro al minuto. Quando l'ago e la pompa sono stati riempiti, posizionare l'ago di iniezione sulla piastra di perfusione con il lato più corto della forma diagonale davanti e far scorrere l'ago fino a quando non tocca solo l'apice del cuore.
Con attenzione, inserire l'ago vicino all'apice del ventricolo sinistro nella camera ventricolare senza torcere o staccare l'ago dalla piastra, osservando il segno per stimare la profondità dell'inserimento dell'ago. Quando l'inserimento dell'ago è completo, il sangue dovrebbe iniziare a fluire dall'arteria coronarica. Utilizzare il nastro adesivo per fissare l'ago di iniezione alla piastra e aumentare la velocità della pompa a un millilitro al minuto.
Se il cuore viene perfuso con successo, il flusso del tampone nel capillare dovrebbe essere visibile appena sotto l'epicardio. Dopo due o tre millilitri di perfusione CIB-EGTA, sostituire il tampone perfusione con mix enzimatico. Dopo aver perfuso da uno a due millilitri, aumentare la velocità della pompa a 1,5 millilitri al minuto.
Utilizzare una pipetta per rimuovere il perfusato accumulato contenente sangue che scorre dal cuore se necessario e interrompere la perfusione quando il volume totale di enzima perfuso raggiunge i 10 millilitri. Alla fine della perfusione, trasferire 10 millilitri di miscela enzimatica dalla siringa a un piatto di coltura di 60 millimetri su un tappetino riscaldante e aggiungere 20 milligrammi di BSA al piatto. Ruotare delicatamente il piatto per sciogliere la polvere e rimuovere l'ago di iniezione e il morsetto dal cuore.
Rimuovere i ventricoli e gli atri dal cuore e posizionare i tessuti nel mix enzimatico integrato in BSA. Per isolare i miociti ventricolari, utilizzare due paia di pinzette per afferrare l'epicardio e tirare delicatamente i ventricoli in piccoli pezzi. Una volta generati tutti i frammenti del ventricolo, disperdere le cellule circa 30 volte con una tubazione delicata e filtrare i detriti non digeriti attraverso un filtro cellulare a rete da 100 micron in un tubo di centrifuga da 15 millilitri.
Dopo la centrifugazione, resospendare il pellet di cardiomiocita nel CIB prebellico integrato con calcio e BSA e incubare le cellule per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, centrifugare nuovamente le cellule e rimosopendire i cardiomiociti precipitati in un volume appropriato di soluzione di resuspensione cellulare per il loro mantenimento a 37 gradi Celsius fino all'analisi a valle. Per isolare i miociti atriali, trasferire gli atri in un contenitore di CIB prebellico integrato con calcio e BSA e strappare gli atri in pezzi come dimostrato.
Utilizzare una pipetta da 20 microlitri impostata su 10 microlitri per interrompere i tessuti tubazionando e raccogliere le cellule dissociate mediante centrifugazione. Quindi rimosodire la cella atriale in un volume appropriato di soluzione di resuspensione cellulare. In questa immagine, si possono osservare miociti ventricolari appena isolati.
Questa procedura di isolamento si traduce in una resa dal 70 all'80% di miociti ventricolari quiescenti a forma di bastone da otto a 10 settimane entro circa cinque ore dall'isolamento. Il rapporto tra cellule vitali appena isolate è inferiore nei topi di età superiore ai due anni. I potenziali d'azione registrati nei miociti ventricolari e atriali sono simili a quelli misurati nelle cellule ottenute con il metodo basato su Langendorff.
L'analisi immunostaining può essere utilizzata per valutare l'organizzazione della struttura sarcomerica dei miociti ventricolari e la trasformazione dei fibroblasti cardiaci in miofibroblasti dopo la sottocultura. L'analisi western blot è raccomandata per determinare l'espressione specifica delle proteine di interesse negli atri e nei ventricoli dopo la lavorazione. Dopo la perfusione con enzimi, le proteine degli atri e dei ventricoli possono essere facilmente omogeneizzate nel tampone di lysis con forza leggera per l'estrazione delle proteine.
È importante controllare la direzione e le profondità dell'inserimento dell'ago. Quando si inserisce l'ago nel ventricolo sinistro, fare attenzione a non perforare il setto ventricolare o a penetrare nella valvola. È possibile modificare la composizione del perfusato a seconda dello scopo dell'esperimento.
Ad esempio, un detergente integrato EGTA può essere utilizzato per realizzare un'impalcatura senza cellule del cuore.
