Gli autori desiderano ringraziare NSERC (scienze naturali e ingegneria del Consiglio del Canada) per il finanziamento, Catherine Pagiatikis per il suo aiuto nelle sequenze iniziali, Sura Abu-Mallouh e Federico Fahim per testare il protocollo, Richard Prevost di LaVision, Inc. per il supporto tecnico, e Guy Cloutier dell&#39;Università di Montréal per il prestito della macchina fotografica ad alta velocità Dalsa.

1. Microchip Fabrication Il primo passo è quello di creare o acquistare il microcanali. Ci sono molte opzioni per il materiale di microchip. Uno dei materiali più comuni scelti è poli (dimetilsiloxano) (PDMS). Ci sono molte pubblicazioni su indicazioni per PDMS fabbricazione mediante litografia soft 16,17,18. Una volta che il canale PDMS è fabbricato, ci sono diversi trattamenti superficiali disponibili a invertire la sua idrofobicità naturale. Trattamento al plasma ossigenato è una scelta comune. Zhou, Ellis, e Voelcker (2009) danno una revisione dei trattamenti di superficie e come influenzano PDMS. Questi risultati sono per acqua comunque, e sangue ha proprietà diverse. Uno studio su ciò che significa che il trattamento di superficie per il sangue è stato fatto dal (2012a) Pitts et al.. Per i risultati presentati qui, superfici microchip e le lastre di vetro sono statilegato a stati entrambi esposti al plasma ossigenato per 45 secondi e poi pressati insieme saldamente risultante in un legame permanente. 2. Preparazione del sangue <ol><li> Raccogliere campioni di sangue da una struttura accreditata. Per esempio sangue suino può essere utilizzato con acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) come anticoagulante. Aggiungere 1 g di EDTA con 4 ml di acqua, e quindi aggiungere la soluzione a 1 L di sangue intero, mescolando delicatamente 10x. </li></ol> Quando raccogliendo campioni di sangue, lasciare raffreddare lentamente a temperatura ambiente. I campioni di sangue devono essere freschi, e utilizzato idealmente il giorno in cui sono raccolti per conservare le proprietà reologiche del sangue. I campioni possono essere conservati in frigorifero, una volta a temperatura ambiente, ma il sangue intero senza anticoagulante sarà inutilizzabile dopo la refrigerazione. Seconda della anticoagulante, globuli rossi può essere refrigerati per fino a 42 giorni, e il sangue intero può essere conservato in frigorifero per 35 giorni, ma la contaminazione sarebbe possibile in un non-mimpianto edico 21. Inoltre, fare attenzione al metodo di raccolta con i campioni delle specie bovina o suina, e di evitare la contaminazione da parte del midollo osseo. <ol start="2"><li> Centrifugare i campioni di sangue 3x a 3.000 rpm per 10 minuti ogni volta. Dopo la prima centrifugazione, rimuovere il plasma e buffy-coat, scartare. E &#39;generalmente più facile da rimuovere il plasma prima, e poi scartare o conservare per uso futuro, quindi per rimuovere il buffy coat da solo. </li></ol> Introdurre la pipetta lentamente, così da non mescolare il buffy coat nuovo nel sangue. Dopo aver rimosso il buffy-coat, aggiungere circa 20 ml di tampone fosfato (PBS) e mescolare delicatamente, recentrifuge. Ripetere ultimo passo. Dopo la terza centrifugazione, rimuovere il PBS e il restante buffy-coat, scartare. È anche possibile utilizzare il plasma nativo invece di PBS, se si desidera mantenere le proprietà aggreganti del sangue. Assicurarsi di non mescolare tutto buffy coat o biancocellule del sangue nel plasma. <ol start="3"><li> Prendere globuli rossi puliti (RBC) e sospendere in PBS o plasma a concentrazioni desiderate (ematocrito). Controllare ematocrito con una microcentrifuga (CritSpin FisherSci, USA). </li></ol> Il sangue da 10 a 20% di ematocrito dovrebbe essere più facile da visualizzare del 40 o 50% (fisiologica ematocrito). Nel microcircolo, il sangue è generalmente la metà ematocrito della circolazione macro, quindi H = 20 è adeguata 15. <ol start="4"><li> Aggiungere particelle traccianti fluorescenti alla concentrazione desiderata per i campioni di sangue. Una regola generale è di avere 10 particelle in una finestra di correlazione, che possono essere calcolati in anticipo. </li></ol> Per esempio, 30 ml di particelle vengono aggiunti a 1 ml di soluzione di sangue per il set-up rappresentata nel video. In alternativa, i globuli rossi stessi potrebbero essere etichettati con colori fluorescenti. <ol start="5"><li> Inoltre, fare una soluzione di calibrazione con acqua e influenzaorescing particelle. Sarà necessario calibrare il sistema con una soluzione Newtoniano. </li></ol> Per esempio, quando si utilizza un obiettivo 10X con un canale sulla scala di 100 um, una concentrazione adatta è 300 ml di particelle mescolati con 15 ml di acqua distillata. Un&#39;altra opzione è quella di utilizzare glicerolo diluito con acqua distillata ad una viscosità di 3cp, che è più vicino alla macro viscosità del sangue. 3. μPIV Misure <ol><li> Sicurezza laser: Controllare la temperatura e l&#39;umidità. Indossare occhiali di protezione del laser. Chiudere il sipario laser o accendere il segno laser sulla porta del laboratorio a impedire alle persone non protette di essere esposti. </li><li> Procedura con software Davis è mostrato nel video. Per maggiori dettagli fare riferimento al manuale utente di un sistema specifico. </li><li> Prima di prendere i dati, la scala della fotocamera deve essere calibrato utilizzando un micrometro. </li><li> Per ridurre la conformità del sistema, utilizzare la minor quantità di tubi did la siringa più piccola rigida possibile, ad esempio una siringa a tenuta di gas microlitri Hamilton 15 o 50. Per ridurre la perdita di sangue o presa d&#39;aria nel sistema, sigillare il tubo alla siringa e al chip. Questo può essere fatto con colla, PDMS o vaselina (facendo attenzione a non contaminare il sangue). </li></ol> Per riempire il micro-siringa con acqua cucita con particelle traccianti utilizzare metodo riflusso perché il volume del micro-siringa è solitamente molto inferiore al volume da riempire. Il