Ringraziamo Marek Weiler per l&#39;esecuzione degli esperimenti fantasma. Questo lavoro è stato sostenuto dal Consiglio europeo della ricerca (CER Starting Grant 309.495: NeoNaNo), lo Stato federale tedesco della Renania settentrionale-Vestfalia (NRW; High-Tech.NRW/EU-Ziel 2-Programm (FESR), ForSaTum), il tedesco Ministero dell&#39;istruzione e della ricerca (BMBF) (programmi di finanziamento fegato virtuale (0.315.743), LungSys (0315415C), LungSys2 (0316042F), Photonik Forschung Deutschland (13N13355)), la RWTH Aachen University (I 3 TM Seed Fund), e della ricerca di Philips (Aachen, Germania).

Il protocollo contiene una descrizione dettagliata dei seguenti passaggi: Dapprima, fantasmi o topi e il letto multimodale del mouse sono preparati per l&#39;imaging. Poi una scansione di tutto il corpo è acquisito nel μCT. Successivamente il letto mouse viene trasferito al FMT dove due scansioni vengono acquisiti (e capovolto). Questo può essere ripetuto per più topi a vari intervalli di tempo. Dopo il completamento dell&#39;acquisizione di dati, i dati devono essere esportati e ordinati per abilitare la segmentazione automatica (che richiedono una licenza software Definiens), così come l&#39;immagine di fusione e la ricostruzione di fluorescenza (che richiedono una licenza software Imalytics preclinici). Infine si mostra come le serie di dati multimodali sono visualizzate e come organi sono segmentati in modo interattivo per quantificare la biodistribuzione di sonde fluorescenti. 1. Phantom Preparazione NOTA: Phantoms sono utili per testare il sistema di imaging, ma anche per determinare la calibrazione factor per una nuova sonda. <ol><li> Preparare una soluzione di acqua da 200 ml, 2% agarosio, 1,8 g TiO2 in polvere, 50 pl trypan blu. Dopo la bollitura, riempire la soluzione in una forma rettangolare di circa 8 cm di lunghezza, 3 cm di larghezza e 1,5 cm di altezza. </li><li> Preparare diverse inclusioni fluorescenti nel fantoccio con puntali per pipette, che contiene un mix di fluorescenza e mezzo di contrasto μCT. Per creare le inclusioni, tagliare le punte per pipette e chiuderli con un accendino. </li><li> Dopo che la soluzione è solidificato, inserire le inclusioni nella phantom. Tagliare alcune parti del fantoccio per ottenere una forma irregolare e per adattarsi al supporto per mouse multimodale. </li><li> Per determinare il fattore di calibrazione per una nuova sonda, sono necessarie alcune scansioni fantasma. Per questo, il default FMT phantom è usato in combinazione con quantità note della sonda. Per una maggiore precisione, aggiungere 4% emulsione lipidica alla soluzione per ricevere lo stesso coefficiente di scattering dentro l&#39;inclusione nelresto del fantasma. Anche aggiungere una piccola quantità (2%) di mezzo di contrasto μCT per facilitare l&#39;analisi delle immagini. </li></ol> 2. Preparazione del mouse NOTA: l&#39;imaging μCT-FMT richiede una preparazione speciale anche anestesia e depilazione. <ol><li> Posizionare il mouse su alimenti privi di clorofilla 7 giorni prima di imaging. Questo ridurrà il segnale di fondo ed è particolarmente importante per i canali FMT inferiori ai 750 nm. </li><li> Tutti gli esperimenti sugli animali vengono eseguiti in anestesia. Per avviare la anestesia, posizionare il mouse in una camera riempita con 2% isoflurano in aria (portata 5 l / min) fino a quando il mouse si sta addormentando. Verificare il corretto anestesia da punta dolce o la pelle pizzicare e controllando rilassamento del tono muscolare (ad es., La mascella muscolare). Per sostenere l&#39;anestesia, continuare l&#39;applicazione isoflurano utilizzando un tubo che viene inserito sul naso del mouse (2% isoflurano in aria, portata 1 L / min). Per evitare drynes occhios, uso veterinario pomata sui topi anestetizzati. </li><li> Per iniettare mezzo di contrasto, correggere il mouse anestetizzato su una piastra elettrica con del nastro. Inserire un (ago siringa collegata ad un tubo) catetere per la vena della coda e iniettare il mezzo di contrasto fluorescenti (ad esempio, 2 nmol, con volume massimo di iniezione di 5 ml / kg di peso corporeo, cioè, 150 ml per 30 g mouse). </li><li> Per la scansione di un topo peloso, l&#39;area di scansione deve essere depilato in anticipo. Per questo, utilizzare una rimozione del rasoio o capelli crema. Alcuni ceppi di topi possono sviluppare eruzioni cutanee dalla crema depilatoria. Pertanto, monitorare i topi per le modifiche della pelle e contattare il personale veterinario per le cure in caso di necessità. Verificare anche la tolleranza su un piccolo numero di animali utilizzando nuovi ceppi di topi. </li><li> Tenete il mouse anestetizzato durante μCT e FMT immagini (2% isoflurano in aria, portata 1 L / min). </li></ol> 3. Letto mouse Preparazione NOTA: Per la scansione μCT-FMT, utilizzare un multimodaleLetto mouse, che si adatta sia in μCT e FMT. <ol><li> Prima di imaging, pulire il letto del mouse con i tessuti bagnati. Non usare l&#39;etanolo, perché questo potrebbe danneggiare il vetro acrilico. Assicurarsi che i marcatori sono privi di acqua, perché ciò può mettere in pericolo il rilevamento automatico di marcatore. </li><li> Aprire le viti del letto multimodale mouse e rimuovere la parte superiore. </li><li> Fissare il tubo del gas anestetico sul letto del mouse e fissare con nastro adesivo. </li><li> Posizionare il mouse anestetizzato nel letto del mouse e mettere il naso nel tubo del gas. Assicurarsi che il capo del mouse è l&#39;indicatore davanti al letto mouse (Figura 1). </li><li> Assicurarsi che il mouse è nel mezzo del letto del mouse sfruttare in modo ottimale il campo di vista del FMT. </li><li> Chiudere il letto del mouse e stringere le viti fino a quando il mouse è strettamente tenuto. Assicurarsi che il mouse può respirare costantemente di monitoraggio visivo dei movimenti respiratori toracici. </li></ol> 4. I μCTmaging NOTA: una scansione di tutto il corpo viene eseguita utilizzando il μCT. È necessario il dati anatomici generato per fusione delle immagini, per una migliore ricostruzione fluorescenza e per l&#39;analisi delle immagini. <ol><li> Posizionare il letto del mouse con il mouse nella μCT. Assicurarsi che il mouse viene posizionato in modo che esso va &quot;tail-first&quot; nella μCT. Questo è importante per la fusione automatica. </li><li> Per sostenere l&#39;anestesia quando il μCT-coperchio è chiuso, ricollegare i tubi per convogliare il gas attraverso il caso del μCT. Prima staccare il tubo lungo dal letto del mouse e collegarlo al connettore all&#39;esterno del μCT. Quindi collegare il restante estremità libera al connettore all&#39;interno del μCT. </li><li> Guidare il letto mouse nella μCT. Assicurarsi che il tubo del gas non è sciolto e non può farsi prendere dal gantry rotante. Se necessario, fissare con nastro. Inserire il tubo nel cut-out del titolare del letto mouse. </li&gt; <li> Chiudere il μCT e acquisire un topogram. Seleziona almeno due subscans a coprire una parte sostanziale del mouse e il letto del mouse, che è importante per la fusione e la ricostruzione. </li><li> Selezionare il protocollo di scansione μCT chiamato HQD-6565-360-90, che acquisisce 720 proiezioni con 1032 x 1012 pixel durante una rotazione completa che richiede un tempo di scansione di 90 s per subscan. I tubi vengono fatti funzionare con tensione di 65 kV e corrente 1,0 mA. In alternativa, per ridurre la durata dose di radiazioni e la scansione, selezionare il protocollo di scansione SQD-6565-360-29 che acquista 720 proiezioni con 516 x 506 pixel con tempi di scansione di 29 s per subscan. </li><li> Avviare la scansione μCT. La barra blu indica lo stato di avanzamento. Le subscans saranno acquisiti successivamente. Ipotermia e perdita di fluido non sono un problema a causa della breve durata di scansione di pochi minuti. Non aprire il coperchio del μCT durante la scansione perché questo interromperà automaticamente la scansione per proteggere l&#39;utente daradiazioni. </li><li> Quando la scansione è completata, aprire il coperchio, ricollegare il tubo anestetico e staccare il letto del mouse dal supporto per il trasporto alla FMT. </li></ol> 5. FMT Imaging NOTA: Subito dopo la scansione μCT, il mouse viene analizzato nella FMT in due configurazioni (su e testa in giù) che vengono utilizzati insieme per una migliore ricostruzione fluorescenza. <ol><li> Accendere l&#39;alimentazione del gas anestetico (2% isoflurano in aria, portata 1 L / min) per la FMT prima di posizionare il letto mouse nella FMT. Utilizzando il software di controllo FMT, creare un gruppo di studio con un numero adeguato di soggetti (ad esempio, i topi). Selezionare le sonde che saranno utilizzati per l&#39;imaging (uso OsteoSense per nuove sonde che non sono elencati). </li><li> Portare il letto multimodale mouse con il mouse alla FMT. Il tubo di gas anestetico lungo flessibile mantiene il flusso di gas. Prima di inserire il letto mouse nella FMT, rimuovere con attenzione il tubo in quantoNon è necessario all&#39;interno del FMT. Evitare di girare le viti del letto del mouse. </li><li> Posizionare il letto del mouse nella FMT con l&#39;indicatore rosso prima (&quot;head-first&quot;). Questo è importante per la fusione dell&#39;immagine per essere coerente con la μCT. </li><li> Chiudere il FMT. </li><li> Selezionare il gruppo di studio corretto e soggetto. Selezionare il canale desiderato del FMT (per OsteoSense 750EX, utilizzare il canale 750 nm). </li><li> Aggiungere una descrizione, ad es., &quot;Up&quot; o &quot;down&quot; e acquisire una scansione panoramica con il tasto &quot;Cattura&quot;. Questa cattura un&#39;immagine riflessione di