Transazione transitoria delle forme strobilate di Echinococcus granulosus. Descriviamo una tecnica di trasduzione rapida transitoria in diversi stadi di sviluppo di Echinococcus granulosus utilizzando vettori lentivirali di terza generazione. L'echinococcosi cistica o malattia idatide è una delle più importanti malattie parassitarie zoonotiche causate da Echinococcus granulosus, una piccola tenia ospitata nell'intestino dei canini.
C'è un urgente bisogno di ricerca genetica applicata per comprendere i meccanismi di patogenesi e controllo e prevenzione delle malattie. Tuttavia, la mancanza di un efficace sistema di valutazione genica impedisce l'interpretazione diretta della genetica funzionale dei parassiti cestodi, comprese le specie di Echinococcus. I progressi nel trasferimento genico nei platelminti parassiti sono ancora limitati rispetto al parassita protozoo.
L'uso del sistema di consegna virale è emerso come uno strumento essenziale per la consegna transgenica e l'indagine genica / proteica negli ultimi due decenni. Quindi abbiamo valutato la trasduzione transitoria lentivirale del gene reporter GFP ai protoscoleces e ai vermi strobilati di Echinococcus granulosus. La Figura 1 mostra una presentazione schematica del protocollo di studio per gli stadi di Echinococcus granulosus.
Uno, raccogliendo cisti idatide. Raccogli cisti idatidi epatiche da pecore naturalmente infette macellate regolarmente in un mattatoio. Sterilizzare completamente la superficie della cisti utilizzando una garza sterile e alcool al 70% prima di aspirare i protoscoleces.
Aspirare da 20 a 50 mL di liquido idatidico in tubi conici sterili da 50 mL. Dopo il drenaggio, asciugare la cisti con una lama affilata, trasferire lo strato germinale in un tubo conico sterile da 50 ml e scuoterlo per un breve periodo per aumentare la raccolta di protoscoleces. Lavare i protoscoleces con tampone PBS da tre a cinque volte.
Osservare le protoscoleces in 0,1% di eosina per cinque minuti per determinare la vitalità delle protoscoleces al microscopio ottico. Utilizzare protoscoleces con almeno il 95% di vitalità per la cultura. Trattare i protoscoleces precipitare con due ml di pepsina per 15-20 minuti.
Per isolare le singole protoscoleces, risospesso il sedimento protoscoleces in PBS e passarlo attraverso due strati di garza sterile in un nuovo tubo conico sterile da 50 ml. Due, coltivazione bifasica di protoscoleces di Echinococcus granulosus per ottenere vermi adulti. Aggiungere 10 ml del mezzo di fase liquida a ciascun pallone di coltura quadrato di 25 centimetri.
Aggiungere circa 5.000 protoscoleces al pallone di coltura e trasferirlo all'incubatore a CO2. Dopo 24-48 ore, trasferire i protoscoleces in un nuovo matraccio con la fase solida e aggiungere un mL dello stesso mezzo di fase liquida fresca per pallone. Trasferire i palloni nell'incubatore, 37 gradi Celsius, 5% CO2.
Ogni cinque o sette giorni, sostituire il mezzo con un mezzo di fase liquido fresco. Tre, coltivazione monofasica di protoscoleces di un Echinococcus granulosus. Assicurarsi che la coltivazione monofasica sia effettuata da 24 a 48 ore prima della trasduzione.
Coltura circa 5.000 protoscoleces in un pallone di coltura quadrato di 25 centimetri con RPMI e 10% FBS. Trasferire i palloni nell'incubatore a CO2 fino all'uso. Quattro, coltura cellulare per la produzione e la preparazione del virus.
Trasferire 500.000 cellule HEK in un pallone quadrato di 25 centimetri contenente 5 ml di DMEM con 10% FBS, 100 U / mL di penicillina e 100 microgrammi / mL di streptomicina. Incubare le cellule HEK2 a 37 gradi Celsius nel 5% di CO2 e passarle nel terreno di coltura completo ogni 48 ore. Infine utilizzare celle HEK a basso passaggio per la trasduzione.
Cinque, produzione e preparazione del virus con i vettori lentivirali di terza generazione. Il primo giorno, dopo aver tripsinato le cellule HEK in piastre di coltura a 6 pozzetti, semina 70.000 cellule per pozzo con DMEM fresco privo di antibiotici contenente il 10% di FBS. Utilizzare cellule con una confluenza compresa tra il 50 e il 60% per la trasduzione con il metodo del fosfato di calcio.
Secondo giorno, sostituire il terreno di coltura cellulare due o tre ore prima dell'esperimento con DMEM fresco privo di antibiotici contenente il 2% di FBS. In un tubo da 1,5 mL, mescolare plasmidi lentivirali di terza generazione, tra cui 7 microgrammi / microlitro pCDH513b vettore di trasferimento, 4 microgrammi / microlitro PLPII, 4 microgrammi / microlitro PLPI e 2 microgrammi / microlitro PMD2G vettori helper. Aggiungere il tampone HEPES alla miscela per raggiungere il volume di 422 microlitri.
Aggiungere 16 microlitri di tampone 1%TE alla miscela. Aggiungere 62 microlitri di 2,5 ml di cloruro di calcio ai tubi e mescolare bene. Aggiungere 500 microlitri di 2x tampone HBS alla miscela, goccia a goccia entro uno o due minuti usando una pipetta Pasteur.