nostro metodo consiste riflusso per riempire il micro-siringa e canale insieme tramite l&#39;uscita del canale utilizzando una siringa di plastica secondario. Per questo, prima rimuovere il micro-stantuffo della siringa, quindi spingere il liquido con la siringa di plastica classica attaccato all&#39;uscita del canale, consentire al liquido fuori il micro-siringa finché tutti microbolle sono fuori del micro-siringa, tubo o Chip, finalmente messo la schiena stantuffo, e staccare la siringa in plastica. La presenza or assenza di microbolle può essere verificata con un microscopio. <ol start="5"><li> Livellare la pompa a siringa per ottenere tubo orizzontale. Programmare la pompa a siringa a portata desiderata. </li></ol> Essere consapevoli dei possibili effetti transitori, come l&#39;effetto &quot;collo di bottiglia&quot;, per il sistema rigido o la conformità del sistema che modificano la portata effettiva. Tempi caratteristici di un sistema può essere stimata in funzione dei materiali e le dimensioni del sistema. (Capitolo 2, pp 77-81, Tabeling, 2005) <ol start="6"><li> Posizionare microchip sul palco microscopio e avviare la pompa. Utilizzare l&#39;acqua con particelle di calibrare il sistema al profilo di velocità media e calibrare il dT (il tempo tra le immagini pulsate). </li></ol> Le particelle devono muoversi tra i 5 ei 10 pixel tra i fotogrammi per una buona correlazione 11. Nella taratura, fare attenzione a misurare nel mezzo del canale. Il piano di fuoco nel mezzo ha la massimavelocity 8. Se si utilizza un canale circolare, essere attenti di shadowing effetti. Una immagine di esempio è mostrato in figura 2, utilizzando una fotocamera pulsata, mentre l&#39;immagine in alto è il primo impulso e l&#39;immagine di fondo è il secondo impulso. Si può vedere nella figura che i punti luminosi (particelle fluorescenti) sono i più in-fuoco. <ol start="7"><li> OPTIONAL: Prendendo dati a diverse altezze profilo di velocità in 3D può essere ricostruito sommando i differenti vettori in una singola immagine. Il video presenta una routine che è stato sviluppato per l&#39;automazione del processo. </li><li> Nel prendere dati con il sangue, riempire la siringa con la quantità desiderata di sangue nello stesso metodo come l&#39;acqua. Programmare la pompa a siringa per la portata desiderata, e prendere dati desiderati. Un esempio di immagini grezzi ottenuti è presentato Figura 2. Fare attenzione di RBC sedimentazione pure. Riempimento della siringa ogni corsa o ognialtra corsa ridurrà l&#39;insediamento del RBC. </li><li> Dopo aver acquisito le immagini, correlazione incrociata è effettuata sulle coppie di immagini per ottenere campi vettoriali di velocità tra le immagini. E &#39;importante avere buone immagini di avere una buona correlazione. Prima di correlazione, di pre-elaborazione può essere fatto per rimuovere il rumore di fondo. </li></ol> Correlazione incrociata è fatto tra finestre nelle immagini adiacenti, che possono essere variati in dimensioni e forma di influenzare la correlazione. Dopo la correlazione incrociata, immagine post processing può essere fatto per rimuovere vettori errati o valori anomali. Una descrizione dettagliata delle diverse opzioni disponibili e le precisioni può essere trovato in Pitts et al. (2012b), dove è stato trovato il miglior trattamento per il sangue di essere il metodo di &quot;immagine overlapping&quot; con finestre estesa in lunghezza e allineato con il flusso . Queste operazioni possono essere eseguite manualmente in un programma come MATLAB, o all&#39;interno del pacchetto software con il sistema. Gli<html> software non è importante, la matematica dietro le operazioni è più importante e ciascuna operazione può influire sulla precisione del profilo di velocità finale. I vettori risultanti possono essere mediate nello spazio attraverso il canale di ottenere profili di velocità istantanea, media e poi di nuovo in tempo per ottenere un, profilo medio della velocità rappresentante. (2011) Kloosterman et al. Dare una spiegazione dell&#39;errore nelle misurazioni μPIV dove la profondità di campo è grande. Le discussioni su l&#39;errore del trattamento dei dati qui presentati possono essere trovati in (2012b) Pitts et al. Per le misurazioni pulsata e (2012) Chayer et al. Per le misurazioni ad alta velocità. Esempi di profili di velocità sono presentati nelle figure 3 e 4. Figura 3 presenta un unico profilo di velocità per la mezzeria di una microlitri / hr flusso 10 di RBC H = 10 in un canale largo 140 micron. tenda &quot;&gt; Questo singolo profilo è ottenuto dalla media dei vettori correlate attraverso il canale per ottenere un profilo di velocità, e quindi media nel tempo per ottenere una misurazione rappresentativa. In questo caso, 100 paia stati mediati nel tempo attraverso il campo di vista. Un esempio del profilo ricostruito 3D preso per un flusso di taratura acqua in un canale quadrato 100 micron con una portata programmata di 30 microlitri / hr è trovato in Figura 4. In figura 4, i profili sono misurati ad intervalli di 1 micron. <ol start="10"><li> OPTIONAL: Nelle immagini ad alta velocità raffigurati set-up può essere assunto alle stesse condizioni da telecamere di commutazione (e sistemi di acquisizione dati). Ciò può essere utile per la visualizzazione dello strato privo di cellule nel canale, e per quantificare l&#39;aggregazione. L&#39;analisi dei dati è leggermente diversa (Chayer et al., 2012). </li></ol> Esempi di immagini a luce bianca con e senza RBC aggregazione sono Presented nella Figura 5 a H = 20. Le immagini in alto mostrano H = 20 in PBS, che rimuove la capacità del RBC di aggregare, a 1 ml / hr. L&#39;immagine in basso è H = 20 nel plasma nativo a 0,5 ml / ora. Nell&#39;immagine in basso, aggregazione è visibile. <ol start="11"><li> Chiudere il sistema in modo sicuro quando sono state completate le misurazioni. Utilizzare le procedure di sicurezza del laser corrette fino fonte di energia del laser è completamente spento. </li></ol>

