Abbiamo sviluppato una metodologia di mappatura FRET che consente l'identificazione e la caratterizzazione dei siti di legame del ligando, l'orientamento delle subunità, i cambiamenti conformazionali associati al legame del ligando e i movimenti dinamici delle proteine. Un vantaggio di questa tecnica è che può essere eseguita in soluzione e le molecole possono muoversi liberamente. Le distanze misurate con questa tecnica sono appropriate per i sistemi biologici.
FRET è ampiamente applicabile a molti sistemi. La mappatura migliora il monitoraggio dei cambiamenti strutturali e dinamici in qualsiasi sistema biomolecolare ed è particolarmente efficace se esistono informazioni strutturali tridimensionali. Dopo aver purificato la proteina, la parte più difficile è etichettare con alta efficienza e rimuovere il colorante libero.
Per gli esperimenti, aiuta ad avere il minor colorante libero possibile. Per iniziare, scegli i siti di etichettatura entro 25-75 angstrom dal sito di legame punitivo e in regioni relativamente statiche della proteina. La distanza determinerà la coppia di coloranti FRET specifica da utilizzare.
Individuare i siti di etichettatura in regioni proteiche relativamente distinte l'una dall'altra. Quindi i siti descrivono i vertici di un triangolo, con il sito di legame punitivo situato al centro. Per misurare i valori di R0, a seconda della dimensione e del volume della cuvetta desiderati, preparare due campioni proteici alla stessa concentrazione di proteine totali.
Uno con la proteina etichettata solo con il colorante del donatore e uno con la proteina etichettata solo con il colorante accettore. Accendere il fluorometro e aprire il programma di acquisizione e analisi spettrale nel software FluorEssence, se si utilizza uno spettrofluorometro. Fare clic sulla M rossa per collegare il computer allo strumento e scegliere Spettri di emissione.
Immettere i parametri di scansione utilizzando la voce di menu raccogli esperimento, ad esempio la lunghezza d'onda di eccitazione, l'intervallo per la scansione delle emissioni, la temperatura e il campione cambiano posizione. Fare clic su RTC e sulle impostazioni ottimizzate dello strumento come descritto nel manoscritto, monitorando l'emissione di fluorescenza al picco utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione impostata al massimo di assorbimento del colorante. Posizionare il campione proteico etichettato dal donatore nel supporto del campione e fare clic su Esegui per generare una scansione delle emissioni della proteina etichettata solo con il colorante del donatore, emozionando il campione al massimo di assorbimento del colorante e scansionando oltre il picco di emissione.
Stabilire una linea di base per la scansione estendendo la scansione a 25-50 nanometri oltre la fine del picco. Misurare la resa quantistica della sola proteina donatrice eseguendo assorbimenti e misurazioni di fluorescenza su campioni di diverse concentrazioni, come descritto nel manoscritto di testo. Preparare campioni di proteine solo donatore, solo proteine accettore e campioni proteici donatore-accettore, alla stessa concentrazione.
Ottenere la scansione del donatore solo per generare spettri di emissione di fluorescenza. Eccitare la soluzione al massimo assorbimento del colorante del donatore e scansionare i picchi di emissione del donatore e dell'accettore. Scambia il campione con l'accettore solo proteina, o cambia il campione cambia la tua posizione nella cuvetta contenente solo la proteina dell'accettore.
Ottenere una scansione delle emissioni della proteina etichettata solo con il colorante accettore. Eccitare il campione alla lunghezza d'onda di eccitazione del donatore. Scambia il campione con il campione di proteina donatore-accettore o cambia il campione cambia la tua posizione nella cuvetta contenente la proteina etichettata come donatore-accettore.
Ottenere una scansione delle emissioni del campione proteico donatore-accettore utilizzando le stesse impostazioni. Per tutti gli spettri, correggere la fluorescenza di fondo sottraendo i conteggi di sfondo misurati alla fine della scansione. Utilizzare un programma di visualizzazione grafica 3D come PyMOL per mappare le distanze sulla struttura, inserendo direttamente i comandi dallo script nella finestra di comando con le informazioni sulla distanza appropriate.
Generare una shell per ogni distanza misurata e l'errore associato. Mappare la posizione attraverso l'intersezione delle diverse conchiglie. Il sito di legame peptidico del segnale è stato mappato utilizzando tre diverse posizioni su SecA e SecYEG e quattro diverse posizioni sul peptide del segnale.
Esperimenti FRET tra diverse regioni della pre-proteina e tre posizioni distinte sulle proteine SecA e SecYEG mappano il sito e l'orientamento del legame pre-proteico. Il sito di legame punitivo del peptide di segnale era precedentemente identificato come il dito a due eliche e la coda C-terminale SecA suggeriva un orientamento parallelo al dito a due eliche. Sono stati ottenuti spettri FRET allo stato stazionario tra SecA37 e PhoA2 e PhoA22.
La riduzione dell'intensità del donatore ha indicato che una maggiore energia trasferita da PhoA22. Relativo al sito PhoA2, che si trova più lontano da SecA37. Gli spettri di decadimento della fluorescenza risolti nel tempo hanno dimostrato che il complesso donatore-accettore ha un decadimento omogeneo più breve coerente con il trasferimento di energia associato a una distanza.
I gusci di distanza FRET costruiti tra il residuo SecA PhoA2 e i siti triangolati, hanno dimostrato che ogni guscio si interseca con il dito a due eliche, il sito di legame assunto, che è mostrato in verde. L'area intersecata è più piccola di ogni guscio FRET e include un grande contributo dall'impalcatura elicoidale. I gusci di distanza FRET determinati tra il residuo di PhoA2 e i siti etichettati, descrivono un'area più piccola situata più vicino alla punta del dito a due eliche e alla bocca del canale SecYEG.
Questa area intersecata si trova all'estremità opposta del dito a due eliche di PhoA2. Le cose importanti da considerare includono una corretta selezione dei siti di etichettatura per triangolare l'area di interesse, per misurare i rendimenti quantistici per ciascun sito e rimuovere tutto il colorante libero. Questo metodo si allinea con le informazioni strutturali ottenute con metodi come la NMR o la cristallografia a raggi X.
Quando i risultati FRET vengono inseriti in un contesto strutturale, possono migliorare le informazioni esistenti.
