Questo protocollo è significativo perché l'uso di tessuti congelati semplifica la logistica quando si valutano più tessuti, consente il trasferimento del campione in un laboratorio remoto per l'analisi e consente di rinviare la decisione di analizzare un tessuto per mesi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'uso di tessuto cubico congelato non richiede personale addestrato nel test della cometa alla necroscopia e riduce al minimo l'opportunità di errori tecnici e danni meccanici al DNA introdotti durante la manipolazione del campione. Questa tecnica ha applicazione nello sviluppo di farmaci precli clinici, nella valutazione della sicurezza delle sostanze chimiche che entrano nell'ambiente e negli additivi alimentari.
I tessuti congelati possono essere utilizzati nel saggio della cometa per valutare il potenziale genotossico, la riparazione del DNA, gli effetti protettivi contro i danni al DNA indotti dalla chemioterapia o dalle radiazioni e per il bio-monitoraggio ambientale. Idealmente, gli esperimenti dovrebbero essere progettati per consentire la lavorazione di ogni campione di tessuto nella fase di congelamento prima che gli organi raccolti dall'animale successivo diventino disponibili per la lavorazione. I tessuti congelati possono essere citato in giudizio nel saggio cometa per valutare il potenziale genotossico, la riparazione del DNA, gli effetti protettivi contro i danni al DNA indotti dalla chemioterapia o dalle radiazioni e per il bio-monitoraggio ambientale.
L'allenatore tecnico Carole Bobbitt e il responsabile del laboratorio di tossicologia investigativa Eileen Gilas fungeranno oggi da prosettori. Lincoln Martin, ricercatore associato, e il tecnico istologico Amelie Ladesseur diranno la gestione dei campioni. Per iniziare questa procedura, rimuovere qualsiasi tessuto di collegamento collegato, organi e detriti da un organo di interesse.
Far scorrere immediatamente vigorosamente l'organo in una barca di peso di medie dimensioni contenente circa sette millilitri di soluzione di tritacanzio fredda e preparata al momento per rimuovere sangue e detriti residui. Trasferire l'organo su un'altra barca di pesata pulita contenente una soluzione di tritacarne a freddo sufficiente a mantenere il tessuto sommerso e mantenerlo sul ghiaccio fino a un'ulteriore lavorazione. Per il fegato, tagliare una sezione longitudinale di cinque millimetri del lobo sinistro e frugare delicatamente in circa sette millilitri di soluzione di tritacarne a freddo.
Quindi posizionare la striscia di tessuto in una barca di pesatura pulita di medie dimensioni contenente circa sette millilitri di soluzione di tritacanziamento a freddo e mantenere sul ghiaccio fino a quando non è pronto per l'ulteriore processo. Rimuovere una sezione del fegato e posizionarla in una cassetta di incorporamento. Eseguire il fissaggio, il taglio e l'incorporamento della paraffina secondo le procedure standard di laboratorio per una possibile futura valutazione istopatologia.
Per il duodeno, tagliare una porzione di 10 millimetri del duodeno prossimale allo stomaco. Inserire un ago calibro da 21 a 25 in un'estremità del duodeno e sciacquarlo con un millilitro di soluzione di tritamento a freddo per rimuovere eventuali detriti e batteri. Capovolgere il duodeno, sciacquarlo di nuovo con un altro millilitro di soluzione tritare e scartare l'ago.
Affettare il duodeno e sciacquarlo in circa sette millilitri di soluzione tritare. Quindi risciacquare nuovamente il duodeno e mantenerlo in soluzione tritare sul ghiaccio fino a quando non è pronto per essere ulteriormente processato. Tagliare e fissare una parte del duodeno rimanente per una possibile futura valutazione istopatologia come precedentemente descritto per il fegato.
Per il cervello, può essere utile prima dividere il cervello in due emisferi, con un emisfero salvato per una possibile istopatologia. Sezionare le regioni cerebrali di interesse, quindi risciacquarle delicatamente e mantenere sul ghiaccio in soluzione tritare fino a quando non è pronto per l'ulteriore processo, come descritto in precedenza per il fegato e il duodeno. Per lo stomaco, rimuovere e scartare il forestomach.