<ol>
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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+PDMS+surface+modifications+for+microfluidic+devices.">Recent developments in PDMS surface modifications for microfluidic devices.</a> Electrophoresis. 31, 2-16 (2009).</li><li>Pitts, K. L., Abu-Mallouh, S., Fenech, M. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-particle+image+velocimetry+measurement+of+blood+flow:+validation+and+analysis+of+data+pre-processing+and+processing+methods.">Micro-particle image velocimetry measurement of blood flow: validation and analysis of data pre-processing and processing methods.</a> Measurement Science and Technology. 23, 105302 (2012).</li><li>Kloosterman, A., Poelma, C., Westerweel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+rate+estimation+in+large+depth-of-field+micro-PIV.">Flow rate estimation in large depth-of-field micro-PIV.</a> Exp. Fluids. 50 (6), 1587-1599 (2011).</li><li>Goldsmith, H. L., Skalak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamics.">Hemodynamics.</a> Annual Review of Fluid Mechanics. 7, 213-247 (1975).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Utilizzando μPIV per misure di flusso di sangue alla scala del microcircolo può dare visione in un gran numero di importanti processi di ingegneria biomedica, meccanica e chimica. Alcuni dei fattori chiave per spiegare sono la densità del RBC stessi, l&#39;aggregazione e deformabilità del RBC, aggregazione o movimento delle micro particelle fluorescenti, e l&#39;insediamento dei RBC nei canali. Tutti questi possono essere valutate se le linee guida generali di cui sopra sono seguiti. C&#39;è una lista di controllo ...

