I saggi basati su TR-FRET forniscono nuovi strumenti economicamente vantaggiosi per lo screening e la caratterizzazione farmacologica di modulatori specifici e selettivi delle vie di segnalazione JAK/STAT. Questa tecnica è molto più semplice, rapida, riproducibile e robusta rispetto ai metodi convenzionali come Western blot ed ELISA. Non sono necessarie fasi di lavaggio e i reagenti vengono aggiunti in un unico passaggio.
Questa piattaforma di immunodosaggio può essere facilmente applicata ad altre proteine di segnalazione cellulare a condizione che siano disponibili anticorpi specifici. Per progettare saggi riproducibili, è necessario utilizzare buone pratiche di coltura cellulare e stabilire procedure operative standard. Inoltre, è necessario ottimizzare attentamente le condizioni di coltura e trattamento cellulare.
A dimostrare la procedura sarà Genevieve Chatel, una scienziata del nostro laboratorio. Per iniziare, coltiva le cellule HeLa e A431 in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica utilizzando DMEM integrato con 10% FBS. Quando le cellule raggiungono il 70-80% di confluenza, tripsilizzarle e passarle o usarle per i test.
Per eseguire il test, erogare 50 microlitri di cellule alla densità pre-ottimizzata in una piastra trattata con coltura tissutale a 96 pozzetti nel terreno di coltura appropriato, quindi incubarli durante la notte in un incubatore di anidride carbonica a 37 gradi Celsius e al 5%. Il giorno seguente, preparare serie intermedie di diluizione doppie e quadruple dei composti in esame diluendo in serie il composto in un mezzo privo di siero su 12 pozzetti di una piastra di polipropilene a 96 pozzetti. Per la stimolazione cellulare, aggiungere 50 microlitri di mezzo privo di siero contenente il simulatore a una concentrazione 2X e incubare le cellule per il tempo pre-ottimizzato a temperatura ambiente o 37 gradi.
Per l'inibizione cellulare, aggiungere 25 microlitri di mezzo privo di siero contenente l'inibitore a una concentrazione 4X e incubare le cellule per il tempo pre-ottimizzato a temperatura ambiente o 37 gradi, quindi aggiungere 25 microlitri di mezzo privo di siero contenente lo stimolatore a una concentrazione 4X e incubare per il tempo pre-ottimizzato. Successivamente, per lisare le cellule, preparare il tampone di lisi integrato 1X e aggiungere cocktail di inibitori della fosfatasi ad esso. Dopo aver accuratamente rimosso e scartato il terreno di coltura cellulare, aggiungere immediatamente 50 microlitri del tampone di lisi integrato 1X preparato e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente sotto agitazione con agitazione moderata.
Per il rilevamento TR-FRET, preparare la miscela di rilevamento degli anticorpi 4X nel tampone di rilevamento 1X, quindi preparare le soluzioni anticorpali EUAB1 e FRAB2, nonché le soluzioni anticorpali EUAB3 e FRAB4 nel tampone di rilevamento 1X. Infine, mescolare EUAB1 pre-diluito con FRAB2 pre-diluito per il rilevamento di fosfoproteine e EUAB3 pre-diluito e FRAB4 pre-diluito per il rilevamento di proteine totali. Quindi pipettare con cura 15 microlitri del lisato cellulare dalla piastra di coltura a 96 pozzetti a un pozzo di una micropiastra bianca a basso volume da 384 pozzetti.
Quindi, aggiungere 15 microlitri del lisato di controllo positivo e 15 microlitri del tampone di lisi 1X come controllo negativo per separare i pozzetti di analisi. Ai pozzetti contenenti 15 microlitri del lisato, aggiungere cinque microlitri della corrispondente miscela di rilevamento degli anticorpi 4X per rilevare la fosfoproteina o la proteina totale. Dopo aver coperto la piastra con un sigillante a piastre, incubarla a temperatura ambiente per un'ora o durante la notte a seconda del kit di analisi.
Al termine dell'incubazione, rimuovere il sigillante per piastre adesive e leggere la piastra su un lettore di micropiastre compatibile TR-FRET. I risultati dei saggi TR-FRET per il rilevamento e la quantificazione del fosfo-STAT1 con STAT1 totale e fosfo-STAT4 nelle cellule U266B1 insieme al fosfo-STAT5 con STAT5 totale nelle cellule A431 sono rappresentati utilizzando curve di risposta alla concentrazione. Allo stesso modo, i saggi TR-FRET per il rilevamento e la quantificazione di fosfo-STAT3 e STAT3 totale e fosfo-STAT6 e STAT6 totale nelle cellule HeLa sono rappresentati utilizzando curve di risposta alla concentrazione.
Nel complesso, tutti i saggi hanno mostrato robusti segnali TR-FRET, ampie gamme dinamiche, bassa variazione del coefficiente inter-pozzo e rapporti segnale-sfondo accettabili. Il trattamento delle cellule con attivatori JAK, interferone alfa-2B e IL-4 ed EGF ha mostrato l'aumento dipendente dalla concentrazione previsto della fosforilazione STAT a specifici residui di tirosina, mentre le corrispondenti proteine STAT totali sono rimaste stabili. Sia l'inibitore JAK che erlotinib hanno inibito i corrispondenti livelli di fosfo-STAT in modo dipendente dalla concentrazione.
I risultati della stimolazione fosfo-STAT4 da parte dell'interferone alfa-2B in una linea cellulare in sospensione o della stimolazione fosfo-STAT6 da parte di IL-4 in una linea cellulare di aderenza utilizzando il protocollo a una piastra erano coerenti con quelli ottenuti utilizzando il protocollo a due piastre, mostrando così la riuscita adattabilità di un protocollo di trasferimento a due piastre a un protocollo all-in-one a un pozzo all-in-one a una piastra. I risultati dello studio di variabilità intra-piastra per il saggio fosfo-STAT1 utilizzando una linea cellulare in sospensione e il saggio fosfo-STAT3 utilizzando una linea cellulare di aderenza dimostrano la robustezza di questi saggi fosfo-STAT per applicazioni HTS. È essenziale integrare il tampone di lisi con il cocktail inibitore della fosfatasi per prevenire la defosforilazione delle proteine fosforilate dalla fosfatasi attiva presente nell'intero estratto cellulare.