Tagliare lo stomaco ghiandolare e lavarlo senza cibo facendolo scorrere in una barca di peso di medie dimensioni contenente circa sette millilitri di tampone di tritacarne a freddo. Rimuovere una striscia di cinque millimetri di stomaco ghiandolare prossimale al duodeno per la fissazione per una possibile valutazione istopatologia come descritto in precedenza. Posizionare lo stomaco rimanente in una barca di peso di medie dimensioni contenente circa sette millilitri di tampone di tritaca e incubare sul ghiaccio per 15-30 minuti.
Successivamente, trasferire lo stomaco in un pezzo pulito di paraffina e utilizzare una lama bisturi o un raschietto di plastica per raschiare delicatamente l'epitelio superficiale almeno due volte per rimuovere i detriti. Raccogliere la mucosa gastrica con le bombore e utilizzare una pipetta per risciacquarla con un millilitro di tampone di tritacarne a freddo. Trasferire il tessuto dello stomaco risciacquato su una superficie o un piatto pulito e aggiungere una soluzione di tritacarne a freddo.
Utilizzare la parte posteriore di una lama bisturi o di un raschietto di plastica per raschiare accuratamente l'epitelio dello stomaco da quattro a cinque volte per rilasciare le cellule. Quindi, utilizzare una pipetta per raccogliere la soluzione di tritamento contenente le cellule rilasciate e trasferirla in un tubo di microcentrifugo sul ghiaccio. Per tritare campioni di tessuto, tagliare una sezione di fegato, cervello o duodeno e trasferirla in un tubo di microcentrifugo etichettato contenente un millilitro di soluzione di tritacarne a freddo.
Utilizzare forbici tritanti per tritare rapidamente il campione fino a quando non viene finalmente disperso, assicurando al contempo che il campione rimanga freddo. Il campione dovrebbe sembrare leggermente nuvoloso. Tuttavia, è comune che rimangano alcuni pezzi che si depositeranno sul fondo del tubo.
Per utilizzare il tessuto mentre è fresco, mantenere i tubi contenenti i campioni sul ghiaccio. Per congelare i campioni di tessuto, fissare il coperchio del tubo immediatamente dopo la tritacanza o la raccolta e far cadere il tubo in un pallone Dewar contenente azoto liquido. Al termine della raccolta dei tessuti, utilizzare una siviere per recuperare i tubi campione e posizionarli sul ghiaccio secco per ordinare.
Trasferire i tubi in una scatola congelatrice su ghiaccio secco e conservare la scatola in un congelatore a meno 80 gradi Celsius. Per preparare cubetti di tessuto congelati, tagliare diversi piccoli pezzi di tessuto e rilasciarli singolarmente direttamente in una barca di peso di medie dimensioni o in un altro recipiente adatto contenente azoto liquido per alcuni secondi. Dopo che i pezzi si sono completamente congelati, trasferire i cubi di tessuto congelato singolarmente su tubi di microcentrifugo etichettati, o crio-tubi, su ghiaccio secco.
Al termine della raccolta dei tessuti, trasferire i tubi in una scatola congelatrice su ghiaccio secco e conservare la scatola in un congelatore a meno 800 gradi Celsius. Quando si utilizza tessuto appena tritato o raschiato mantenuto sul ghiaccio umido, preparare scivoli cometi entro un'ora dal raccolto. Quando si utilizza tessuto tritato o raschiato congelato, posizionare tubi di tessuto congelato in un bagno d'acqua a temperatura ambiente fino a quando i campioni non vengono completamente scongelati garantendo che siano mantenuti freddi.
Una volta scongelati i campioni, trasferire immediatamente i tubi sul ghiaccio. Per il tessuto a cubetti, recuperare i tubi contenenti i cubi dal congelatore e mantenere sul ghiaccio secco fino alla preparazione dello scivolo. Aliquota un millilitro del mezzo del commerciante o una soluzione di tritacarne in un tubo di microcentrifugo da 1,7 millilitri etichettato per ogni campione e mantenere sul ghiaccio.