tutto il campo visivo. Assicurarsi di non avere &quot;riflettanza Immagini Only&quot; scelti, perché altrimenti non è possibile acquisire scansioni 3D in seguito. </li><li> Regolare i parametri di imaging per la scansione 3D. Allargare il campo di vista per includere il più possibile del mouse. Di solito, la testa e la coda non del tutto adatta nel campo di vista, tuttavia. Fare clic su &quot;Advanced221; e controllare le impostazioni di imaging. Impostare densità di campionamento a 3 mm, sensibilità alla normalità e illuminazione min / max a 5000 e 50000, rispettivamente. </li><li> Fai clic su &quot;aggiungi alla coda di ricostruzione&quot; e poi cliccare su &quot;Scan&quot; per avviare la scansione FMT. Questo richiederà circa 5 a 15 minuti, a seconda delle dimensioni e dello spessore del mouse, perché i tempi di esposizione più lunghi sono necessari per gli oggetti più spessi. Il dispositivo contiene una camera di imaging riscaldata per evitare l&#39;ipotermia. </li><li> Dopo la scansione, capovolgere il letto del mouse tra cui il mouse capovolto e acquisire un&#39;altra scansione. Ciò fornisce dati aggiuntivi relativi ricostruzione fluorescenza. </li><li> Quando il μCT ei FMT scansioni sono stati completati e il topo si sveglia dall&#39;anestesia, non lasciarlo incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente, ad esempio, andare in giro o per mantenere decubito sternale. </li></ol> 6. Immagine Fusion e la ricostruzione NOTA: Dopocompletamento della scansione μCT-FMT, ad esempio, alla fine dello studio, i dati acquisiti deve essere risolto per consentire la fusione automatica delle immagini e ricostruzione fluorescenza. <ol><li> Per ordinare le scansioni per ulteriori elaborazioni, creare una cartella per lo studio. Per ogni scansione μCT-FMT, creare una sottocartella il cui nome contiene l&#39;ID del mouse e il punto di tempo, per esempio., M01_02h. </li><li> Per eseguire la scansione di ogni μCT-FMT, esportare le scansioni FMT (su e giù) come .fmt file e salvarli nella sottocartella utilizzando nomi di file che terminano con uno &quot;_up.fmt&quot; o &quot;_down.fmt&quot;. Ogni file .fmt contiene i dati grezzi acquisiti, vale a dire, le immagini di eccitazione ed emissione acquisiti dalla fotocamera, i metadati, come ad esempio i tempi di esposizione, e la ricostruzione di fluorescenza generata dal FMT. </li><li> Utilizzando il software μCT, creare una ricostruzione di dimensioni voxel isotropico 35 micron. Selezionare un kernel ricostruzione liscio (T10). Regolare il campo visivo cosìche l&#39;intero letto del mouse compresi i marcatori è coperto. Selezionare MIFX / RAW come formato di output e avviare la ricostruzione. Dopo la ricostruzione è fatto, spostare i file di ricostruzione μCT nella sottocartella della scansione μCT-FMT. </li><li> Esportare i dati μCT e FMT per tutte le scansioni. Assicurarsi che ogni sottocartella contiene due file .fmt (su e giù) e la ricostruzione μCT nel / formato RAW MIFX. Per verificare la completezza selezionare Menu-&gt; CT-FMT-&gt; Controllo della completezza utilizzando il software Imalytics preclinici. Potrebbe sembrare un elenco di errori, come ad esempio manca .fmt file o ricostruzioni μCT. Correggere gli errori e verificare la completezza finché non saranno risolti tutti gli errori. </li><li> Utilizzando Menu-&gt; Impostazioni CT-FMT-&gt;, verificare il nome del server del software Definiens e regolare, se necessario. Il valore predefinito è http: // localhost: 8184, assumendo che il software Definiens è installato sullo stesso computer. Il software Definiens è richiesto nel passo successivo per eseguire l&#39;aula segmentazione tomated del letto del mouse e marcatori. </li><li> Clicca Menu-&gt; CT-FMT-&gt; gruppo fusibile nel software Imalytics preclinici effettuare automatizzato fusione μCT-FMT per l&#39;intero studio. Questa operazione richiede alcuni minuti per μCT-FMT scansione e si traduce in una cartella con il suffisso &quot;Package&quot; parallela alla cartella studio. Questo contiene un sottoinsieme più piccolo di file (dati μCT e FMT ricostruzione vendor-condizione fusa), che sono rilevanti per ulteriori analisi. </li><li> Clicca Menu-&gt; CT-FMT-&gt; Ricostruire gruppo (FMT) nel software Imalytics preclinici per eseguire la ricostruzione di fluorescenza inclusa la creazione di assorbimento e dispersione mappe 13. Anche se il trattamento è accelerazione GPU 20, ogni ricostruzione richiede da 1 a 4 ore a seconda delle dimensioni del mouse. I risultati saranno memorizzati nella cartella del pacchetto. Nota: Per abilitare un throughput più elevato, al momento di eseguire queste ricostruzioni in un cluster GPU con 56 GPU. </li&gt; </ol> Analisi 7. Immagine NOTA: Per estrarre le misurazioni quantitative dei dati di immagine, è necessaria la segmentazione delle lesioni e degli organi. <ol><li> Una volta che tutti i dati set sono fusi insieme e ricostruiti, creano una segmentazione per ogni μCT-FMT scansione utilizzando il software Imalytics preclinici. </li><li> Caricare un file μCT come inclinazione e il file di fluorescenza come overlay. Premere il tasto &quot;3D&quot; per accendere il volume rendering e controllare il set di dati. </li><li> Per segmentare il polmone, fare clic su Menu-&gt; Classes-&gt; Aggiungi classe e creare una classe denominata &quot;tmp&quot;. Questo può anche essere fatto attraverso il menu contestuale. Creazione di una nuova classe imposta automaticamente come classe di potenza per le successive operazioni di segmentazione. <ol><li> Eseguire un&#39;operazione soglia di segmentare tutte le regioni a bassa intensità nel set di dati μCT (clicca Menu-&gt; Segmentation-&gt; Thresholding-&gt; Qui di seguito e immettere 600). Ora la classe tmp contiene l&#39;aria all&#39;esterno del mousare ma anche il tessuto polmonare. </li><li> Creare una classe &quot;Polmone&quot;. Eseguire un&#39;operazione &quot;Fill Regione&quot; (tasto destro del mouse nel polmone e selezionare Menu-&gt; Riempire Regione-&gt; Riempire regione illimitato), per separare il polmone dall&#39;aria esterna. </li><li> Eliminare la classe tmp perché non è più necessaria. </li></ol></li><li> Per segmento regioni convesse, per esempio., La vescica, utilizzare la modalità scarabocchio. Innanzitutto creare una &quot;vescica&quot; class. <ol><li> Premere F1 per eliminare tutti scarabocchi. </li><li> Utilizzando il mouse del computer, disegnare scarabocchi per delineare i confini della vescica. </li><li> Premere F3 per riempire la regione compresa tra gli scarabocchi con maschera temporanea che appare come overlay rosso. Iterativamente aggiungere altri scarabocchi (in qualsiasi orientamento affettatrice) e premere F3 fino ad ottenere una sufficiente precisione. Tipicamente, scarabocchi in 10 fette sono sufficienti. </li><li> Premere F4 per memorizzare la maschera temporanea come &quot;vescica&quot;. </li><li> Procedere in questo modo per segmentoaltre regioni convesse quali il cuore e reni. Molte regioni, ad esempio., Lo stomaco o il fegato, possono essere approssimate da alcune regioni convesse. </li></ol></li><li> Per segmento della colonna vertebrale, prima creare una classe &quot;Bone&quot;. <ol><li> Selezionare ContextMenu-&gt; Thresholding-&gt; Sopra per eseguire un&#39;operazione di soglia per classificare tutti i voxel luminose (ad es., Sopra 1.600) come &quot;Bone&quot;. </li><li> Una operazione di riempimento regione non riuscirebbe a segmento della colonna vertebrale, perché è collegato con molte altre parti dello scheletro, ad es., Le costole. Eseguire un paio di operazioni di taglio da iterativo disegnando scarabocchi e premendo F2 per separare la colonna vertebrale dal cranio, le costole, e l&#39;osso sacro. </li><li> Infine, creare una classe &quot;Spine&quot; e eseguire un&#39;operazione di riempimento regione per ottenere la colonna vertebrale (tasto destro del mouse nella colonna vertebrale e selezionare ContextMenu-&gt; Riempire Regione-&gt; Riempire regione illimitato). </li></ol></li><li> Salvare la segmentazione come file all&#39;interno the sottocartella della scansione μCT-FMT. Utilizzare un nome coerente, ad esempio, organs.seg, per consentire l&#39;elaborazione batch. </li><li> Selezionare Menu-&gt; Statistics-&gt; statistiche Class (overlay), per generare un foglio che contiene l&#39;intensità di fluorescenza media, il volume e la quantità totale (prodotto di media e volume) per ogni classe. </li><li> Per generare un unico foglio di lavoro contenente i valori di tutte le regioni di tutte le scansioni μCT-FMT, fare clic su Menu-&gt; per lotti&gt; impostazioni Impostare in batch e quindi fare clic su Menu-&gt; per lotti&gt; statistiche batch. Questo evita lo sforzo di creare e fondere molti fogli di calcolo, cioè, uno per ogni scansione μCT-FMT. </li></ol> 8. Sonda di calibrazione <ol><li> Per calcolare il fattore di calibrazione per una sonda, più scansioni fantasma μCT-FMT con sono necessarie diverse quantità note di sonda (vedi punto 1.4), ad es., Con 100 pmol, 50 pmol, 25 pmol e 0 pmol. </li><li> Scansione i fantasmi, come descritto nellaSezioni 4 e 5. Inoltre per le scansioni fantasma, su e giù per le scansioni in FMT sono obbligatori. </li><li> Esportare i dati ed eseguire la fusione e la ricostruzione, come descritto nella sezione 6. </li><li> Segmento l&#39;inserimento utilizzando i dati μCT per ogni scansione da thresholding (sopra 1.200) e riempimento regione. </li><li> Genera un foglio di calcolo con i valori di fluorescenza misurati e tracciarli in funzione delle quantità note. Calcolare la pendenza di una forma di regressione lineare. Questo è il fattore di calibrazione della sonda. </li></ol>