Il corpo umano contiene numerosi vasi con diametro inferiore a 50 micron, che sono il principale sito di scambio tra sangue e tessuti. Lo studio del flusso sanguigno in questi vasi rappresenta una sfida considerevole sia per la scala delle misurazioni e le proprietà del fluido di sangue. Queste misure, tra cui il gradiente di pressione, il taglio alla parete, e profili di velocità in arteriole e venule, sono fattori chiave collegati con risposte fisiologiche. Ora ci sono opportunità senza precedenti per risolvere queste sfide di misura, grazie alle nuove tecniche sperimentali alla scala micro a studiare il microcircolo e risolvere questo problema multiscala. Velocimetria immagine Micro-particelle (μPIV) è una tecnica di visualizzazione del flusso di particelle a base che viene utilizzato per valutare i profili di velocità del flusso sanguigno in microcanali tramite correlazione incrociata. μPIV, sviluppato da Santiago et al., è stato utilizzato con EmoreologiaGli studi fin Sugii et al. nel 2001 hanno utilizzato la tecnica per misurare il flusso sanguigno in 100 micron provette rotonde 1,2. Differenti approcci di esistere μPIV. Telecamere ad alta velocità possono essere utilizzate per correlare il movimento dei globuli rossi (RBC), e le immagini pulsate possono essere usate per correlare il movimento delle particelle traccianti. Una di queste opzioni può essere accoppiato con un microscopio diritta o capovolta, a seconda dell&#39;applicazione. In entrambi i casi, il risultato è un profilo di velocità 2D. Un altro approccio è quello di utilizzare un microscopio confocale per realizzare profili 2D e 3D. Questo metodo è stato applicato al sangue 3,4,5. Micro scala PIV ha diverse complicazioni rispetto alle macro PIV. In macro PIV i dati possono essere limitati ad un singolo piano attraverso i fogli di luce, ma alla micro illuminazione volume di scala è necessario. Illuminazione volume è un problema maggiore per l&#39;imaging di micro flussi ematici, come gli RBC stessi sono grandi in confronto alla channels, quindi con gli RBC come le particelle traccianti porta ad una profondità di correlazione (DOC), che può ridurre notevolmente la precisione dei risultati di cross-correlazione 6,7,8. Seguendo Wereley et al. (1998) la DOC per un canale alto 40 micron con RBC come traccianti è 8.8 micron, mentre con una particella 1 micron tracciante il DOC è 6.7 micron. Questa differenza diventa più pronunciata quando si cambia altezza del canale e l&#39;ingrandimento. Ulteriormente, eritrociti sono opache, e aumentando la densità dei globuli rossi nel flusso provoca difficoltà di imaging. Particelle traccianti fluorescenti, prima usati da (1998) Santiago et al., Sono stati proposti come strumento per diminuire l&#39;influenza delle particelle out-of-focus, quando si utilizzano le particelle più piccole possibili. Utilizzando 1 micron di diametro microparticelle fluorescenti accoppiata con un laser è un approccio che può diminuire la profondità di fuoco in micro problema dell&#39;imaging flusso sanguigno 10. Ci sono diverse recensioni correnti dello stato di μPIV technology, ognuno dei quali mette in evidenza l&#39;importanza di μPIV a studi di flusso di sangue 11,12. Diverse considerazioni importanti devono essere prese in considerazione quando si utilizza μPIV di sangue. A livello micro, la scala del microcircolo, il sangue non può essere considerato un fluido omogeneo, in quanto è una sospensione di cellule flessibili rossi del sangue (RBC), grandi globuli bianchi, piastrine e altre proteine ​​sospese in un fluido Newtoniano (plasma) . I profili di velocità misurati qui possono essere usati per misurare alcune caratteristiche dei micro flussi sanguigni. I fattori importanti nel microhemorheology sono la velocità di flusso del sangue, la forma del profilo di velocità, e la tensione tangenziale alla parete del vaso. Questa informazione ha implicazioni cliniche, come la microcircolazione è il sito per scambio di nutrienti nel corpo, e questo scambio è shear-dipendente. Ci sono diversi studi revisione in corso sullo stato della ricerca nel microcircolo e 13,14,15. Presentato qui è un protocollo per le misure μPIV di flussi sanguigni nel polidimetilsilossano (PDMS) microcanali. Canali di PDMS sono stati fabbricati in casa seguendo le fonti in sezione 1 del protocollo. Campioni di sangue di suini sono stati ottenuti da un macello accreditato e puliti dopo la sezione 2 del protocollo. Tutti i dati sono stati ottenuti utilizzando il sistema MITAS μPIV LaVision, come descritto nella sezione 3 del protocollo. Il set-up è costituito da un laser Nd: YAG (New Wave Research, USA) e camera CCD (Immagine intenso, Lavision) comandato da una unità programmabile di attivazione, un microscopio a fluorescenza accoppiato con una fase mobile a tre assi, e un computer, oltre ad una telecamera ad alta velocità (Dalsa 1M150, Paesi Bassi) è stato aggiunto per la visualizzazione dei globuli rossi stessi. Entrambe le telecamere sono collegate ad una scatola ottica 2 porte (personalizzata da Zeiss, Germania). In tipico misure in vivo di flusso di sangue, un microscopio verticale viene utilizzato per tenere traccia dei globuli rossi delmselves, mentre nelle tipiche applicazioni in vitro un microscopio invertito è usato per tracciare le particelle traccianti. In questo doppio unico set-up, la scatola ottica permette entrambi traccianti di essere ripreso con il microscopio invertito. Il sangue è stato introdotto nei microchip mediante una pompa a siringa di alta precisione (Nexus3000, Chemyx Inc., USA). Lo schema del sistema è mostrato in Figura 1, in cui la parte superiore della figura rappresenta il 140 micron da 40 micron canali rettangolari fabbricazione di PDMS, e la porzione inferiore rappresenta l&#39;intero sistema compreso entrambe le fotocamere, il laser, la pompa a siringa e il microscopio. ΜPIV attuale set-up disponibile, di solito con il software proprietario, includere TSI, Dantec Dynamics, e LaVision. Algoritmi standard cross-correlazione può essere raggiunto attraverso numerose opzioni di software, tra cui il MATLAB. Il software non è la chiave, capire quali sono le finestre di dialogo corrispondono a matematicamente servirà l&#39;usor molto migliore. In questo protocollo Davis, software proprietario di LaVision o MATLAB sono utilizzati. Il protocollo non è un software specifico, ma le opzioni di menu potrebbero essere in luoghi diversi in diversi pacchetti software.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly(dimethylsiloxane) (PDMS), i.e. Sylgard-184</td>
			<td>Dow-Corning</td>
			<td>3097358-1004</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E9884-100G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poshpate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescing micro particles</td>
			<td>Microgenics/FisherSci</td>
			<td>R900</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol (OPTIONAL)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G6279-500 ml</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge, i.e. CritSpin</td>
			<td>FisherSci</td>
			<td>22-269-291</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe, i.e. 50 &mu;l Gastight</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80965</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera, i.e. Imager Intense, high speed</td>
			<td>LaVision, Dalsa</td>
			<td>Imager Intense</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope, i.e. MITAS</td>
			<td>LaVision</td>
			<td>MITAS</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nd:YAG laser</td>
			<td>New Wave Research</td>
			<td>Solo-II</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe pump, i.e. Nexus3000</td>
			<td>Chemyx, Inc.</td>
			<td>Nexus-3000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flexible tubing, i.e. Tygon</td>
			<td>FisherSci</td>
			<td>14-169-1A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>data processing software, i.e. DaVis</td>
			<td>LaVision</td>
			<td>DaVis</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>004260F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