Lavorando rapidamente per evitare lo scongelamento, posizionare un cubo di tessuto all'estremità aperta di un dispositivo di tritacamento del tessuto a temperatura ambiente. Inserire rapidamente uno stantuffo di siringhe abbinato di dimensioni nel dispositivo per spingere il tessuto nell'estremità della rete, che dovrebbe quindi essere posizionato nel tubo di microcentrifugo contenente la soluzione di tritacanza fredda. Immergere l'estremità della rete del dispositivo per circa cinque-10 secondi nella soluzione di tritacamento a freddo per consentire al tessuto di scongelarsi completamente.
Deprimere completamente lo stantuffo fino a quando le cellule non vengono viste estrudere attraverso i pori della rete. Quindi tirare lo stantuffo verso l'alto di circa 2,5 centimetri e premere di nuovo completamente verso il basso. Ripetere più volte, fino a quando la soluzione di tritamento diventa torbida.
Per preparare i vetrini, mescolare delicatamente una sospensione cellulare e trasferire 50 microlitri in un tubo contenente 450 microlitri di agarosio a punti di fusione bassi dello 0,5% a 37 gradi Celsius. Preparare e segnare le diapositive come indicato nel protocollo di testo. Nel primo studio, il fegato è stato raccolto da due coorti di ratti maschi di controllo dei veicoli Sprague Dawley scaglionato di una settimana.
Le diapositive venivano preparate da tessuto appena tritato, tessuto tritato congelato e tessuto a cubetti congelato. Poiché il limite superiore raccomandato dall'OCSE per il DNA della coda percentuale nel fegato di ratto fresco è del 6%, questi risultati dimostrano che uno qualsiasi dei metodi di congelamento può funzionare bene per valutare i tessuti. Nel complesso, la percentuale di ricci era parallela al DNA della coda percentuale, anche se i tessuti congelati mostravano una maggiore variabilità.
Nel secondo studio, ai topi B6C3F1 femminili è stato somministrato un veicolo o il mutageno etilico metanosolfonato. I risultati percentuali del DNA della coda indicano che il tessuto epatico congelato come cubetti e successivamente lavorato utilizzando il dispositivo di tritaca tissutale ha prodotto risultati molto simili a quelli ottenuti per il tessuto appena tritato. Un aumento statisticamente significativo del danno al DNA indotto dallo SME è stato misurato in campioni di tessuto elaborati con tutti e tre i metodi.
Nel terzo studio sono stati analizzati campioni di fegato raccolti da topi B6C3F1 femminili in uno studio di tossicità chimica di 90 giorni. Il danno al DNA nel tessuto tritato congelato era elevato in tutti i gruppi di dosi, con una sostanziale variabilità da animale a animale. I risultati del DNA della coda percentuale sono correlati con i ricci percentuale, indicando che i ricci hanno contribuito in modo sostanziale all'alto livello di danno al DNA osservato in questi campioni.
Al contrario, sia il DNA danneggiato che i ricci percentuale erano molto bassi nel tessuto a cubetti congelato flash che era stato preparato in parallelo con i campioni di tessuto tritato. Pertanto, le cellule altamente danneggiate manifestate come ricci nei campioni di tessuto tritato chiaramente non erano il risultato di un processo biologico, ma erano probabilmente introdotte da interruzioni meccaniche e, o riscaldamento dei tessuti durante la procedura di tritacanza prima di essere congelate dal flash. Pertanto, i dati per il tessuto tritato sono stati considerati inaffidabili.
In confronto, i dati di alta qualità sono stati ottenuti dal tessuto a cubetti congelato, anche dopo una conservazione prolungata. È fondamentale mantenere i tessuti raccolti freddi e umidi e lavorare rapidamente per congelare i campioni. Inoltre, il tessuto cubico congelato deve essere scongelato immediatamente prima della fase di omogeneizzazione.
I campioni di tessuto congelato sono adatti per altre applicazioni a valle, tra cui, ad esempio, modifiche del saggio della cometa per rilevare danni ossidativi o reti incrociati e la valutazione dei cambiamenti nell'espressione genica. Si deve prestare attenzione durante la manipolazione delle lame bisturi per tagliare o raschiare i tessuti e quando si maneggia azoto liquido durante il processo di congelamento.