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+optical+properties+of+biological+tissues.">A review of the optical properties of biological tissues.</a> IEEE Journal of Quantum Electronics. 26 (12), 2166-2185 (1990).</li><li>Doleschel, D., Mundigl, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+near-infrared+imaging+of+the+erythropoietin+receptor+in+human+lung+cancer+xenografts.">Targeted near-infrared imaging of the erythropoietin receptor in human lung cancer xenografts.</a> Journal of Nuclear Medicine: Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 53 (2), 304-311 (2012).</li><li>Al Rawashdeh, W., Arns, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+tomography+of+MMP-activity+allows+a+sensitive+non-invasive+characterization+of+the+invasiveness+and+angiogenesis+of+SCC-xenografts.">Optical tomography of MMP-activity allows a sensitive non-invasive characterization of the invasiveness and angiogenesis of SCC-xenografts.</a> Neoplasia. 16 (3), 235-246 (2014).</li><li>Kunjachan, S., Pola, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+versus+Active+Tumor+Targeting+Using+RGD-+and+NGR-Modified+Polymeric+Nanomedicines.">Passive versus Active Tumor Targeting Using RGD- and NGR-Modified Polymeric Nanomedicines.</a> Nano Letters. 14 (2), 972-981 (2014).</li><li>Schober, A., Nazari-Jahantigh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-126-5p+promotes+endothelial+proliferation+and+limits+atherosclerosis+by+suppressing+Dlk1.">MicroRNA-126-5p promotes endothelial proliferation and limits atherosclerosis by suppressing Dlk1.</a> Nature Medicine. 20 (4), 368-376 (2014).</li><li>Aikawa, E., Nahrendorf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenesis+associates+with+inflammation+in+early-stage+atherosclerosis+evaluated+by+molecular+imaging+in+vivo.">Osteogenesis associates with inflammation in early-stage atherosclerosis evaluated by molecular imaging in vivo.</a> Circulation. 116 (24), 2841-2850 (2007).</li><li>Gremse, F., H&#246;fter, A., Schwen, L., Kiessling, F., Naumann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPU-Accelerated+Sparse+Matrix-Matrix+Multiplication+by+Iterative+Row+Merging.">GPU-Accelerated Sparse Matrix-Matrix Multiplication by Iterative Row Merging.</a> SIAM Journal on Scientific Computing. , C54-C71 (2015).</li><li>Vasquez, K. 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A, Optics, Image Science, and Vision. 26 (4), 919-923 (2009).</li><li>Jacques, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+properties+of+biological+tissues:+a+review.">Optical properties of biological tissues: a review.</a> Physics in Medicine and Biology. 58 (11), R37 (2013).</li><li>Loening, A. M., Gambhir, S. 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M., Rasmussen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+with+optics:+primer+and+case+for+near-infrared+fluorescence+techniques+in+personalized+medicine.">Molecular imaging with optics: primer and case for near-infrared fluorescence techniques in personalized medicine.</a> Journal of Biomedical Optics. 13 (4), 041303 (2008).</li></ol>

