Il protocollo prevede una semplice procedura per rendere gli esperimenti FRET con emissioni sensibilizzate più riproducibili e comparabili. Il vantaggio principale di FRET sono le misurazioni in tempo reale in modo da poter affrontare i processi dinamici. Per la regolazione laser utilizzando un fotomoltiplicatore di trasmissione, posizionare al microscopio il vetrino a otto pozzetti contenente i protoplasti trasfettati.
Dopo aver selezionato un pozzo vuoto, scegliere la modalità di scansione della linea e la vista dell'istogramma, ridurre al minimo l'intensità del laser e regolare il guadagno del rilevatore in base al rumore di fondo rilevabile. Quindi, aumentare l'intensità del laser a passi dello 0,5% durante la registrazione del segnale corrispondente. Per la regolazione laser utilizzando la modalità riflettente, selezionare un pozzetto vuoto, quindi applicare un filtro di riflessione.
Attivare la modalità di riflessione e assicurarsi che l'intervallo di lunghezze d'onda del rilevatore copra la lunghezza d'onda del laser. Scegli la modalità di scansione della linea e la vista dell'istogramma, riduci al minimo l'intensità del laser e regola il guadagno del rilevatore in base al rumore di fondo rilevabile. Quindi, spostare l'obiettivo nella posizione più bassa prima di spostarlo di nuovo verso l'alto fino a quando il riflesso del coverslip è visibile, quindi aumentare l'intensità del laser a passi dello 0,5% durante la registrazione del segnale corrispondente.
Per la valutazione dei dati, tabulare e ordinare i dati in base alle intensità del segnale, quindi tracciare le intensità del segnale rispetto alla potenza relativa del laser e scegliere le intensità del laser con conseguente intensità del segnale simile. Per la regolazione dei fotomoltiplicatori, selezionare un pozzo vuoto e applicare un filtro di riflessione, passare alla modalità di riflessione e assicurarsi che l'intervallo di lunghezze d'onda del rilevatore copra la lunghezza d'onda del laser. Scegli la modalità di scansione della linea e la vista dell'istogramma, riduci il guadagno del rilevatore alla metà del massimo e regola l'intensità del laser per rilevare il rumore di fondo.
Quindi, spostare l'obiettivo nella posizione più bassa prima di spostarlo di nuovo verso l'alto fino a quando il riflesso del coverslip è visibile, quindi aumentare il guadagno del rilevatore in passi da 50 a 100 volt e registrare il segnale corrispondente. Per la valutazione dei dati, tracciare l'intensità rispetto al guadagno del rilevatore per ciascun rivelatore, quindi scegliere i singoli guadagni del rilevatore per ottenere una sensibilità simile. Per l'acquisizione delle immagini, scegliere i filtri o gli specchi dicroici appropriati e utilizzare lo stesso specchio dicroico per tutti i canali per abilitare la scansione linea per linea, quindi selezionare un obiettivo di immersione in acqua per l'imaging di cellule vive e scegliere la scansione a 12 o 16 bit con velocità di scansione moderata.
Successivamente, definire l'intervallo di rilevamento preferibilmente da 470 a 510 nanometri per il rilevamento del donatore e da 530 a 600 nanometri per il rilevamento dell'accettore nel caso della coppia FRET di proteina fluorescente ciano potenziata o ECFP e proteina fluorescente gialla potenziata o EYFP. Dopo aver applicato il rilevatore e le impostazioni laser come dimostrato in precedenza, rivedere l'intensità del laser in base alla tabella di potenza laser ottenuta, se necessario. Assicurarsi che il rapporto segnale-rumore copra l'intera gamma dinamica dei rilevatori.
Dopo aver messo a punto il diametro del foro stenopeico mantenendo costanti le intensità del laser e i guadagni del rilevatore, eseguire le misurazioni FRET scattando immagini di almeno 20 celle. Per determinare le correzioni della diafonia, eseguire misurazioni FRET con le cellule che esprimono solo il fluoroforo del donatore e quelle che esprimono solo il fluoroforo accettore. Per la calibrazione delle misurazioni, eseguire misurazioni FRET con cellule che esprimono la fusione dell'accettore donatore.
Per la valutazione dei dati, ottenere profili di linea delle celle assicurando che ogni profilo non contenga più di una cella. Salvare i profili come file di testo. Quindi, utilizzando l'opzione di importazione del file di testo nella sezione dati, importare i file di testo in un foglio di calcolo.
Quindi, leggere i valori massimi applicando la funzione max, quindi elencare i valori ottenuti in una tabella con una colonna ciascuno per ID emissione donatore, emissione FRET IF, emissione accetto IA e almeno quattro set di dati, solo donatore, solo accettore, fusione donatore-accettore e misurazione. La regolazione laser ha rivelato un aumento lineare dell'emissione con l'aumentare dell'intensità del laser. Come dimostrato da una pendenza più ripida, l'emissione della linea a 514 nanometri era molto più alta dell'emissione della linea a 458 nanometri.
Variare i guadagni del rivelatore a potenza laser costante ha rivelato un comportamento esponenziale per entrambi i rivelatori analizzati. La discrepanza e il sanguinamento spettrale del donatore e dell'accettore analizzati con proteine purificate ricombinanti e analizzati con cellule che esprimono tali proteine dimostra che è impossibile omettere la determinazione del sanguinamento spettrale nelle cellule viventi probabilmente causato da pigmenti cellulari. L'efficienza FRET tra le subunità ATPA vacuolari marcate, VHA AECFP e VHA AEYFP è diminuita con l'aumentare dell'intensità del segnale.
Al contrario, l'interazione tra VHA E1 ECFP e VHA CEYFP era indipendente dall'intensità del segnale. La scelta di componenti ottici appropriati è fondamentale per il rilevamento del donatore e dell'accettore. Questo protocollo può anche essere applicato per sensori raziometrici in cellule viventi per aumentare la riproducibilità in questi esperimenti.
