Questo metodo può essere utilizzato per aiutare i ricercatori ad analizzare e contare le co-colture di cellule utilizzando un'analisi semplice ed efficace basata sull'area. Questa tecnica è relativamente facile da implementare utilizzando software ampiamente disponibile e offre un mezzo affidabile e accurato per identificare vari tipi di cellule all'interno di un ambiente di co-coltura. Questo metodo può fornire informazioni su come specifiche co-colture di cellule sinergizzano per aiutare nella rigenerazione dei tessuti.
Questo metodo può anche essere impiegato per convalidare gli studi sui biomarcatori di monocoltura. Per iniziare, coltiva 264,7 macrofagi grezzi a 37 gradi Celsius e anidride carbonica al 5% per l'imaging in monocoltura in un millilitro di DMEM integrato con FBS, penicillina-streptomicina, bicarbonato di sodio e beta-mercaptoetanolo in un pallone di coltura cellulare da cinque millilitri ad una densità di 25.000 cellule per centimetro quadrato. Cellule NIH/3T3 di coltura in DMEM integrate con 10% FBS e 1% penicillina-streptomicina.
Per l'imaging di co-colture, coltura grezza di 264,7 macrofagi e fibroblasti NIH / 3T3 utilizzando un mezzo di co-coltura contenente una parte di terreno grezzo 264,7 e una parte di mezzo NIH / 3T3 insieme a vari rapporti e densità totale di 25.000 cellule per centimetro quadrato. Dopo la semina, incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per raggiungere una densità cellulare vitale dell'80% di confluenza cellulare. Per acquisire immagini cellulari utilizzando un microscopio invertito dotato dell'obiettivo 40X, determinare la capacità dell'algoritmo di valutare con precisione le immagini con una gamma di qualità dell'immagine.
Acquisisci immagini in scala di grigi con fuochi variabili che producono immagini non bulbus e bulbus ed esportale nel file czi grezzo. Per ottenere immagini di celle utilizzando il metodo basato su area, copiare e incollare il file di immagine per l'analisi nel cestino e immettere il nome del file eseguendo il comando. Premere Esegui per avviare il programma.
Analizza le immagini aprendo per ricostruzione, seguita dalla chiusura per ricostruzione utilizzando le funzioni sorgente per ingrandire il primo piano dallo sfondo eseguendo il rispettivo comando. Per binariizzare le immagini ricostruite utilizzando un sistema di identificazione basato su percentile, distinguere le celle dallo sfondo utilizzando una differenza percentile dal pixel massimo rilevante con il valore di pixel più grande che comprende almeno lo 0,5% di una determinata immagine. Analizza e valuta i valori dei pixel per i macrofagi 264.7 grezzi, assicurandoti che i valori siano entro il 4,5% del pixel massimo pertinente.
Quindi contrassegna il pixel come cellulare. Per le immagini contenenti profili di cellule bulbus, implementare una procedura iterativa per correggere la binarizzazione errata al centro delle cellule. Determinare un'ipotesi iniziale per la copertura totale della cella.
Esegui l'algoritmo e analizza le immagini utilizzando le stime iniziali di alfa e kappa per riempire una parte delle isole. Quindi utilizzare i conteggi e la copertura delle cellule post-analisi per ricalcolare kappa. Per determinare l'area media della cella dopo la binarizzazione dell'immagine, ottenere un vettore di tutte le posizioni centrali e dei raggi dei cerchi trovati all'interno dell'immagine eseguendo il comando.
Utilizzare i raggi in uscita per calcolare l'area media delle celle facendo la media e analizzare almeno 10 celle per garantire un'identificazione accurata dell'area. Eseguire l'analisi dell'immagine utilizzando i comandi descritti in precedenza. Quindi condurre un'analisi di co-colture contenenti cellule grezze 264.7 e NIH / 3T3 determinando sperimentalmente un parametro phi utilizzando immagini di cellule grezze 264.7 e NIH / 3T3.
Indovina un valore phi iniziale e itera fino a quando i conteggi delle cellule e la copertura non corrispondono strettamente ai conteggi manuali specifici per la co-coltura grezza 264.7 e NIH / 3T3. Determinare la conta delle cellule grezze di 264,7 nella copertura cellulare totale come descritto in precedenza per le immagini di monocoltura. Analizza nuovamente l'immagine trasformata dello spartiacque senza il parametro phi, rilevando sia i macrofagi che i fibroblasti.
Acquisire i dati dei fibroblasti NIH/3T3 sottraendo selettivamente i pixel grezzi di 264,7 cellule ottenuti utilizzando i metodi standard di soglia e di quantificazione basati sull'area descritti in precedenza. È stata eseguita l'analisi di 264,7 macrofagi grezzi non bulbus e sono stati registrati gli output dell'algoritmo. I calcoli dell'area media dell'immagine utilizzando l'algoritmo hanno contato 226 celle, mentre un conteggio manuale ha identificato 241 cellule con un valore di errore approssimativo del 6% È stata effettuata anche l'analisi di bulbus raw 264,7 macrofagi.
I calcoli dell'area media dell'immagine utilizzando l'algoritmo hanno contato 221 cellule, verificate da un conteggio manuale di 252 cellule con un valore di errore approssimativo del 12% È stata condotta un'analisi delle co-colture contenenti sia 264,7 macrofagi grezzi che fibroblasti NIH / 3T3. Gli output dell'algoritmo per il conteggio dei macrofagi grezzi 264,7 sono stati 137, mentre un conteggio manuale ha identificato 155 cellule con un valore di errore approssimativo dell'11% Per determinare la robustezza dell'algoritmo di conteggio delle cellule, cinque immagini grezze di macrofagi 264,7 sono state contate mediante identificazione automatica delle cellule e conteggi manuali degli utenti. Il coefficiente di Dadi è stato ottenuto con un parametro medio di 0,85 su cinque immagini.
Il passaggio critico all'interno di questo protocollo è l'uso di parametri basati su percentili che consentono un robusto rilevamento cellulare sia in immagini di monocoltura che di co-coltura. Questo protocollo può essere utilizzato per identificare le cellule di interesse per ulteriori analisi utilizzando tecniche di biologia molecolare per valutare i biomarcatori che definiscono specifiche popolazioni cellulari e lo sviluppo di biomarcatori nei sistemi di co-coltura.