Felix Gremse è fondatore e proprietario di Gremse-IT, una startup che offre software e servizi per l&#39;analisi di immagini mediche in collaborazione con Philips e il Dipartimento per le Sperimentale Imaging Molecolare della RWTH Aachen University.

Descriviamo e applichiamo un protocollo per l&#39;imaging multimodale μCT-FMT. Usiamo FMT disponibili in commercio e ampiamente utilizzato e dispositivi μCT 3,11,15 - 17,21. Mentre il protocollo richiede una specifica FMT, il μCT può essere sostituito da un altro μCT con funzionalità simili e parametri di scansione paragonabili, ad esempio, il campo di vista dovrebbe essere abbastanza grande per coprire il letto del mouse compresi i marcatori. Il FMT è stato utilizzato per l&#39;analisi biodistribuzione non combinandolo con μCT o RM 21, tuttavia, i dati anatomica è utile per aumentare la riproducibilità perché la segmentazione può essere basata sui confini di organi che sono visibili nei dati μCT 10. Mentre i dispositivi μCT-FMT integrati sono stati sviluppati 2,7, questi non sono ancora disponibili in commercio. Inoltre, l&#39;uso di due dispositivi separati consente tubazioni, cioè., Il prossimo del mouse can essere ripreso nel μCT mentre il primo mouse è ancora in FMT, per aumentare la velocità. Per ridurre il carico di lavoro manuale, eseguire il rilevamento automatico marcatore e fusion. Inoltre, la forma del mouse è segmentato automaticamente e questa informazione migliora significativamente il 11,13,22 ricostruzione fluorescenza. Per la ricostruzione quantitativa della fluorescenza, sono necessari assorbimento e di scattering mappe 13,23. Deriviamo la mappa di diffusione per la segmentazione automatica dei dati μCT e l&#39;assegnazione dei coefficienti di dispersione noti di diversi tipi di tessuto (polmone, ossa, pelle, grasso, e rimanendo tessuti molli) 24. Successivamente, si ricostruisce una mappa assorbimento dai dati grezzi ottico che è particolarmente importante per gli organi ben perfusi-come il cuore e il fegato 13,20. Scansione diversi topi a vari intervalli di tempo rapidamente traduce in un gran numero di insiemi di dati da analizzare. Per Biodisstudi buzione, diversi organi devono essere segmentato per ogni scansione μCT-FMT. Purtroppo, le segmentazioni non possono essere riutilizzati, perché il mouse viene posizionato appena nel letto del mouse ripetutamente. Usiamo uno strumento per la segmentazione interattivo, sviluppato presso il nostro istituto, tuttavia, altri strumenti potrebbero anche essere appropriato 25. Generiamo segmentazioni voxel-saggio, perché questi corrispondono meglio agli organi complessi di forme semplici quali ellissi e cubi 26. Automatizzata segmentazione intero animale sarebbe utile per ridurre ulteriormente il carico di lavoro manuale di 27, ma uno strumento di segmentazione interattivo sarebbe ancora necessaria per correggere gli errori di segmentazione. Inoltre, gli strumenti di segmentazione automatici difficilmente possono prevedere casi particolari, come le patologie correttamente. Dal momento che usiamo scansioni μCT nativi, alcuni organi come la milza sono molto difficili da segmento anche manualmente. I mezzi di contrasto avrebbero aiutato, ma ci sono problemi con la tollerabilità ed è difficile per eseguire manutenzionena distribuzione di contrasto costante durante imaging longitudinale. Il nostro studio phantom mostra che il segnale di localizzazione è migliorata quando si utilizzano le informazioni di forma per la ricostruzione di fluorescenza. In vivo, un miglioramento simile è evidente per il punto di tempo in anticipo (15 min dopo l&#39;iniezione), quando una grande quantità della sonda è già nel vescica urinaria. La sonda-idrossiapatite legame si accumula a ossa e articolazioni. È notevole velocità a cui ciò si verifica, cioè, il segnale è già ben visibile la colonna vertebrale 15 min dopo l&#39;iniezione. Questo probabilmente è dovuto al basso peso molecolare della sonda, che consente stravaso veloce e diffusione delle regioni di destinazione. La sonda si lega in modo covalente alla sua idrossiapatite target e la sonda non legata viene escreto. Per i momenti successivi, tra 6 e 24 ore dopo l&#39;iniezione, l&#39;intensità del segnale nella spina dorsale rimane relativamente stabile, probabilmente, perché pochissima re lucedolori in profondità nel mouse per sbiancare la fluorescenza. Per il nostro studio, abbiamo utilizzato il canale 750 nm, che si traduce in background bassa fluorescenza evidente per le scansioni acquisite prima dell&#39;iniezione. A lunghezze d&#39;onda inferiori, più segnale di fondo si può aspettare 28. In sintesi, si descrive un protocollo di imaging multimodale in commercio dispositivi FMT e μCT. Abbiamo dimostrato che la combinazione fornisce benefici per la ricostruzione fluorescenza. Illustriamo come le curve di biodistribuzione vengono estratti dalla grande quantità di dati di immagine mediante segmentazione organo interattivo e elaborazione batch. Noi crediamo che questo flusso di lavoro standardizzato può essere utile per lo sviluppo di farmaci e di altri studi di imaging con sonde fluorescente.

