Lo studio della funzione genica e delle malattie è ostacolato dalla natura di razza della popolazione umana. I diversi background genetici delle linee cellulari iPS specifiche del paziente e di controllo possono influenzare l'efficienza di differenziazione e i fenotipi trovati in un dato test funzionale. L'uso di linee geneticamente identiche o isogeniche in cui l'unica differenza è la particolare mutazione di interesse è fondamentale per superare questi problemi.
Molte malattie umane sono causate da mutazioni eterozigoti, che possono essere difficili da generare con il sistema CRISPR-Cas9. Ciò è dovuto alla generazione di mutazioni indeli nell'allele non mirato che possono verificarsi ad altissima frequenza. La nostra tecnica supera questo problema utilizzando due modelli di riparazione di cui solo uno ospita la mutazione di interesse.
Qualsiasi ricercatore che prova questa tecnica dovrebbe essere abile nella coltura di cellule staminali pluripotenti umane. La dimostrazione video della selezione della colonia sarà utile per mostrare le dimensioni e la morfologia corrette, nonché la tecnica utilizzata per la raccolta e lo screening. A dimostrare questa procedura sarà Leo Cardenas.
Per cominciare, placcare gli ESC umani su MEF irradiati in una piastra a 6 poc. Preparare il mix di master di trasfezione. Mescolare con pipettazione e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti.
Quando le cellule raggiungono il 70-80% di confluenza, quindi, aggiungere la miscela master di trasfezione goccia saggia ad ogni pozzo con le cellule e incubare a 37 gradi Celsius per 48 ore. Cambia il supporto ogni 24 ore. Per raccogliere le cellule, in primo luogo, incubare le cellule con Tripla E per tre minuti a temperatura ambiente per rimuovere i MEF enzimaticamente.
Aggiungere 0,5 millilitri di mezzo HESC con 10 inibitori ROCK micromolari. Celle a pellet a 300 volte g per tre minuti e sospensione in 0,5 millilitri di mezzo ESC umano con inibitore ROCK micromolare 10. Filtrare la sospensione cellulare in un tubo da cinque millilitri attraverso un tappo filtrante a celle da 35 micron.
Usando lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza, gate su cellule vive e ordinare le cellule positive alle proteine fluorescenti verdi. Successivamente, trasferire un massimo di 1,5 per 10 alle quattro cellule smistate direttamente in un piatto di 10 centimetri rivestito con matrice di membrana basale da uno a tre e MEF irradiati e mezzo ESC umano contenente inibitore ROCK. Cambiare mezzo ogni giorno utilizzando il mezzo ESC umano senza inibitore ROCK.
Dopo 10-15 giorni, le colonie hanno un diametro di circa uno o due millimetri. Al microscopio, utilizzare una pipetta P200 per raschiare con cura un singolo clone e disegnare cellule nella pipetta. Disperdere le cellule in un pozzo di una piastra di 96 po 'coniando delicatamente da tre a quattro volte nel mezzo redatto con la colonia.
Quindi, scegli 20 colonie per ogni RNA guida e dispensa in tubi a strisce PCR per lo screening. Pellettò le cellule per centrifugazione a 10.000 volte G per cinque minuti. Ora, incubare pellet cellulari in 20 microlitri di proteinasi K tampone per isolare vigorosamente DNA e vortice.
Centrifuga a 10.000 volte G per cinque minuti. Successivamente, eseguire lo screening PCR del DNA modificato. Aggiungere nei tubi 20 microlitri di un master mix, compresi i primer avanti e indietro, progettati per amplificare la regione di interesse, così come cinque microlitri del digest Proteinase K.
Utilizzare DNA genomico isolato dalla linea iPSC di controllo per confermare un'amplicon pulita durante l'esecuzione della PCR di screening. Valutare le variazioni di dimensione dei prodotti PCR dopo un'ora di elettroforesi a 70-90 volt con un peso del 2,5% in volume in gel di agarosio. Qualsiasi differenza di dimensione è indicativa della scissione.
Per trasfetto il DNA dell'oligo a singolo filamento e i plasmidi CRISPR-Cas9, placcare la linea cellulare bersaglio in un piatto da 6 po 'su MEF irradiati per raggiungere la confluenza dal 70 all'80% dopo un'incubazione durante la notte. Impostare la reazione di trasfezione come descritto. Mescolare la reazione con pipettazione e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
Quindi, aggiungere la miscela di reazione di trasfezione cadere saggiamente alle cellule. Dopo 48 ore, preparare le celle per l'ordinamento delle celle come in precedenza. Circa 10 giorni dopo aver placcato singole cellule, utilizzare una pipetta da 200 microliter per raccogliere colonie in tubi di strisce PCR e in un pozzo di una piastra da 12 pozzetti pre-rivestita con gelatina e MEF.
Trasferire 100 microlitri delle cellule in ogni pozzo di una piastra da 24 o 48 porri, precedentemente rivestita con gelatina e MEF irradiati nel mezzo ESC umano con inibitore ROCK. Utilizzare i restanti 100 microlitri per l'isolamento del DNA. Per verificare la riuscita integrazione del DNA dell'oligo a singolo filamento, prendere cinque microlitri di DNA isolati da ogni colonia per eseguire la PCR utilizzando i primer di screening precedentemente progettati.
Purificare i prodotti PCR e preparare i 40 microlitri della digestione enzimatica di restrizione utilizzando l'esclusivo sito enzimatico creato nel DNA dell'oligo a singolo filamento. Mescolare la reazione con pipettazione e incubare alla temperatura raccomandata dal produttore per una o tre ore. Quindi, visualizzare i prodotti PCR digeriti aggiunti con un colorante di carico su un gel di agaro al bromuro di etidio dell'1,5% in volume, elettroforescente a 80-100 volt per 40 minuti.
Se si è verificata un'integrazione riuscita del DNA dell'oligo a singolo filamento, sequenziare mutazioni specifiche usando un primer annidato. In questo studio, per la costruzione dell'RNA guida, una banda di 100 coppie di basi è stata asportata da un gel di agarosio dell'1,5%. Dopo la trasfezione cellulare, la convalida del taglio dell'RNA guida è stata visualizzata utilizzando un gel di agarosio al 2,5%.
Un prodotto PCR a 180 coppie di basi mostrava un controllo non tagliato e diversi cloni con turni di banda che indicavano la formazione di indele. Diverse RNA guida avevano diverse efficienze di taglio. Per evitare il ritaglio CRISPR-Cas9 degli alleli modificati, la sequenza PAM è stata modificata usando una mutazione silenziosa da G a A.
Una mutazione silenziosa nella sequenza PAM ha generato un sito di restrizione univoco, che aiuta a schermare per un'integrazione riuscita in uno o due alleli. Le linee di cellule staminali modificate dal genoma possono essere utilizzate nelle differenziazioni a valle e nei saggi funzionali per studiare l'effetto di una data mutazione sullo sviluppo umano e sulle malattie. Questa metodologia consente la generazione di linee cellulari isogeniche con specifiche mutazioni eterozigoti o omozigoti, implicate in un'ampia varietà di malattie umane.
Questi modelli di malattia aprono la strada allo sviluppo di nuove terapie cellulari e offrono piattaforme per la scoperta di farmaci.