Mescolare delicatamente fino ad ottenere una soluzione semi-opaca e incubare la miscela per 20 minuti a temperatura ambiente. Alla fine, aggiungere lentamente la miscela a ciascun piatto e distribuirla con lenti movimenti circolari. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius in un incubatore a CO2 al 5% e sostituire il mezzo dopo quattro-sei ore con DMEM privo di antibiotici contenente il 10% di FBS.
Terzo giorno, confermare il successo della trasduzione transitoria e della vitalità cellulare utilizzando un microscopio a fluorescenza invertita. Quarto giorno, raccogliere i virus dal terreno di coltura raccogliendo il surnatante di ciascun pozzo e conservarli a 70 gradi Celsius negativi fino all'uso. Sei, trasduzione transitoria di diversi stadi di Echinococcus granulosus con il virus.
Il primo giorno, utilizzare una piastra di coltura a 12 pozzetti per il trasferimento genico. Coltura da 5.000 a 50.000 cellule HEK in triplicati con un mezzo DMEM completo come riferimento interno. Coltura 150 protoscoleces fresche in triplicati in RPMI e 10%FBS.
Coltura 30 vermi strobilati in triplice copia in DMEM e FBS inattivato al calore al 10%. Preparare una miscela di 1 milione di virus con quattro microgrammi/mL di reagente di trasfezione per trasdurre le cellule HEK e le diverse fasi del worm. Aggiungere lentamente il composto a ciascun piatto e distribuirlo con lenti movimenti circolari.
Incubare le piastre per quattro-sei ore in un incubatore a CO2, 37 gradi Celsius, 5% CO2. Sostituire il mezzo per ciascun campione con lo stesso terreno di coltura completo per ridurre al minimo gli effetti tossici dei reagenti di trasfezione. Secondo giorno, ripetere due passaggi precedenti per aumentare l'efficienza della trasduzione transitoria per le cellule HEK, protoscoleces e vermi strobilati.
Incubare tutte le piastre per 24-48 ore in un incubatore a CO2 con le stesse condizioni di coltura in base al tipo di mezzo cellulare. Terzo giorno, assicurarsi che la trasduzione abbia successo utilizzando la microscopia a fluorescenza. Risultati rappresentativi.
Qui descriviamo una tecnica di trasduzione transitoria rapida ed efficiente in Echinococcus granulosus utilizzando vettori lentivirali di terza generazione. Abbiamo coltivato protoscoleces in terreni di coltura bifasici per ottenere vermi strobilati secondo i nostri studi precedenti. I protoscoleces vengono sviluppati nei vermi strobilati dopo una coltura in vitro di sei settimane.
Diversi stadi di Echinococcus granulosus sono stati osservati nel terreno di coltura bifasico, tra cui protoscoleces invaginati, Figura 2A, protoscoleces evaginate, Figura 2B e vermi strobilati con prima e terza formazione progglottide, Figura 2C attraverso E.Protoscoleces e i vermi strobilati ottenuti da coltivazioni monofasiche e bifasiche, rispettivamente, sono stati trasfettati da lentivirus che esprimono GFP, Figura 3. Le celle HEK hanno chiaramente espresso GFP come controllo del processo di trasduzione transitoria. I vermi adulti esprimevano GFP più distintamente nello strato tegumentale.
Tuttavia, i protoscoleces hanno dimostrato un livello leggermente inferiore di espressione della GFP dopo 48 ore. Alcuni residui di fluido cisti e/o detriti dello strato germinale intorno ai protoscoleces hanno causato un fondo di fluorescenza nei campioni trasfettati. L'intensità della fluorescenza nelle cellule HEK e nei vermi strobilati è aumentata dopo 24 e 48 ore.
Comprendere le basi molecolari dei nematodi e la biologia di Platyhelminthes è una delle frontiere più importanti nella patogenicità dei parassiti zoonotici. La mancanza di un efficace sistema di valutazione genica è un grosso ostacolo all'interpretazione diretta della genetica funzionale dei parassiti cestodi, comprese le specie di Echinococcus. L'obiettivo principale di questo lavoro era quello di illustrare il processo di trasduzione del vettore lentivirale che sarà fondamentale nella futura ricerca sull'echinococcosi.
I risultati mostrano che i vermi strobilati sono più sensibili alla trasduzione transitoria del gene rispetto ai protoscoleces, che possono essere il risultato di un'estesa struttura tegumentale nelle forme strobilate. Tuttavia, a causa della natura della trasduzione lentivirale, l'intensità di fluorescenza nei protoscoleces multicellulari e nei vermi strobilati è in genere molto inferiore rispetto alle cellule HEK monostrato. C'è un urgente bisogno di ricerca genetica applicata a livello genomico e trascrittomico per Echinococcus, nonché un'ampia varietà di sistemi modello di vermi piatti parassiti e liberi.
Pertanto, lo sviluppo del processo di trasferimento genico alle tenie apre la strada a un potenziale utilizzo delle nuove tecniche come la mappatura genica basata su virus o l'editing genetico mediato da CRISPR-Cas9. Questo lavoro presenta la trasduzione lentivirale in un modello di tenia e dimostra risultati promettenti con potenziali implicazioni per la biologia dei vermi piatti. Sono necessari studi ancora più approfonditi per migliorare i metodi e sviluppare l'applicabilità di queste tecniche per esperimenti futuri.
