Elementi regolatori cis come promotori e potenziatori sono determinanti chiave dell'espressione genica. Gli approcci tradizionali per studiare questi elementi sono laboriosi e spesso comportano l'uso di geni reporter eterologi. Qui dimostriamo l'uso di CRISPR per esaminare il ruolo trascrizionale di un silenziatore intronico RUNX1 nella linea cellulare della leucemia.
Il protocollo è semplice da eseguire e consente valutazioni veloci delle funzioni di regolazione genica nel contesto genico endogeno. Le cellule ematopoietiche sono spesso difficili da trasfetto con metodi a base di plasmide. In questo protocollo, usiamo l'elettroporazione per fornire Cas9 preassemblato, RNA guida, complessi nelle cellule.
I vantaggi di questo approccio includono l'uso di una migliore efficienza di modifica e vitalità delle celle, nonché la riduzione degli effetti fuori bersaglio. Inoltre, l'uso successivo dell'analisi dei frammenti consente uno screening semplice e veloce dei cloni mutanti desiderati da una grande quantità di campioni. A dimostrare la procedura sarà Yuk-Lin Yung, tecnico del mio laboratorio.
Inizia progettando due RNA CRISPR, uno da cinque primi e l'altro tre primi dell'elemento regolatore cis target, o CRE. Assicurarsi che un PAM di NGG si trovi immediatamente a valle della sequenza di destinazione per il riconoscimento Cas9. Per formare il complesso del gRNA, combinare l'RNA CRISPR e l'RNA tracciante nel buffer TE secondo le direzioni manoscritte, per una concentrazione finale duplex di 44 micromolare.
Incubare la miscela a 95 gradi celsius per cinque minuti e lasciare raffreddare a temperatura ambiente. Diluire la nucleasi Cas9 ricombinante con PBS per una concentrazione finale di nucleasi di 36 micromolare. Quindi mescolare un volume uguale della nucleasi diluita con ciascuno dei duplex gRNA e incubarli per 20 minuti a temperatura ambiente per consentire al complesso RNP di formarsi.
Centrifuga 2,5 milioni di cellule in un tubo da 1,5 millilitri a 500 volte g per cinque minuti. Quindi scartare il supernatante e sospendere di nuovo le cellule in 163 microlitri di mezzo RPMI 1640 senza rosso fenolo. Aggiungere 16,7 microlitri del complesso RNP e 3,6 microlitri di 100 esaltatori di elettroporazione micromolare alle celle e trasferire la miscela in una cuvetta di elettroporazione a gap di 0,2 centimetri, facendo attenzione a non introdurre bolle.
Elettroporare le cellule e trasferirle in un pallone da coltura tissutale T-25 contenente 6 millilitri di mezzo RPMI 1640 completo. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Un giorno dopo l'elettroporazione, diluire le cellule a 5000 cellule per millilitro in un mezzo RPMI 1640 completo.
E aggiungere 100 microlitri della sospensione cellulare in ogni pozzo di una piastra di coltura tissutale da 96 porri. Coltura delle cellule per sette o 14 giorni, quindi estrarre dna genomico utilizzando un sistema di purificazione ad alta produttività. Aggiungere 100 microlitri di legatura a piastre e tampone di lisi a ciascun pozzo di una piastra di estrazione a 96 pozzi, seguita da 50.000 celle ri-sospese in 10 microlitri di PBS.
Mescolare il contenuto del pozzo pipettando su e giù. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 30 minuti per consentire al DNA genomico di legarsi ai pozzi. Quindi aspirare con cura la soluzione dai pozzi e lavarli con 120 microlitri di tampone di lavaggio.
Asciugare all'aria la piastra. Aggiungere 20 microlitri di mix PCR a ciascun pozzo ed eseguire PCR secondo le indicazioni manoscritte. Una volta completata l'amplificazione, stimare la quantità del prodotto misurando la concentrazione di un numero selezionato di campioni con un fluorometro.