micro-particle image velocimetry for velocity profile measurements of micro blood flows

Velocimetria immagine Micro-particelle (μPIV) è usato per visualizzare le immagini appaiate di micro particelle seminate nei flussi sanguigni. Le immagini sono cross-correlata per dare un profilo di velocità accurato. Un protocollo è presentato per le misure μPIV di flussi sanguigni nei microcanali. Alla scala del microcircolo, il sangue non può essere considerato un fluido omogeneo, in quanto è una sospensione di particelle in sospensione flessibili nel plasma, un fluido Newtoniano. Gradiente di velocità, la velocità massima, forma del profilo di velocità e portata possono essere derivate da queste misurazioni. Diversi parametri chiave come la profondità focale, la concentrazione di particelle, e la conformità del sistema, vengono presentati in modo da garantire dati accurati e utili con esempi e risultati rappresentativi per le varie ematocrito e le condizioni di flusso.

In tutte le figure, il flusso è da sinistra a destra nelle immagini crude, e verso l&#39;alto in profili di velocità calcolati. Un esempio dei dati grezzi ottenuti con sangue a ematocrito H = 10 fluisce a 10 microlitri / hr è mostrato in Figura 2. I dati grezzi possono essere cross-correlati, senza alcuna elaborazione dei dati per ottenere profili di velocità. L&#39;impatto dei metodi di pre-elaborazione ed elaborazione dati è discussa da Pitts, et al., (2012b). Un esempio di una risultant...

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Micro-particle Image Velocimetry for Velocity Profile Measurements of Micro Blood Flows

Velocimetria immagine Micro-particelle (μPIV) è usato per visualizzare le immagini appaiate di micro particelle seminate nei flussi di sangue, che sono cross-correlato per dare un profilo di velocità accurato. Shear rate, velocità massima, forma del profilo di velocità e portata, ognuno dei quali ha applicazioni cliniche, possono essere derivati ​​da queste misurazioni.

Micro-Particle Image Velocimetry per Velocity Misure profilo dei flussi Micro sangue

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to ...

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17.1K Views.  University of Ottawa. Velocimetria immagine Micro-particelle (μPIV) è usato per visualizzare le immagini appaiate di micro particelle seminate nei flussi di sangue, che sono cross-correlato per dare un profilo di velocità accurato. Shear rate, velocità massima, forma del profilo di velocità e portata, ognuno dei quali ha applicazioni cliniche, possono essere derivati ​​da queste misurazioni.

