Molti allergeni legano molecole idrofobiche. Questo protocollo consente la completa rimozione e sostituzione di questi ligandi, permettendoci di studiarne l'impatto sulla struttura e sull'immunogenicità in modo sistematico. L'utilizzo di HPLC in fase inversa, abbinato alla ricottura termica, presenta due vantaggi.
Rimuove i ligandi endogeni e aiuta a solubilizzare i ligandi per aprire siti di legame altrimenti inaccessibili. Se siamo in grado di determinare i fattori che contribuiscono all'allergenicità, potremmo essere in grado di progettare terapie che evino questi fattori. Molte proteine legano ligandi lipidici, che sono fortemente mantenuti e possono influenzare sia la struttura che la funzione.
Il nostro metodo consente lo studio sistematico di queste interazioni. La limitata solubilità e accessibilità di molti carichi lipidici può inibire il processo di carico. Assicurati di prenderti cura di quando prepari questi ligandi e di considerare la necessità di adattamenti specifici del sistema.
Poiché lavorare con ligandi idrofobi e insolubili è una regolazione per alcuni allergologi e biochimici, può essere utile vedere come sono i campioni in diversi stadi. Dopo aver clorato l'espressione e la purificazione, applicare 12 millilitri del Bla g 1 scisso su un'unità filtrante centrifuga con un taglio del peso molecolare inferiore a 10 kilodalton per centrifugazioni multiple in un rotore a benna oscillante fino a quando il volume totale non è stato ridotto a meno di due millilitri. Caricare il concentrato risultante su un sistema HPLC da 250 x 10 millimetri dotato di una colonna cromatografica a fase inversa C18 equilibrata con tampone A del 97% e B.Elute Bla g 1 tampone al 3% con una portata da 1,5 a 4 millilitri al minuto, come indicato nella tabella, utilizzando l'assorbanza di fluorescenza a 280 nanometri per monitorare il processo di eluizione.
A partire da circa 34-40 minuti e una concentrazione tampone B superiore al 74% raccolgono non più di quattro millilitri di ciascuna frazione Bla g 1. Aliquota la frazione Bla g 1 raggruppata in provette di vetro. Coprire i tubi con pellicola di paraffina e perforare il film con due fori.
Quindi, congelare i campioni a meno 80 gradi Celsius per un'ora e utilizzare un liofilizzatore per asciugare i campioni di proteine de-lipidati risultanti. Per determinare la resa prevista di Bla g 1, sospendere di nuovo un'aliquota di prova delipidata lyofilizzata in cinque millilitri di tampone di ripiezione. Scaldare la miscela in un bicchiere da 500 millilitri contenente 250 millilitri di acqua a 95 gradi Celsius su una piastra calda con agitazione e vortice intermittente.
Tenere la soluzione a 95 gradi per 30-60 minuti prima di lasciare che il bagno d'acqua si equilibra lentamente a temperatura ambiente. Una volta raffreddata la soluzione, passare la miscela lipidica Bla g 1 ricotta attraverso un filtro siringa da 0,22 micron per rimuovere il particolato e utilizzare un nuovo filtro centrifugo con un cutoff di 10 kilodalton per scambiare la proteina filtrata tre volte in PBS per rimuovere eventuali acidi grassi liberi residui e solvente organico. Quindi, valutare la concentrazione proteica utilizzando un saggio standard di analisi proteica per determinare la resa prevista per le restanti aliquote Bla g 1.
Per ricostituire l'Apo-Bla g 1, sospendere nuovamente le aliquote Bla g 1 in cinque millilitri di tampone di ripiezione per aliquota e ricottura dei campioni come dimostrato. Per caricare il Bla g 1 con fosfolipidi, aggiungere 10 milligrammi del carico desiderato a una provetta di vetro e dissolversi in cloroformio ed evaporare il cloroformio per produrre un film lipidico. Quindi, aggiungere PBS al tubo per produrre una concentrazione finale fosfolipidica di 20 millimolare.
Riscaldare il fosfolipide al di sopra della temperatura di transizione di fase del carico lipidico per reidratare il film lipidico e il vortice fino a quando la soluzione diventa torbida. Quindi, aggiungere il carico lipidico fosfo per produrre un eccesso molare 20X di ligandi rispetto a Bla g 1 in base alla resa prevista. Può formarsi un precipitante.
Vortice da mescolare prima di ricottura della proteina come dimostrato. Per confermare la rimozione o il carico del carico da parte del FOSforo-31 NMR, utilizzare un filtro centrifugo per concentrare il campione su più di 100 micromolari come dimostrato. Preparare campioni fosfolipidici di riferimento di concentrazioni note nel tampone PBS come indicato e diluire il riferimento finale Bla g 1 a un rapporto 1:1 con tampone di colina ad un volume totale di circa 600 microlitri.
Utilizzare una sonda a banda larga per acquisire spettri NMR unidimensionali a 31 fosfori dei campioni di Bla g 1 solubilizzati e degli standard fosfolipidi di riferimento, e confrontare gli spettri NMR fosforo Bla g 1 31 con quelli ottenuti per campioni di riferimento fosfolipidici per confermare la rimozione dei ligandi legati endogenamente e/o il legame dei ligandi desiderati in base agli spostamenti chimici dei picchi visibili, quindi confrontare l'intensità di picco dello spettro Bla g 1 con quella degli standard di riferimento fosfolipidici per consentire la conferma della stochiometria legante completa. Usando la cromatografia di affinità, la GST Bla g 1 ricombinante può essere facilmente isolata ad un alto livello di purezza, producendo una resa da due a quattro milligrammi per litro di coltura cellulare. L'incubazione notturna con proteasi TEV a quattro gradi Celsius è sufficiente per rimuovere l'etichetta GST, producendo il prodotto finale a circa 24 kilodalton.
L'applicazione del Bla g 1 a una colonna C18 in fase inversa produce un profilo di eluizione distintivo, con due picchi di grandi dimensioni al 50% tampone B e un secondo picco grande al 75% tampone B.Gli spettri NMR phosphorus-31 di Apo-Bla g 1 non mostrano fosfolipidi rilevabili. Una curva standard può essere prodotta dalla NMR utilizzando campioni di riferimento di concentrazioni DSPC note. Confrontando l'intensità del segnale fosforoso 31 ottenuta da DSPC Bla g 1 con questa curva standard si può utilizzare per produrre la stechiometria legante dei lipidi per proteina.
Gli spettri circolari di dicroismo per Bla g 1 caricato con Apo e lipidi mostrano minimi di 220 e 210 nanometri, indicativi di una struttura prevalentemente alfa-elicoiale. I saggi di denaturazione termica basati sul dicroismo circolare mostrano anche una perdita cooperativa della struttura secondaria alfa-elicoiale, indicativa di un dominio globulare piegato. Inoltre, l'analisi delle temperature di fusione risultanti rivela un aumento significativo del legame del ligando nMix, coerente con Bla g 1 ottenuto dalla sua fonte allergenica naturale.
Il successo di questo protocollo si basa sulla capacità di superare sia la limitata solubilità dei ligandi idrofobi, sia la natura inaccessibile della cavità di legame Bla g 1. Questa procedura pone le basi per studi immunologici, come i test di proliferazione delle cellule T, per valutare l'effetto dei ligandi lipidici sulla sensibilizzazione e i meccanismi molecolari attraverso i quali ciò avviene. Accoppiando questa procedura con ulteriori saggi biofisici, abbiamo dimostrato che il legame dei ligandi idrofobi migliora la stabilità di Bla g 1, con potenziali implicazioni a valle per la generazione di epitopi e l'allergenicità.