Diluire tutti i campioni a 0,5 nanogrammi per microlitro con acqua priva di nucleasi. Mescolare un microlitro del prodotto PCR diluito con 8,5 microlitri di formamide deionizzata e 0,5 microlitri di dimensioni fluorescenti etichettate coloranti standard in una piattaforma da 96 pozzetti compatibile con l'analizzatore genetico. Coprire la piastra con un setto di piastre e denaturare i campioni a 95 gradi Celsius per tre minuti in un termociclo.
Eseguire l'elettroforesi capillare per separare i prodotti PCR etichettati e analizzare i risultati sul software di analisi. Controllare l'icona arancione per visualizzare i frammenti etichettati e lo standard di dimensione per valutare la qualità delle chiamate di dimensioni. Quindi, controlla l'icona blu per visualizzare i prodotti PCR etichettati.
Identificare i picchi corrispondenti ai prodotti di tipo selvaggio e mutante e stimare il livello mutante in ogni campione dividendo l'area sotto il picco mutante per la somma dell'area sotto i picchi di tipo selvaggio e mutante. Selezionare più pool di celle con livelli elevati delle eliminazioni previste per ulteriori diluizioni seriali. Ripetere i passaggi di estrazione del DNA, PCR fluorescente ed elettroforesi capillare e selezionare cloni con livelli mutanti superiori al 95% per l'analisi successiva.
Estrarre l'RNA totale dai cloni selezionati ed eseguire la sintesi gratuita del DNA. Mescolare l'RNA con un primer poli-T e dNTP secondo le indicazioni manoscritte e incubare a 65 gradi Celsius per cinque minuti. Quindi, posizionare la reazione sul ghiaccio per almeno un minuto.
Aggiungere dieci microlitri di mix di sintesi cDNA alla reazione. Quindi incubare il campione a 50 gradi Celsius per 50 minuti e 85 gradi Celsius per cinque minuti in un termociclo. Dopo la sintesi del cDNA, trattare i campioni con un microlitro di RNasi H e incubarli a 37 gradi Celsius per 20 minuti.
Progetta primer e sonde TaqMan specificamente per la varianza della trascrizione individuale generata da promotori alternativi e clona i frammenti di DNA contenenti le specifiche sequenze di trascrizione nel DNA plasmide. Fai una serie di diluizione dieci volte dei plasmidi ricombinanti come curve standard per la quantificazione della trascrizione. Preparare 20 microlitri di mix PCR per ogni campione ed eseguire la PCR in tempo reale secondo le indicazioni manoscritte.
Analizzare i risultati e normalizzare il numero di copie delle trascrizioni di destinazione in ogni campione con un gene di pulizia. Questo protocollo è stato utilizzato con successo per eliminare il silenziatore intronico RUNX1 e la cancellazione è stata confermata con elettroforesi a gel capillare. Le dimensioni previste dei prodotti PCR di tipo selvaggio e mutante sono rispettivamente di circa 500 coppie di basi e 230 coppie di basi.
Le dimensioni dei prodotti mutanti possono variare tra i cloni a causa degli indeli formati nei siti di scissione. Il sequenziamento di Sanger è stato utilizzato per confermare l'identità delle eliminazioni. Il gene RUNX1 contiene due promotori, P1 e P2 che hanno prodotto tre trascrizioni principali di mRNA:RUNX1c di P1, e RUNX1a e RUNX1b di P2. La PCR quantitativa in tempo reale può essere utilizzata per determinare in che modo l'eliminazione dell'elemento silenziatore influisce sull'espressione di queste trascrizioni.
Un buon design degli RNA CRISPR è importante per la sua valutazione dell'esperimento. Assicurarsi che l'RNA CRSIPR sia strettamente collegato all'area di eliminazione prevista. Inoltre, assicurarsi che una sequenza PAM si trovi a valle della sequenza di destinazione per il riconoscimento Cas9.
Oltre a studiare i CRE, questa strategia può essere utilizzata per studi sulla posizione genica e funge da alternativa all'interferenza dell'RNA per esaminare le funzioni geniche. Combinando con le tecniche di cattura della conformazione cromosomica, CRISPR aiuterà certamente a decifrare i coinvolgimento dei CRE nell'organizzazione del genoma alterato e nell'espressione genica legata a vari problemi di salute come il cancro.