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Quantitatively Measuring In situ Flows using a Self-Contained Underwater Velocimetry Apparatus (SCUVA)

The ability to directly measure velocity fields in a fluid environment is necessary to provide empirical data for studies in fields as diverse as oceanography, ecology, biology, and fluid mechanics. Field measurements introduce practical challenges such as environmental conditions, animal availability, and the need for field-compatible measurement techniques. To avoid these challenges, scientists typically use controlled laboratory environments to study animal-fluid interactions. However, it is reasonable to question whether one can extrapolate natural behavior (i.e., that which occurs in the field) from laboratory measurements. Therefore, in situ quantitative flow measurements are needed to accurately describe animal swimming in their natural environment.
We designed a self-contained, portable device that operates independent of any connection to the surface, and can provide quantitative measurements of the flow field surrounding an animal. This apparatus, a self-contained underwater velocimetry apparatus (SCUVA), can be operated by a single scuba diver in depths up to 40 m. Due to the added complexity inherent of field conditions, additional considerations and preparation are required when compared to laboratory measurements. These considerations include, but are not limited to, operator motion, predicting position of swimming targets, available natural suspended particulate, and orientation of SCUVA relative to the flow of interest. The following protocol is intended to address these common field challenges and to maximize measurement success.

Quantitatively Measuring In situ Flows using a Self-Contained Underwater Velocimetry Apparatus SCUVA

This protocol provides instructions on how to use a self-contained underwater velocimetry apparatus (SCUVA), which is designed for quantification of in situ animal-generated flows. In addition, this protocol addresses challenges posed by field conditions, and includes operator motion, predicting position of animals, and orientation of SCUVA.

Misura quantitativamente In situ Flussi utilizzando un autorespiratore subacqueo Velocimetry (SCUVA)

The ability to directly measure velocity fields in a fluid environment is necessary to provide empirical data for studies in fields as diverse as ...

Ricerca

Bioingegneria

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical devices1-3. In this paper, we focus on one- (1D), two- (2D), and three-dimensional (3D) printing of conductive metallic inks in the form of flexible, stretchable, and spanning microelectrodes.
Direct-write assembly4,5 is a 1-to-3D printing technique that enables the fabrication of features ranging from simple lines to complex structures by the deposition of concentrated inks through fine nozzles (~0.1 - 250 &mu;m). This printing method consists of a computer-controlled 3-axis translation stage, an ink reservoir and nozzle, and 10x telescopic lens for visualization. Unlike inkjet printing, a droplet-based process, direct-write assembly involves the extrusion of ink filaments either in- or out-of-plane. The printed filaments typically conform to the nozzle size. Hence, microscale features (&lt; 1 &mu;m) can be patterned and assembled into larger arrays and multidimensional architectures.
In this paper, we first synthesize a highly concentrated silver nanoparticle ink for planar and 3D printing via direct-write assembly. Next, a standard protocol for printing microelectrodes in multidimensional motifs is demonstrated. Finally, applications of printed microelectrodes for electrically small antennas, solar cells, and light-emitting diodes are highlighted.

Planar and three-dimensional printing of conductive metallic inks is described. Our approach provides new avenues for fabricating printed electronic, optoelectronic, and biomedical devices in unusual layouts at the microscale.

Stampa planare e tridimensionale di inchiostri conduttivi

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in vitro analysis are well suited to study of large numbers of cells (&ge;105) in milliliter-scale volumes (&ge;0.1 ml). However, there are many instances in which it is necessary or desirable to scale down culture size to reduce consumption of the cells of interest and/or reagents required for their culture, stimulation, or processing. Unfortunately, conventional approaches do not support precise and reproducible manipulation of micro-scale cultures, and the microfluidics-based automated systems currently available are too complex and specialized for routine use by most laboratories. To address this problem, we have developed a simple and versatile technology platform for automated culture, stimulation, and recovery of small populations of cells (100 - 2,000 cells) in micro-scale volumes (1 - 20 &mu;l). The platform consists of a set of fibronectin-coated microcapillaries ("cell perfusion chambers"), within which micro-scale cultures are established, maintained, and stimulated; a digital microfluidics (DMF) device outfitted with "transfer" microcapillaries ("central hub"), which routes cells and reagents to and from the perfusion chambers; a high-precision syringe pump, which powers transport of materials between the perfusion chambers and the central hub; and an electronic interface that provides control over transport of materials, which is coordinated and automated via pre-determined scripts. As an example, we used the platform to facilitate study of transcriptional responses elicited in immune cells upon challenge with bacteria. Use of the platform enabled us to reduce consumption of cells and reagents, minimize experiment-to-experiment variability, and re-direct hands-on labor. Given the advantages that it confers, as well as its accessibility and versatility, our platform should find use in a wide variety of laboratories and applications, and prove especially useful in facilitating analysis of cells and stimuli that are available in only limited quantities.