Tomografia fluorescenza-mediata, tomografia molecolare chiamato anche a fluorescenza (FMT), è una tecnica promettente per valutare quantitativamente la distribuzione di fluorescenza nei tessuti diffuse, come i topi anestetizzati o addirittura tessuti del corpo umano, ad esempio, il seno o alle articolazioni delle dita. Contrariamente alle tecniche di microscopia non invasive, che permettono l&#39;imaging di bersagli superficiali con risoluzione subcellulare 1, FMT permette la ricostruzione tridimensionale di sorgenti fluorescenti in profondità di diversi centimetri, anche se a bassa risoluzione 2. Molti sonde fluorescenti mirate sono a disposizione per l&#39;angiogenesi immagine, l&#39;apoptosi, infiammazione, e altri 2-5. Alcune sonde sono attivabili, ad es., Da specifici scissione enzimatica che porta alla unquenching di fluorocromi. Inoltre, geni reporter che esprimono proteine ​​fluorescenti possono essere esposte, ad esempio, per monitorare la migrazione delle cellule tumorali 6. FMT beneficia fortemente dalla combinazione con una modalità anatomica, ad esempio, μCT 2,7 o RM 8. Mentre i dispositivi FMT autonomi sono commercialmente disponibili 9, le immagini a fluorescenza sono difficili da interpretare senza informazioni di riferimento anatomici. Recentemente siamo stati in grado di dimostrare, che i dati fuso immagine anatomica permette una più robusta analisi 10. I dati anatomici possono anche essere utilizzati per fornire conoscenza precedente, come ad esempio la forma esterna del mouse, che è importante per la modellazione ottica accurata e fluorescenza ricostruzione 11. Inoltre, di scattering e di assorbimento mappe ottici possono essere stimate utilizzando la segmentazione dei tipi di tessuti e assegnando classe coefficienti specifici 12,13. Per la luce nel vicino infrarosso, l&#39;emoglobina è l&#39;assorbitore principale nei topi, oltre melanina e pelliccia 14. Poiché il volume di sangue relativa varia regionalmente di ordini di grandezza, una mappa assorbimento è particolarmente importante per quanquantita- fluorescenza ricostruzione 13. Un vantaggio di utilizzare dispositivi di imaging non invasive è che i topi possono essere esposte in senso longitudinale, cioè, in più punti di tempo. Questo è importante per valutare il comportamento dinamico di sonde, cioè, il loro accumulo di destinazione, la biodistribuzione e l&#39;escrezione 10,15, oppure per valutare la progressione della malattia 16. Quando l&#39;imaging diversi topi a vari intervalli di tempo, una grande quantità di set di dati di immagine deriva. Per consentire la comparabilità, questi devono essere acquisiti in modo sistematico, cioè con un protocollo ben definito e documentato. Il gran numero di scansioni rappresenta una sfida per l&#39;analisi delle immagini, che è necessaria per estrarre misure quantitative dei dati di immagine. Lo scopo del nostro studio è quello di fornire una descrizione dettagliata di un protocollo di imaging μCT-FMT che abbiamo usato e ottimizzato tutto diversi studi 10,13,15,17,18. Descriviamocome vengono generati i set di dati, elaborati, visualizzati e analizzati. Questo è dimostrato utilizzando una sonda molecolare consolidata, OsteoSense, che si lega ad idrossiapatite 19, e può essere utilizzato per le malattie delle ossa e il rimodellamento immagine 2. Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono stati approvati dal comitato di revisione governativo sulla cura degli animali.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>FMT (Fluorescence molecular tomography) FMT2500 LX</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>FMT2000</td>
			<td>Device for fluorescence molecular tomography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;CT (micro computed tomography) Tomoscope Duo</td>
			<td>CT Imaging GmbH</td>
			<td>Tomoscope Duo</td>
			<td>Device for micro computed tomography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multimodal Mouse Bed</td>
			<td>CT Imaging GmbH</td>
			<td>Experimental builder</td>
			<td>Partially transparent animal holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IsoFlo (isoflurane, USP)</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>05260-05</td>
			<td>Isoflurane Inhalation anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small animal anesthesia system</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>726419</td>
			<td>Complete Isoflurane Table-Top System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorophyll-free mouse food</td>
			<td>Ssniff</td>
			<td>E15051</td>
			<td>low chlorophyll / low fluorescence food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OsteoSense 750EX</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEV10053EX</td>
			<td>Animal FMT contrast agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portex Fine Bore Polythene Tubing</td>
			<td>Smith medical</td>
			<td>800/100/120</td>
			<td>Tube for injection catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterican 30g</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>4656300</td>
			<td>Hypodermic needle for catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imeron</td>
			<td>Altana pharma</td>
			<td>INLA F.1/0203/3.5337.69</td>
			<td>CT contrast agent for the phantom inclusions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>90-12-36-6</td>
			<td>Agarose for phantom production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TiO2</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1900,1000</td>
			<td>Titanium oxyde as phantom scattering agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>93595</td>
			<td>Trypan blue to adjust phantom light propagation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy7</td>
			<td>Lumiprobe</td>
			<td>15020</td>
			<td>Fluorochrome for the phantom inclusions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipovenoes 20%</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>3094740</td>
			<td>Lipid emulsion, scattering agent for FMT contrast agents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Definiens Developer XD Server</td>
			<td>Definiens AG</td>
			<td>Server XD</td>
			<td>Software platform for automated segmentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imalytics Preclinical</td>
			<td>ExMI/Gremse-IT</td>
			<td>Version 2.0.1</td>
			<td>Software for image fusion, reconstruction and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NVIDIA Geforce Titan</td>
			<td>Asus</td>
			<td>GTXTITAN6GD5</td>
			<td>High end computer graphics card, 6GB Memory</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hybrid &#181;ct-fmt imaging and image analysis

Fluorescenza-mediata tomografia (FMT) consente la determinazione longitudinale e quantitativa della distribuzione della fluorescenza in vivo e può essere utilizzato per valutare la biodistribuzione di nuove sonde e di valutare la progressione della malattia utilizzando sonde molecolari stabiliti o geni reporter. L&#39;abbinamento con una modalità anatomica, ad esempio, micro tomografia computerizzata (μCT), è utile per l&#39;analisi delle immagini e per la ricostruzione di fluorescenza. Descriviamo un protocollo per l&#39;imaging multimodale μCT-FMT comprese le fasi di elaborazione delle immagini necessarie per estrarre misure quantitative. Dopo aver preparato i topi e l&#39;esecuzione della immagini, i set di dati multimodali sono registrate. Successivamente, viene eseguita una migliore ricostruzione fluorescenza, che tiene conto della forma del mouse. Per l&#39;analisi quantitativa, segmentazioni organi vengono generati in base ai dati anatomici utilizzando il nostro strumento di segmentazione interattivo. Infine, il cu biodistribuzionerves vengono generati utilizzando una funzione di elaborazione batch. Noi mostriamo la applicabilità del metodo valutando la biodistribuzione di una sonda noto che si lega alle ossa e articolazioni.

