Questo protocollo utilizza il metodo di campionamento seriale cisterna magna CSF per esplorare gli effetti di rTMS sui livelli di alfa-beta e tau nella scimmia rhesus. Questa tecnica utilizza un nuovo metodo di campionamento del liquido cerebrospinale che consente il campionamento ripetuto del liquido cerebrospinale in condizioni di completamente sveglio con bassi rischi di eventi avversi. A dimostrare la procedura saranno Ying-Qian Zhang, assistente di ricerca del Dipartimento di Fisiologia della Southwest Medical University, e Hui-Xin Tan, uno studente laureato presso la Sichuan University.
Dopo aver somministrato l'analgesia e aver confermato il successo dell'anestesia, posizionare la scimmia rhesus maschio di cinque anni sul tavolo operatorio nella posizione del decubito laterale e disinfettare l'area intorno alla parte bassa della schiena. Piega la schiena e porta le ginocchia verso il petto. Inserire un ago spinale tra le vertebre lombari da L4 a L5 e spingerlo fino a quando non c'è un pop che indica l'ingresso nella cisterna lombare dove è alloggiato il legamento flavum.
Continuare a spingere ulteriormente l'ago fino a quando non c'è un secondo pop che indica l'ingresso nella dura madre, quindi ritirare lo stylet dall'ago spinale e raccogliere gocce di liquido cerebrospinale. Quindi, eseguire l'inserimento del catetere sotto guida fluoroscopica inserendo il catetere epidurale attraverso l'ago di puntura nello spazio subaracnoideo fino a quando non è galleggiante nella cisterna magna. Quindi, per l'impianto della porta, fare un'incisione di cinque centimetri dal sito di puntura verso la testa e isolare la pelle dal tessuto sottocutaneo per posizionare la porta di campionamento.
Collegare la porta all'estremità del catetere epidurale, impiantare la porta sotto la pelle e suturare l'incisione. Per la raccolta del CSF, utilizzare le barre della gabbia per trattenere la scimmia e mantenere la schiena piegata. Quindi pulire con un tampone imbevuto di alcool e inserire la siringa al centro della porta di campionamento per estrarre il liquido cerebrospinale dalla cisterna magna attraverso il catetere.
Scartare i primi 200 microlitri di CSF, quindi raccogliere un millilitro di CSF per l'analisi. Fissare la scimmia sulla sedia della scimmia prima dell'esperimento per evitare l'interruzione durante l'intervento rTMS, quindi raccogliere il liquido cerebrospinale per l'analisi dei biomarcatori quando la scimmia è sveglia per evitare l'influenza di farmaci anestetici. Il terzo giorno dopo il cateterismo subaracnoideo e due settimane prima dell'inizio dell'esperimento, sottoporre la scimmia all'allenamento adattivo con la sedia delle scimmie due volte al giorno per 30 minuti ogni volta.
Condurre l'allenamento adattivo rTMS o la stimolazione fittizia una settimana dopo l'allenamento adattivo con la sedia delle scimmie e una settimana prima dell'inizio dell'esperimento formale per evitare di ostacolare il progresso dell'esperimento con vibrazioni e suoni durante il processo di stimolazione. Per la stimolazione fittizia, utilizzare una bobina fittizia che produce vibrazioni e suoni ma non genera un campo magnetico. Dopo la stimolazione, offri cibo alla scimmia per aiutarla ad adattarsi al processo.
Localizzare la corteccia prefrontale dorsolaterale bilaterale secondo il sistema internazionale da 10 a 20 e condurre tre diverse sessioni di rTMS utilizzando tre diverse frequenze senza un periodo di washout superiore a 24 ore. Esegui la prima, la seconda e la terza sessione due volte al giorno per tre giorni consecutivi. Per analizzare i quattro biomarcatori del liquido cerebrospinale, utilizzare un metodo di cateterizzazione minimamente invasivo per raccogliere il liquido cerebrospinale.
Raccogliere CSF in cinque punti temporali con quattro campioni in ogni punto temporale a intervalli di tre minuti. Dopo aver raccolto un totale di 60 campioni per tre frequenze, numerarli e conservarli in un frigorifero a meno 80 gradi Celsius per un massimo di un mese. Dopo l'esperimento, sottoporre tutti i campioni al rilevamento di chip liquidi secondo le istruzioni del produttore.
Dopo una stimolazione hertz rTMS, i livelli di Abeta42 sono aumentati gradualmente nell'arco di 24 ore. Allo stesso modo con rTMS a 20 hertz, i livelli di Abeta42 sono aumentati con il tempo e hanno raggiunto un picco a sei ore dopo la stimolazione. Al contrario, dopo la stimolazione a 40 hertz, i livelli di Abeta42 sono aumentati significativamente immediatamente nel punto temporale post-rTMS, quindi sono diminuiti lentamente.
Il rapporto tra Abeta42 e Abeta40 ha mostrato una tendenza al rialzo dopo la stimolazione con uno e 20 hertz rTMS ed è aumentato significativamente due ore dopo la stimolazione. Tuttavia, non vi è stata alcuna differenza significativa nel rapporto a 40 hertz. I livelli di tTau nel liquido cerebrospinale sono aumentati immediatamente dopo la stimolazione rTMS a 20 e 40 hertz e sono diminuiti gradualmente.
Tuttavia, non c'è stata alcuna differenza significativa dopo una stimolazione hertz. Il livello di pTau è aumentato immediatamente dopo la stimolazione a 40 hertz ed è sceso al di sotto del livello basale dopo 24 ore. Al contrario, per la stimolazione di uno e 20 hertz, il livello di pTau ha mostrato una tendenza al ribasso.
I ricercatori che richiedono più campioni di CSF di scimmia possono prendere in considerazione questo metodo di campionamento CSF cisterna magna seriale.