We have developed an automated cell culture and interrogation platform for micro-scale cell stimulation experiments. The platform offers simple, versatile, and precise control in cultivating and stimulating small populations of cells, and recovering lysates for molecular analyses. The platform is well suited to studies that use precious cells and/or reagents.

Una piattaforma automatizzata versatile per micro-scala Cellulari esperimenti di stimolazione

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

Migliorata metodo per la preparazione di un cell-based, Contact modello umano della barriera sanguigna del cervello

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Hybrid &#181;CT-FMT imaging and image analysis

Fluorescence-mediated tomography (FMT) enables longitudinal and quantitative determination of the fluorescence distribution in vivo and can be used to assess the biodistribution of novel probes and to assess disease progression using established molecular probes or reporter genes. The combination with an anatomical modality, e.g., micro computed tomography (&#181;CT), is beneficial for image analysis and for fluorescence reconstruction. We describe a protocol for multimodal &#181;CT-FMT imaging including the image processing steps necessary to extract quantitative measurements. After preparing the mice and performing the imaging, the multimodal data sets are registered. Subsequently, an improved fluorescence reconstruction is performed, which takes into account the shape of the mouse. For quantitative analysis, organ segmentations are generated based on the anatomical data using our interactive segmentation tool. Finally, the biodistribution curves are generated using a batch-processing feature. We show the applicability of the method by assessing the biodistribution of a well-known probe that binds to bones and joints.

Hybrid  &amp;#181;CT-FMT imaging and image analysis

We describe a protocol for hybrid imaging, combining fluorescence-mediated tomography (FMT) with micro computed tomography (&#181;CT). After fusion and reconstruction, we perform interactive organ segmentation to extract quantitative measurements of the fluorescence distribution.

Hybrid Imaging μCT-FMT e analisi delle immagini

Fluorescence-mediated tomography (FMT) enables longitudinal and quantitative determination of the fluorescence distribution in vivo and can be used to ...

Microfluidic Buffer Exchange for Interference-free Micro/Nanoparticle Cell Engineering

Engineering cells with active-ingredient-loaded micro/nanoparticles (NPs) is becoming an increasingly popular method to enhance native therapeutic properties, enable bio imaging and control cell phenotype. A critical yet inadequately addressed issue is the significant number of particles that remain unbound after cell labeling which cannot be readily removed by conventional centrifugation. This leads to an increase in bio imaging background noise and can impart transformative effects onto neighboring non-target cells. In this protocol, we present an inertial microfluidics-based buffer exchange strategy termed as Dean Flow Fractionation (DFF) to efficiently separate labeled cells from free NPs in a high throughput manner. The developed spiral microdevice facilitates continuous collection (&#62;90% cell recovery) of purified cells (THP-1 and MSCs) suspended in new buffer solution, while achieving &#62;95% depletion of unbound fluorescent dye or dye-loaded NPs (silica or PLGA). This single-step, size-based cell purification strategy enables high cell processing throughput (106 cells/min) and is highly useful for large-volume cell purification of micro/nanoparticle engineered cells to achieve interference-free clinical application.

This protocol describes the use of an inertial microfluidics-based buffer exchange strategy to purify micro/nanoparticle engineered cells with efficient depletion of unbound particles.

Scambio Buffer Microfluidic per senza interferenze micro / nanoparticelle cellulare Ingegneria

Engineering cells with active-ingredient-loaded micro/nanoparticles (NPs) is becoming an increasingly popular method to enhance native therapeutic ...

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high resolutions in live animal models. This allows for repeated imaging of the same rodent over time. This feature not only reduces the total number of rodents required in an experimental design and thereby reduces the inter-subject variation that can arise, but also allows researchers to assess longitudinal or life-long responses to an intervention. To acquire high quality images that can be processed and analyzed to more accurately quantify outcomes of bone micro-architecture, users of in vivo &#181;CT scanners must properly anesthetize the rat, and position and restrain the hind limb. To do this, it is imperative that the rat be anesthetized to a level of complete relaxation, and that pedal reflexes are lost. These guidelines may be modified for each individual rat, as the rate of isoflurane metabolism can vary depending on strain and body size. Proper technique for in vivo &#181;CT image acquisition enables accurate and consistent measurement of bone micro-architecture within and across studies.

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

This paper instructs users of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) scanners how to anesthetize, correctly position and restrain the hind limb of a rat for minimal movement during high-resolution imaging of the tibia. The result is high quality images that can be processed to accurately quantify bone micro-architecture.