Abbiamo applicato il protocollo descritto per valutare la biodistribuzione di una sonda mirata, OsteoSense, che si lega alla idrossiapatite. 3 topi (C57BL / 6 ApoE - / - / - AHSG - doppia topi knockout, 10 settimane) sono stati ripresi prima e 15 minuti, 2 ore, 4 ore, 6 ore, e 24 ore dopo l&#39;iniezione endovenosa di 2 nmol OsteoSense. Il nostro software rilevata automaticamente i marcatori costruito nel letto del mouse multimodale (Figura 1, Figura 2A, B), che ha permesso la fusione dei dati μCT anatomici con la ricostruzione della fluorescenza effettuata dal FMT (Figura 2C, D). Poiché OsteoSense è una sonda con un basso peso molecolare, un escrezione renale veloce e quindi segnale alto nella vescica urinaria è previsto. Fusione della ricostruzione fluorescenza della FMT rivelato problemi come segnale smarrito fuori della vescica (Figura 2C, D). Questi problemi si verificano perché il FMT non conosce la vera forma del mouse e assume una forma di blocco. Our ricostruzione determina la forma precisa dai dati μCT e genera dispersione e assorbimento mappe 13 al fine di consentire una più accurata ricostruzione fluorescenza con migliore localizzazione del segnale, che è particolarmente evidente per la vescica (Figura 2E, F). Per assegnare la fluorescenza ricostruito a regioni appropriate, abbiamo segmentato in modo interattivo diversi organi che utilizzano il nostro software (Figura 3). Per ciascuna delle 18 scansioni, 7 regioni sono state segmentate basate sui dati μCT, vale a dire., Cuore, polmoni, fegato, reni, colonna vertebrale, intestino e vescica. Successivamente, il software è stato utilizzato per calcolare la concentrazione di fluorescenza media per ciascuna delle regioni 126. Fortunatamente, il software fornisce una modalità batch, che calcola tutti i valori e li salva in un unico foglio di lavoro. Per visualizzare la distribuzione della fluorescenza, rendering 3D sono stati generati per ogni punto di tempo,utilizzando l&#39;impostazione finestre paragonabile (Figura 4A-F). Utilizzando i valori di organi quantificati, la biodistribuzione è stato calcolato facendo la media dei valori di organi nel corso dei tre topi (Figura 4G). Le scansioni pre acquisite prima dell&#39;iniezione, hanno mostrato trascurabile segnale di fondo. 15 minuti dopo l&#39;iniezione, il segnale più forte apparso nella vescica urinaria, a causa della escrezione renale veloce. Ai successivi punti di tempo, la sonda rimanente aveva accumulato a ossa e articolazioni. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52770/52770fig1.jpg" /> Figura 1. multimodale mouse letto. (A) Il letto multimodale del mouse contiene due lastre di vetro acrilico che tengono saldamente il mouse. L&#39;inasprimento viene regolato con due viti. Il letto del mouse contiene marcatori (fori vuoto) per la fusione di immagini. Gas anestetico viene fornito con un tubo flessibile che viene fissata con tape. (B) Il letto del mouse è fissato ad un supporto metallico e tenuto nel centro della rotazione μCT cavalletto. (C) evitare un vuoto tra il letto del mouse e il supporto del metallo, perché altrimenti, i marcatori possono essere assegnati in modo non corretto che porta alla fusione non corretta. Il tubo di gas anestetico dovrebbe essere collegato al connettore del tubo. (D) Il letto mouse deve essere inserito nel FMT con la parte anteriore prima di consentire la corretta fusione automatizzato. (E) I marcatori sono visibili alla telecamera FMT, che viene utilizzato per la rilevazione marcatore automatico e fusion. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52770/52770fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52770/52770fig2.jpg" /> Figura 2. Immagine Fusion e la ricostruzione. (A, B) Indicatori e la forma esterna del mouse sono determinati dalla algoritmo di segmentazione automatica. (C, D) 15 minuti dopo l&#39;iniezione di OsteoSense, una notevole quantità di sonda già escreta nella vescica urinaria. Dopo la fusione la ricostruzione fornita dal produttore con i dati μCT, problemi diventano visibili. La maggior parte del segnale compare intorno alla vescica ma non all&#39;interno della vescica e qualche segnale appare anche in aria. Ciò accade perché il FMT assume un mouse a forma di blocco. (E, F) La nostra migliore ricostruzione di fluorescenza, utilizzando la forma del mouse derivata dai dati μCT, si traduce in una migliore localizzazione della fluorescenza all&#39;interno della vescica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52770/52770fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52770/52770fig3.jpg" /> Figura 3. Interactive Organo Segmentat. ioni (A) Per quantificare la distribuzione di fluorescenza, più organi vengono segmentati: cuore (rosso), del polmone (rosa), fegato (marrone), dello stomaco (beige), della colonna vertebrale (viola), reni (giallo), intestino (verde) , e della vescica urinaria (oro). (B) Il polmone, che è fortemente contrastata rispetto al tessuto circostante, è segmentato con soglia e riempimento regione. (C) organi rotonde, come la vescica, reni, cuore e sono segmentati utilizzando &quot;scarabocchi&quot;. (D) Organi con una forma più complessa, ad esempio, il fegato e lo stomaco sono segmentati in modo incrementale utilizzando scarabocchi. Per segmento della colonna vertebrale, una soglia elevata è applicata a tutti i segmenti ossa. Poi alcune ossa, ad es., Le costole, sono tagliati via, fino a quando la colonna vertebrale rimane. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52770/52770fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Figura 4. Biodistribuzione. Per valutare la biodistribuzione, i topi sono esplorate a diversi intervalli di tempo (AF). (A) La scansione pre, prima dell&#39;iniezione, mostra poco segnale di fondo nel canale 750 nm. (B) 15 minuti dopo l&#39;iniezione, una notevole quantità di sonda è già nella vescica urinaria. (C) per il punto temporale 2 h, il topo aveva urinato, che si traduce in qualche fluorescenza all&#39;esterno del mouse. In momenti successivi (DF), il segnale appare prevalentemente le ossa e le articolazioni, vale a dire., Alla colonna vertebrale e le ginocchia. (G) La concentrazione di fluorescenza quantificata viene mostrato per organi selezionati.

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Hybrid  &amp;#181;CT-FMT imaging and image analysis

We describe a protocol for hybrid imaging, combining fluorescence-mediated tomography (FMT) with micro computed tomography (&#181;CT). After fusion and reconstruction, we perform interactive organ segmentation to extract quantitative measurements of the fluorescence distribution.

Hybrid Imaging μCT-FMT e analisi delle immagini

Fluorescence-mediated tomography (FMT) enables longitudinal and quantitative determination of the fluorescence distribution in vivo and can be used to ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Hybrid &#181;CT-FMT imaging and image analysis

13.0K Views.  RWTH Aachen University. We describe a protocol for hybrid imaging, combining fluorescence-mediated tomography (FMT) with micro computed tomography (µCT). After fusion and reconstruction, we perform interactive organ segmentation to extract quantitative measurements of the fluorescence distribution.

Video: Hybrid  &#181;CT-FMT imaging and image analysis

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at submicrometer resolution. One of the first such instruments producing whole-brain-scale data is the Knife-Edge Scanning Microscope (KESM)7, 5, 9, developed and hosted in the authors' lab. KESM has been used to section and image whole mouse brains at submicrometer resolution, revealing the intricate details of the neuronal networks (Golgi)1, 4, 8, vascular networks (India ink)1, 4, and cell body distribution (Nissl)3. The use of KESM is not restricted to the mouse nor the brain. We have successfully imaged the octopus brain6, mouse lung, and rat brain. We are currently working on whole zebra fish embryos. Data like these can greatly contribute to connectomics research10; to microcirculation and hemodynamic research; and to stereology research by providing an exact ground-truth. 
In this article, we will describe the pipeline, including specimen preparation (fixing, staining, and embedding), KESM configuration and setup, sectioning and imaging with the KESM, image processing, data preparation, and data visualization and analysis. The emphasis will be on specimen preparation and visualization/analysis of obtained KESM data. We expect the detailed protocol presented in this article to help broaden the access to KESM and increase its utilization.

The full process from brain specimen preparation to serial sectioning imaging using the Knife-Edge Scanning Microscope, to data visualization and analysis is described. This technique is currently used to acquire mouse brain data, but it is applicable to other organs, other species.

