Questo protocollo mostra la metodologia appropriata per l'affettamento e la colorazione del cuore e del tessuto cerebrale. Fornisce inoltre linee guida per stabilire l'illuminazione e le configurazioni della fotocamera e le tecniche fotografiche per l'acquisizione delle immagini. Questi metodi sono particolarmente utili per eseguire misurazioni nell'analisi planimetrica delle immagini nei tessuti dei roditori e possono essere utili per la macrofotografia scientifica generale.
Per iniziare, staccare la cannula cardiaca dalla siringa riempita con soluzione di Krebs-Henseleit e collegata a una siringa riempita con una soluzione calda di Krebs-Henseleit contenente lo 0,1% di blu di metilene. Perfondere il cuore di ratto con quattro millilitri della soluzione di blu di metilene ad una velocità di quattro millilitri al minuto. Dopo aver scollegato la cannula dalla siringa e rimosso il cuore dalla cannula, rimuovere il blu di metilene in eccesso arrotolando delicatamente il cuore su carta velina.
Dopo aver rimosso l'eccesso di blu di metilene, allentare la legatura intorno all'arteria coronaria aprendo la pinza emostatica e rimuovendo il tubo di plastica attorno alla sutura chirurgica. Quindi, posizionare il cuore di ratto macchiato in una matrice di acciaio inossidabile per affettarlo. Tagliare i ventricoli in fette spesse due millimetri, mirando a sei o sette fette da un cuore di ratto adulto.
Dopo il taglio, trasferire le fette in un tubo di plastica da 15 millilitri. Quindi, aggiungere cinque millilitri di cloruro di tetrazolio trifenile all'1% disciolto in PBS al tubo con le fette di cuore e incubare per 10 minuti a bagnomaria a 37 gradi Celsius con una miscelazione delicata dopo cinque minuti. Dopo l'incubazione, lavare le fette di cuore almeno due o tre volte con PBS e prepararsi per l'acquisizione dell'immagine.
Dopo aver rimosso il cervello, compreso il tronco cerebrale, dal cranio, posizionare il cervello con il suo lato ventrale verso l'alto nella matrice cerebrale. A seconda del peso degli animali, scegli la dimensione corretta della matrice in acciaio inossidabile del cervello. Usando le lame, limitare le parti frontali e caudali del cervello.
Quindi, mettere le lame parzialmente nei canali tra la prima e l'ultima lama. Quando tutte le lame sono inserite e disposte in parallelo, premere tutte le lame verso il basso con il palmo della mano allo stesso tempo per tagliare il cervello in fette coronali di due millimetri. Quindi, afferrare saldamente le lame lungo i lati con due dita e rimuoverle insieme al cervello affettato dalla matrice.
Disporre le fette di cervello una per una in un vassoio, assicurandosi che la superficie interna di ogni fetta sia sempre rivolta verso l'alto. Quindi, versare una soluzione calda di cloruro di tetrazolio all'1% di trifenile e PBS sulle fette di cervello e incubare per otto minuti a 37 gradi Celsius al buio. Dopo l'incubazione, trasferire le fette di cervello in un vassoio di plastica blu per catturare le immagini.
Disporre le fette di cervello in ordine sequenziale dalla parte frontale a quella caudale e utilizzare un bisturi per separare gli emisferi nel piano sagittale. Fotografare le fette di tessuto subito dopo la colorazione. Configurare la fotocamera scelta con una batteria carica, una scheda di memoria e un obiettivo collegato su un supporto.
A seconda delle sorgenti luminose disponibili, selezionare le impostazioni di bilanciamento del bianco appropriate o eseguire la calibrazione della temperatura del colore in base alle istruzioni contenute nel manuale della fotocamera. Immergere completamente le fette di cuore in un contenitore con PBS. Disporre le fette di cervello in un vassoio asciutto senza PBS o altri liquidi.
Posizionare il contenitore con le fette sotto la fotocamera con l'obiettivo macro. Assicuratevi che tutte le sezioni si adattino completamente al campo visivo e si trovino sullo stesso piano. Passare la fotocamera alla modalità completamente manuale, impostare ISO 100 e l'apertura su F10.
Regolare la velocità dell'otturatore per un'esposizione ottimale dell'immagine e assicurarsi che il piano focale della fotocamera sia parallelo alla superficie in cui si trova il campione. Dopo aver acquisito il numero del campione, ruotare il filtro polarizzatore circolare fino a quando i riflessi scompaiono e visualizzare la fetta di tessuto utilizzando un trigger remoto per evitare che una fotocamera si scuota quando l'otturatore viene rilasciato, quindi ruotare le sezioni e acquisire immagini dall'altro lato. Questa fotografia di una fetta di cuore macchiata di blu di metilene e trifenil tetrazolio cloruro dopo infarto miocardico contiene abbastanza dettagli e informazioni sul colore per ulteriori analisi planimetriche delle dimensioni dell'infarto.
Il congelamento del tessuto cardiaco per 24 ore influisce sull'integrità e riduce la funzione mitocondriale. Pertanto, la colorazione del cloruro di trifenil tetrazolio del cuore non è rossa ma rosa pallido e il confine tra i tessuti necrotici e vitali è sfocato. Dei due metodi confrontati per ridurre i riflessi nei campioni, l'immersione è il metodo più efficiente e produce immagini dettagliate con un buon contrasto.
Anche il filtro polarizzatore è efficace, tuttavia riduce leggermente la risoluzione e il microcontrasto dell'immagine. L'immagine di una fetta di cuore senza immersione o filtro contiene molti riflessi e non è adatta per ulteriori analisi. Nell'analisi planimetrica, il lato non interessato del cervello deve essere confrontato con il lato interessato dall'ictus.
Le impostazioni manuali della fotocamera garantiscono un'esposizione e un bilanciamento del bianco ottimali di tutte le immagini, consentendo un'analisi uniforme. Esempi di immagini sovraesposte e sottoesposte di fette di cuore sono mostrati qui. Inoltre, impostazioni di bilanciamento del bianco errate comportano uno spostamento su blu o giallo e magenta o verde nell'immagine.
La macrofotografia scientifica richiede un'illuminazione controllata e una configurazione di imaging appropriata. La metodologia standardizzata garantisce immagini digitali dettagliate e di alta qualità. Questo metodo è applicabile a tutte le fotografie sperimentali di piccoli organi animali.
