Questo metodo sarà fondamentale per comprendere la gastrulazione lungo una formazione nei mammiferi. Consentendo la sperimentazione in embrioni viventi durante le fasi embrionali che sono state a lungo nascoste all'interno dell'utero materno. Permette, continua la crescita efficiente e appropriata di embrioni di topo al di fuori dell'utero per un periodo prolungato fino a 6 giorni.
La dissezione embrionale rapida e adeguata e la pregastrulazione della concentrazione e della pressione del gas sono i passi più critici per una crescita embrionale di successo. Per iniziare a coltivare embrioni di topo di 7,5 giorni o più avanzati, accendere il rotatore e l'unità di riscaldamento del sistema di incubatore di colture a rulli per almeno 1 ora prima delle dissezioni embrionali. Inoltre, aggiungere acqua in autoclave alla bombola di ingresso del gas e alla provetta di uscita.
Quindi, accendere il modulo regolatore del gas premendo l'interruttore principale, quindi utilizzare i rispettivi controller per impostare i valori di ossigeno e anidride carbonica al 5% Aprire il regolatore del gas e spostare l'interruttore di tensione nel trasmettitore di pressione per impostare la pressione del gas a circa 6,5-7 libbre per pollice quadrato. Confermare il valore della pressione del gas utilizzando un manometro digitale. Monitorare il flusso di gas controllando la velocità delle bolle create all'interno della provetta riempita d'acqua in uscita allocata all'interno dell'incubatore di precisione.
Impostare la corretta velocità di bolla chiudendo o aprendo la valvola di flusso del gas sul coperchio della bottiglia d'acqua. Assicurarsi che il flusso di gas consenta la formazione di bolle ad una velocità da 2 a 4 bolle al secondo o impostare il flusso di bolle nel primo punto in cui il gorgogliamento esce al tubo di uscita riempito d'acqua. Quindi, riempire le bottiglie di coltura con 2 millilitri di terreno di coltura.
Utilizzare i bungs di silicio cavi per sigillare le bottiglie e collegarle al tamburo rotante scavato per il pre-bilanciamento per 1 ora. Tenere sigillati gli spazi vuoti nel tamburo rotante utilizzando i bungs solidi. Quindi, sezionare gli embrioni da un topo femmina incinta eutanasizzato.
Pulire l'addome con etanolo al 70% e tagliare la pelle e la parete addominale usando le forbici. Individuare un'estremità dell'utero e tagliare all'intersezione tra l'ovaio e l'utero. Continuare a tagliare lungo l'utero fino all'altra estremità e trasferire in una capsula di Petri da 100 millimetri piena di DPBS.
Lavare rapidamente i conceptuses in DPBS e tagliarli a coppie per facilitare la gestione degli embrioni. Spostare tutte le coppie di conceptuse in un mezzo di dissezione pre-equilibrato in una capsula di Petri da 60 millimetri, quindi tagliare le singole conceptuses. Successivamente, usando un paio di pinze grossolane, rimuovere la parete uterina dei conceptuses strappando il tessuto uterino, quindi usando una pinza microchirurgica fine, tagliare la punta della decidua a forma di pera.
Inserire la pinza accanto all'embrione parallelamente al suo asse lungo e aprire la pinza per dividere la decidua a metà. Infine, utilizzando una pinza fine, afferrare l'embrione dalla decidua e staccare il sacco di tuorlo parietale dall'embrione, lasciando intatto il cono ectoplacentare attaccato al cilindro dell'uovo. Seleziona gli embrioni nella piastra neurale, o nella fase iniziale della piega della testa, che non mostrano danni nell'epiblasto.
Trasferire da 5 a 6 embrioni selezionati per bottiglia alle bottiglie di coltura di vetro pre-equilibrate e posizionare le bottiglie nel sistema di coltura rotante a 37 gradi Celsius, in un'atmosfera del 5% di ossigeno e del 5% di anidride carbonica. Per coltivare embrioni di pregastrulazione e gastrulazione precoce e piastre statiche, aggiungere 250 microlitri di terreno di coltura embrionale ex-utero appena preparato a ciascun pozzetto di una piastra di 8 pozzetti. Posizionare le piastre all'interno di un incubatore di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per il pre-equilibrio.
Dopo aver sezionato gli embrioni fuori dall'utero come dimostrato in precedenza, trasferire i singoli embrioni in ciascun pozzetto della piastra a 8 pozzetti utilizzando una micro pipetta e posizionare la piastra all'interno dell'incubatrice con il 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius. Immaginate gli embrioni al microscopio stereo e selezionate per la coltura solo quelli con una cavità amniotica ben formata senza danni evidenti e senza la membrana di Reichert. Le condizioni di coltura a rulli descritte in questo protocollo per embrioni di 7,5 giorni supportano una crescita embrionale costante e normale con un'efficienza media vicina al 75% dopo 4 giorni di coltura.
L'efficienza dello sviluppo embrionale varia tra i diversi background genetici dei topi, ma è costantemente robusta. L'integrazione con HBS invece di HCS produce un'efficienza di circa il 68% dopo 4 giorni di coltura. Lo sviluppo di 6,5 embrioni e placche statiche è correttamente ricapitolato con un'efficienza superiore al 90% utilizzando un terreno di coltura embrionale ex-utero con HCS e HBS.
Le colture a partire da embrioni pregastrulanti mostrano un'efficienza del 46% di sviluppo corretto fino allo stadio di somite precoce e quasi il 17% degli embrioni completa il corretto sviluppo dopo 6 giorni di coltura. La morfogenesi e lo sviluppo tissutale procedono correttamente fino a 42 somiti. I difetti rappresentativi dello sviluppo osservati negli embrioni per colture iniziate dai giorni embrionali 7.5, 6.5 e 5.5 sono mostrati qui.
Gli embrioni con danni minori all'epiblasto o gli embrioni che trattengono la membrana di Reichert devono essere scartati. Gli embrioni precoci non cresceranno correttamente o mostreranno gravi ritardi nello sviluppo, mentre l'attaccamento dell'epiblasto embrionale alla superficie della piastra causerà il fallimento di un ulteriore sviluppo embrionale. Le principali anomalie osservate negli embrioni difettosi sono lo sviluppo della regione posteriore al di fuori del sacco vitellino o difetti nella crescita delle pieghe neurali.
Nelle colture sviluppate a partire da embrioni di 5,5 giorni si osservano frequentemente un difetto di sviluppo è la presenza di un piccolo epiblasto sottosviluppato. Utilizzando questo metodo, i ricercatori sono in grado di eseguire una varietà di manipolazioni fisiche o chimiche nello sviluppo di embrioni post-impiantati. Ad esempio, manipolazione, trapianto cellulare o tracciamento del lignaggio.
Questo metodo non solo apre la strada allo studio dello sviluppo post-impianto del topo in grande dettaglio, ma anche per l'implementazione di metodi di coltura simili in embrioni di altre specie, come l'uomo.