Protocolli Preparazione del campione, Imaging, e d&#39;analisi per Knife-edge Microscopia Scansione

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

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Bioingegneria

Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths1. Squamous cell and small cell cancers typically arise in association with the conducting airways, whereas adenocarcinomas are typically more peripheral in location. Lung malignancy detection early in the disease process may be difficult due to several limitations: radiological resolution, bronchoscopic limitations in evaluating tissue underlying the airway mucosa and identifying early pathologic changes, and small sample size and/or incomplete sampling in histology biopsies. High resolution imaging modalities, such as optical frequency domain imaging (OFDI), provide non-destructive, large area 3-dimensional views of tissue microstructure to depths approaching 2 mm in real time (Figure 1)2-6. OFDI has been utilized in a variety of applications, including evaluation of coronary artery atherosclerosis6,7 and esophageal intestinal metaplasia and dysplasia6,8-10.
Bronchoscopic OCT/OFDI has been demonstrated as a safe in vivo imaging tool for evaluating the pulmonary airways11-23 (Animation). OCT has been assessed in pulmonary airways16,23 and parenchyma17,22 of animal models and in vivo human airway14,15. OCT imaging of normal airway has demonstrated visualization of airway layering and alveolar attachments, and evaluation of dysplastic lesions has been found useful in distinguishing grades of dysplasia in the bronchial mucosa11,12,20,21. OFDI imaging of bronchial mucosa has been demonstrated in a short bronchial segment (0.8 cm)18. Additionally, volumetric OFDI spanning multiple airway generations in swine and human pulmonary airways in vivo has been described19. Endobronchial OCT/OFDI is typically performed using thin, flexible catheters, which are compatible with standard bronchoscopic access ports. Additionally, OCT and OFDI needle-based probes have recently been developed, which may be used to image regions of the lung beyond the airway wall or pleural surface17.
While OCT/OFDI has been utilized and demonstrated as feasible for in vivo pulmonary imaging, no studies with precisely matched one-to-one OFDI:histology have been performed. Therefore, specific imaging criteria for various pulmonary pathologies have yet to be developed. Histopathological counterparts obtained in vivo consist of only small biopsy fragments, which are difficult to correlate with large OFDI datasets. Additionally, they do not provide the comprehensive histology needed for registration with large volume OFDI. As a result, specific imaging features of pulmonary pathology cannot be developed in the in vivo setting. Precisely matched, one-to-one OFDI and histology correlation is vital to accurately evaluate features seen in OFDI against histology as a gold standard in order to derive specific image interpretation criteria for pulmonary neoplasms and other pulmonary pathologies. Once specific imaging criteria have been developed and validated ex vivo with matched one-to-one histology, the criteria may then be applied to in vivo imaging studies. Here, we present a method for precise, one to one correlation between high resolution optical imaging and histology in ex vivo lung resection specimens. Throughout this manuscript, we describe the techniques used to match OFDI images to histology. However, this method is not specific to OFDI and can be used to obtain histology-registered images for any optical imaging technique. We performed airway centered OFDI with a specialized custom built bronchoscopic 2.4 French (0.8 mm diameter) catheter. Tissue samples were marked with tissue dye, visible in both OFDI and histology. Careful orientation procedures were used to precisely correlate imaging and histological sampling locations. The techniques outlined in this manuscript were used to conduct the first demonstration of volumetric OFDI with precise correlation to tissue-based diagnosis for evaluating pulmonary pathology24. This straightforward, effective technique may be extended to other tissue types to provide precise imaging to histology correlation needed to determine fine imaging features of both normal and diseased tissues.

Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

A method to image ex vivo pulmonary resection specimens with optical frequency domain imaging (OFDI) and obtain precise correlation to histology is described, which is essential to developing specific OFDI interpretation criteria for pulmonary pathology. This method is applicable to other tissue types and imaging techniques to obtain precise imaging to histology correlation for accurate image interpretation and assessment. Imaging criteria established with this technique would then be applicable to image assessment in future in vivo studies.

Optical Frequency Domain Imaging di<em&gt; Ex vivo</em&gt; I campioni polmonari Resezione: Ottenere One to One immagine per Istopatologia Correlazione

Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths1. Squamous cell and small cell cancers typically arise in association with the conducting ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

Ad alta risoluzione Spatiotemporal Analisi del recettore Dynamics per singola molecola di microscopia a fluorescenza

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Magnetic Levitation Coupled with Portable Imaging and Analysis for Disease Diagnostics

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for specialized equipment and trained personnel require that many diagnostic tests be performed at remote, centralized clinical laboratories. Magnetic levitation is a simple yet powerful technique and can be applied to levitate cells, which are suspended in a paramagnetic solution and placed in a magnetic field, at a position determined by equilibrium between a magnetic force and a buoyancy force. Here, we present a versatile platform technology designed for point-of-care diagnostics which uses magnetic levitation coupled to microscopic imaging and automated analysis to determine the density distribution of a patient's cells as a useful diagnostic indicator. We present two platforms operating on this principle: (i) a smartphone-compatible version of the technology, where the built-in smartphone camera is used to image cells in the magnetic field and a smartphone application processes the images and to measures the density distribution of the cells and (ii) a self-contained version where a camera board is used to capture images and an embedded processing unit with attached thin-film-transistor (TFT) screen measures and displays the results. Demonstrated applications include: (i) measuring the altered distribution of a cell population with a disease phenotype compared to a healthy phenotype, which is applied to sickle cell disease diagnosis, and (ii) separation of different cell types based on their characteristic densities, which is applied to separate white blood cells from red blood cells for white blood cell cytometry. These applications, as well as future extensions of the essential density-based measurements enabled by this portable, user-friendly platform technology, will significantly enhance disease diagnostic capabilities at the point of care.

We present a magnetic levitation technique coupled with automated imaging and analysis in both a smartphone-compatible device and a device with embedded imaging and processing. This is applied to measure the density distribution of cells with two demonstrated biomedical applications: sickle cell disease diagnosis and separating white and red blood cells.

Levitazione magnetica Accoppiato con Imaging portatile e analisi per la malattia di diagnostica

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for ...

Quantifying Intermembrane Distances with Serial Image Dilations

A recently-described extracellular nanodomain, termed the perinexus, has been implicated in ephaptic coupling, which is an alternative mechanism for electrical conduction between cardiomyocytes. The current method for quantifying this space by manual segmentation is slow and has low spatial resolution.We developed an algorithm that uses serial image dilations of a binary outline to count the number of pixels between two opposing 2 dimensional edges.This algorithm requires fewer man hours and has a higher spatial resolution than the manual method while preserving the reproducibility of the manual process.In fact, experienced and novice investigators were able to recapitulate the results of a previous study with this new algorithm.The algorithm is limited by the human input needed to manually outline the perinexus and computational power mainly encumbered by a pre-existing pathfinding algorithm.However, the algorithm&#39;s high-throughput capabilities, high spatial resolution and reproducibility make it a versatile and robust measurement tool for use across a variety of applications requiring the measurement of the distance between any 2-dimensional (2D) edges.

The purpose of this algorithm is to continuously measure the distance between two 2-dimensional edges using serial image dilations and pathfinding. This algorithm can be applied to a variety of fields such as cardiac structural biology, vascular biology, and civil engineering.

Quantificare intermembrana distanze con le dilatazioni immagine seriale

A recently-described extracellular nanodomain, termed the perinexus, has been implicated in ephaptic coupling, which is an alternative mechanism for ...