Corretto posizionamento e trattenuta di un ratto dell'arto per l'Imaging mirato ad alta risoluzione dell'osso utilizzando Micro-architettura In Vivo Micro-tomografia computerizzata

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high ...

Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such lesions, there are potential complications with their use. Thus, material scientists are developing synthetic, biocompatible biomaterials to overcome these problems. In this study, we present a multidisciplinary platform for evaluating biomaterials for bone repair. We combined expertise from bone biology and immunology to develop a platform including in vitro osteoclast (OC) and osteoblast (OB) assays and in vivo mouse models of bone repair, immunogenicity, and allergenicity. We demonstrate how to perform the experiments, summarize the results, and report on biomaterial biocompatibility. In particular, we tested OB viability, differentiation, and mineralization and OC viability and differentiation in the context of &#946;-tricalcium phosphate (&#946;-TCP) disks. We also tested a &#946;-TCP/Collagen (&#946;-TCP/C) foam which is a commercially available material used clinically for bone repair in a critical-sized calvarial bone defect mouse model to determine the effects on the early phase of bone healing. In parallel experiments, we evaluated immune and allergic responses in mice. Our approach generates a biological compatibility profile of a bone biomaterial with a range of parameters necessary for predicting the biocompatibility of biomaterials used for bone healing and repair in patients.

The number of novel biomaterials engineered for repairing large bone lesions is continuously expanding with the aim to enhance bone healing and overcome the complications associated with bone transplantation. Here, we present a multidisciplinary strategy for pre-clinical biocompatibility testing of biomaterials for bone repair.

Profilo di compatibilità biologica sui biomateriali per la rigenerazione ossea

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such ...

Meso-Scale Particle Image Velocimetry Studies of Neurovascular Flows In Vitro

Particle image velocimetry (PIV) is used in a wide variety of fields, due to the opportunity it provides for precisely visualizing and quantifying flows across a large spatiotemporal range. However, its implementation typically requires the use of expensive and specialized instrumentation, which limits its broader utility. Moreover, within the field of bioengineering, in vitro flow visualization studies are also often further limited by the high cost of commercially sourced tissue phantoms that recapitulate desired anatomical structures, particularly for those that span the mesoscale regime (i.e., submillimeter to millimeter length scales). Herein, we present a simplified experimental protocol developed to address these limitations, the key elements of which include 1) a relatively low-cost method for fabricating mesoscale tissue phantoms using 3-D printing and silicone casting, and 2) an open-source image analysis and processing framework that reduces the demand upon the instrumentation for measuring mesoscale flows (i.e., velocities up to tens of millimeters/second). Collectively, this lowers the barrier to entry for nonexperts, by leveraging resources already at the disposal of many bioengineering researchers. We demonstratethe applicability of this protocol within the context of neurovascular flow characterization; however, it is expected to be relevant to a broader range of mesoscale applications in bioengineering and beyond.

Meso-Scale Particle Image Velocimetry Studies of Neurovascular Flows In Vitro

Here we present simplified methods for fabricating transparent neurovascular phantoms and characterizing the flow therein. We highlight several important parameters and demonstrate their relationship to field accuracy.

Meso-scala Particle Image Velocimetry studi di Neurovascular scorre In Vitro

Particle image velocimetry (PIV) is used in a wide variety of fields, due to the opportunity it provides for precisely visualizing and quantifying flows ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome absorbance respectively. In addition, numerous aspects of the mitochondrial metabolic status such as membrane potential and substrate entry can also be estimated. To perform cardiac wall transmission optical spectroscopy, a commercially available side-firing optical fiber catheter is placed in the left ventricle of the isolated perfused heart as a light source. Light passing through the heart wall is collected with an external optical fiber to perform optical spectroscopy of the heart in near real- time. The transmission approach avoids numerous surface scattering interference occurring in widely used reflection approaches. Changes in transmural absorbance spectra were deconvolved using a library of chromophore reference spectra, providing quantitative measures of all the known cardiac chromophores simultaneously. This spectral deconvolution approach eliminated intrinsic errors that may result from using common dual wavelength methods applied to overlapping absorbance spectra, as well as provided a quantitative evaluation of the goodness of fit. A custom program was designed for data acquisition and analysis, which permitted the investigator to monitor the metabolic state of the preparation during the experiment. These relatively simple additions to the standard heart perfusion system provide a unique insight into the metabolic state of the heart wall in addition to conventional measures of contraction, perfusion, and substrate/oxygen extraction.

Here we introduce a method for using an intra-ventricle optical catheter in perfused hearts to perform absorbance spectroscopy across the heart wall. The data obtained provides robust information on tissue oxygen tension as well as substrate utilization and membrane potential simultaneously with cardiac performance measures in this ubiquitous preparation.

Catetere leggero intra-cardiaco per il monitoraggio del metabolismo cellulare utilizzando la spettroscopia transmurale di riambente di cuori mammiferi perfusi

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...