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in live-cell imaging and high-throughput microscopy techniques. This led to a constant increase in the amount and complexity of the microscopy data for a single experiment. Because manual analysis of microscopy data is very time consuming, subjective, and prohibits quantitative analyses, automation of bioimage analysis is becoming almost unavoidable. We built an informatics workflow called Substructure Analyzer to fully automate signal analysis in bioimages from fluorescent microscopy. This workflow is developed on the user-friendly open-source platform Icy and is completed by functionalities from ImageJ. It includes the pre-processing of images to improve the signal to noise ratio, the individual segmentation of cells (detection of cell boundaries) and the detection/quantification of cell bodies enriched in specific cell compartments. The main advantage of this workflow is to propose complex bio-imaging functionalities to users without image analysis expertise through a user-friendly interface. Moreover, it is highly modular and adapted to several issues from the characterization of nuclear/cytoplasmic translocation to the comparative analysis of different cell bodies in different cellular sub-structures. The functionality of this workflow is illustrated through the study of the Cajal (coiled) Bodies under oxidative stress (OS) conditions. Data from fluorescence microscopy show that their integrity in human cells is impacted a few hours after the induction of OS. This effect is characterized by a decrease of coilin nucleation into characteristic Cajal Bodies, associated with a nucleoplasmic redistribution of coilin into an increased number of smaller foci. The central role of coilin in the exchange between CB components and the surrounding nucleoplasm suggests that OS induced redistribution of coilin could affect the composition and the functionality of Cajal Bodies.

We present a freely available workflow built for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in specific cell compartments in fluorescence microscopy images. This user-friendly workflow is designed on the open-source software Icy and also uses ImageJ functionalities. The pipeline is affordable without knowledge in image analysis.

Substructure Analyzer: un flusso di lavoro facile da usare per l'esplorazione rapida e l'analisi accurata dei corpi cellulari nelle immagini di microscopia a fluorescenza

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

Imaging and Quantification of the Area of Fast-Moving Microbubbles Using a High-Speed Camera and Image Analysis

An experimental and image analysis technique is presented for imaging cavitation bubbles and calculating their area. The high-speed imaging experimental technique and image analysis protocol presented here can also be applied for imaging microscopic bubbles in other fields of research; therefore, it has a wide range of applications. We apply this to image cavitation around dental ultrasonic scalers. It is important to image cavitation to characterize it and to understand how it can be exploited for various applications. Cavitation occurring around dental ultrasonic scalers can be used as a novel method of dental plaque removal, which would be more effective and cause less damage than current periodontal therapy techniques. We present a method for imaging the cavitation bubble clouds occurring around dental ultrasonic scaler tips using a high-speed camera and a zoom lens. We also calculate the area of cavitation using machine learning image analysis. Open source software is used for image analysis. The image analysis presented is easy to replicate, does not require programming experience, and can be modified easily to suit the application of the user.

Cavitation microbubbles are imaged using a high-speed camera attached to a zoom lens. The experimental setup is explained, and image analysis is used to calculate the area of the cavitation. Image analysis is done using ImageJ.

Imaging e quantificazione dell'area delle microbolle in rapido movimento utilizzando una fotocamera ad alta velocità e l'analisi delle immagini

An experimental and image analysis technique is presented for imaging cavitation bubbles and calculating their area. The high-speed imaging experimental ...

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. Considering an implant as a foreign body, a hostile and dysregulated immune response may result in the rejection of the implant, while a regulated response and regaining of homeostasis can lead to its acceptance. Analyzing the microenvironments of implants dissected out under in vivo or ex vivo&#160;settings can help in understanding the pattern of immune response, which can ultimately help in developing new generations of biomaterials. Flow cytometry is a well-known technique for characterizing immune cells and their subsets based on their cell surface markers. This review describes a protocol based on manual dicing, enzymatic digestion, and filtration through a cell strainer for the isolation of uniform cell suspensions from dissected implant tissue. Further, a multicolor flow cytometry staining protocol has been explained, along with steps for initial cytometer settings to characterize and quantify these isolated cells by flow cytometry.

Isolation of cells from dissected implants and their characterization by flow cytometry can significantly contribute to understanding the pattern of immune response against implants. This paper describes a precise method for the isolation of cells from dissected implants and their staining for flow cytometric analysis.

Citometria a flusso ad alta dimensionalità per l'analisi della funzione immunitaria di tessuti implantari sezionati

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. ...

Area-based Image Analysis Algorithm for Quantification of Macrophage-fibroblast Cocultures

Quantification of cells is necessary for a wide range of biological and biochemical studies. Conventional image analysis of cells typically employs either fluorescence detection approaches, such as immunofluorescent staining or transfection with fluorescent proteins or edge detection techniques, which are often error-prone due to noise and other non-idealities in the image background. 
We designed a new algorithm that could accurately count and distinguish macrophages and fibroblasts, cells of different phenotypes that often colocalize during tissue regeneration. MATLAB was used to implement the algorithm, which differentiated distinct cell types based on differences in height from the background. A primary algorithm was developed using an area-based method to account for variations in cell size/structure and high-density seeding conditions. 
Non-idealities in cell structures were accounted for with a secondary, iterative algorithm utilizing internal parameters such as cell coverage computed using experimental data for a given cell type. Finally, an analysis of coculture environments was carried out using an isolation algorithm in which various cell types were selectively excluded based on the evaluation of relative height differences within the image. This approach was found to accurately count cells within a 5% error margin for monocultured cells and within a 10% error margin for cocultured cells.

We present a method, which utilizes a generalizable area-based image analysis approach to identify cell counts. Analysis of different cell populations exploited the significant cell height and structure differences between distinct cell types within an adaptive algorithm.

Algoritmo di analisi delle immagini basato sull'area per la quantificazione delle cocolture di macrofagi-fibroblasti

Quantification of cells is necessary for a wide range of biological and biochemical studies. Conventional image analysis of cells typically employs either ...

Hybrid Cell Analysis System to Assess Structural and Contractile Changes of Human iPSC-Derived Cardiomyocytes for Preclinical Cardiac Risk Evaluation

Cardiac contractility assessment is of immense importance for the development of new therapeutics and their safe transition into clinical stages. While human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) hold promise to serve as a human-relevant model in preclinical phases of drug discovery and safety pharmacology, their maturity is still controversial in the scientific community and under constant development. We present a hybrid contractility and impedance/extracellular field potential (EFP) technology, adding significant pro-maturation features to an industry-standard 96-well platform.
The impedance/EFP system monitors cellular functionality in real-time. Besides the beat rate of contractile cells, the electrical impedance spectroscopy readouts detect compound-induced morphological changes like cell density and integrity of the cellular monolayer. In the other component of the hybrid cell analysis system, the cells are cultured on bio-compliant membranes that mimic the mechanical environment of real heart tissue. This physiological environment supports the maturation of hiPSC-CMs in vitro, leading to more adult-like contractile responses including positive inotropic effects after treatment with isoproterenol, S-Bay K8644, or omecamtiv mecarbil. Parameters such as the amplitude of contraction force (mN/mm2) and beat duration also reveal downstream effects of compounds with influence on electrophysiological properties and calcium handling.
The hybrid system provides the ideal tool for holistic cell analysis, allowing preclinical cardiac risk assessment beyond the current perspectives of human-relevant cell-based assays.

The analysis of changes in contractile function and cellular integrity of human iPSC-derived cardiomyocytes is of immense importance for nonclinical drug development. A hybrid 96-well cell analysis system addresses both parameters in a real-time and physiological manner for reliable, human-relevant results, necessary for a safe transition into clinical stages.

Sistema di analisi delle cellule ibride per valutare i cambiamenti strutturali e contrattili dei cardiomiociti umani derivati da iPSC per la valutazione preclinica del rischio cardiaco

Cardiac contractility assessment is of immense importance for the development of new therapeutics and their safe transition into clinical stages. While ...